遠(yuǎn)俊虎，丁一娟，楊文靜，閆寶琴，柴亞茹，梅家琴，錢偉

利用TRV-HIGS技術(shù)鑒定核盤 菌致病相關(guān)的分泌蛋白基因

遠(yuǎn)俊虎，丁一娟，楊文靜，閆寶琴，柴亞茹，梅家琴，錢偉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

【】由核盤菌（）引起的菌核病是我國油菜種植上的主要問題，嚴(yán)重威脅著菜籽產(chǎn)量及品質(zhì)。分泌性蛋白在病原菌致病過程中起著重要作用，核盤菌基因組中包含大量編碼分泌性蛋白的基因，本研究旨在鑒定并篩選與致病性相關(guān)的分泌蛋白基因，揭示核盤菌的致病機(jī)理，為菌核病防控提供重要靶標(biāo)。采用SMART軟件對(duì)核盤菌在侵染抗病、感病甘藍(lán)過程中差異表達(dá)明顯的8個(gè)具有信號(hào)肽的候選基因進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析，隨后將SMART分析得到的結(jié)構(gòu)域分別于SCOP、Pfam、PDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。利用基因特異性引物進(jìn)行目的基因特異片段的PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pTRV2-Gene和pTRV2-GFP載體。隨后等量混合含有pTRV1及pTRV2-Gene，pTRV1及pTRV2-GFP載體的重懸菌液。室溫靜置3 h后，利用針筒浸潤法將pTRV2-Gene載體及對(duì)照（TRV-GFP）侵染5—6周齡的本氏煙（）。侵染植株于黑暗環(huán)境中培養(yǎng)48 h后，再置于正常光照條件的環(huán)境中生長7 d。將直徑6 mm的核盤菌PDA菌絲塊接種于侵染9 d后的煙草葉片葉腹的中央，其中帶菌面緊貼葉片，隨后將接種植株培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)病斑面積。提取接種48 h后的病斑及病斑周圍組織葉片（距腐爛組織邊緣1 cm左右）的RNA，利用特異引物進(jìn)行目的基因的qRT-PCR，計(jì)算目的基因在攜帶TRV-HIGS載體的煙草植株中的相對(duì)表達(dá)量。SMART及結(jié)構(gòu)域注釋預(yù)測(cè)這8個(gè)候選基因可能參與了蛋白、核酸或多糖的水解，影響植物的免疫反應(yīng)，參與核盤菌對(duì)藥物耐受性的調(diào)節(jié)及生物素合成。核盤菌接種攜帶這8個(gè)基因的TRV-HIGS載體及對(duì)照載體的煙草，48 h后對(duì)照植株的病斑面積平均為3.44 cm2，除外，其余7個(gè)候選基因的TRV-HIGS植株上的病斑面積相比對(duì)照植株均顯著減?。ā?.05），其病斑面積介于1.63—2.61 cm2。qRT-PCR結(jié)果顯示，這7個(gè)致病相關(guān)的候選基因在核盤菌侵染煙草過程中的基因表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照（≤0.05）。利用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)成功地對(duì)核盤菌中8個(gè)未知功能的分泌蛋白基因進(jìn)行了功能鑒定，篩選到7個(gè)可能與核盤菌致病性相關(guān)的基因，其中對(duì)核盤菌致病性影響最大的預(yù)測(cè)可能參與核盤菌生物素合成，同時(shí)及預(yù)測(cè)可能參與影響植物的免疫反應(yīng)。

核盤菌；TRV-HIGS；本氏煙；分泌蛋白；致病性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】核盤菌（）是一種寄主范圍十分廣泛的病原真菌，可以侵染包括油菜、馬鈴薯、棉花、番茄、大豆、煙草等多種重要作物在內(nèi)的400多種植物[1]，造成作物產(chǎn)量損失，且防治困難。研究表明，除了草酸等致病因子外[2]，分泌蛋白（secretory protein）在核盤菌與植物互作中也起著重要作用[3-11]，但大多數(shù)分泌蛋白在核盤菌致病方面的功能還亟待確定。利用煙草脆裂病毒（，TRV）介導(dǎo)的寄主誘導(dǎo)基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術(shù)快速挖掘核盤菌致病相關(guān)分泌蛋白基因，對(duì)明確核盤菌致病機(jī)理，進(jìn)一步安全防控菌核病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，針對(duì)核盤菌致病性的研究主要集中于草酸等致病因子[2]。分泌蛋白是一類由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體途徑分泌到細(xì)胞外，具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，且在生物體發(fā)育及防御等生理過程中起著重要作用的蛋白質(zhì)[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌的一些分泌蛋白參與了其與寄主的互作過程，如SSCP1和SsSSVP1可分別與寄主植物中的PR1和QCR8蛋白互作，促進(jìn)寄主植物細(xì)胞的死亡，從而利于核盤菌的侵染[3-4]；SSITL蛋白參與了核盤菌抑制寄主JA/ET信號(hào)途徑介導(dǎo)的局部和系統(tǒng)性抗病反應(yīng)[5]。另外有研究表明一些分泌蛋白可能參與了核盤菌的生長發(fā)育過程，比如SsCVNH在核盤菌菌核發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6]，Ss-Rhs1和Ss-Caf1則參與了核盤菌復(fù)合侵染墊的形成[7-8]。DERBYSHIRe等分別通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)到核盤菌中存在78個(gè)和70個(gè)候選分泌蛋白[9-10]；Ding等[11]利用RNA-seq鑒定到在核盤菌侵染寄主過程中有93個(gè)含有信號(hào)肽的差異表達(dá)基因。這些研究表明核盤菌基因組中存在大量編碼分泌性效應(yīng)蛋白的基因，但是它們是否都參與核盤菌致病性的生物學(xué)功能仍不清楚。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是揭示生物體基因功能的一種反向遺傳學(xué)研究手段。早期有學(xué)者分別利用攜帶特定基因片段的不同病毒載體侵染本氏煙（），導(dǎo)致特定靶基因的沉默[13]，從而建立了病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)。由于VIGS技術(shù)操作簡便，周期性短，能在當(dāng)代快速獲取表型，繼而對(duì)基因功能進(jìn)行分析[14]，故該技術(shù)在植物基因功能研究中展示出廣闊的應(yīng)用前景[15]。目前常用的病毒載體有PVXB[16]、PGMV[17]、TRV[18]及BSMV[19]等。其中TRV載體與其他病毒載體相比具有誘導(dǎo)基因沉默效率高，持久性長，對(duì)宿主不會(huì)造成明顯傷害等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用[20]。HIGS技術(shù)是在VIGS技術(shù)上發(fā)展而來的，它通過將含有病原物目的基因片段的反義發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)染到寄主植物中，產(chǎn)生病原物特定序列的雙鏈RNA（dsRNA），經(jīng)過植物體加工后產(chǎn)生siRNA，從而在病原菌侵染過程中沉默病原菌特定基因[21]。近年來，HIGS技術(shù)在植物-病原菌互作研究中已被大量應(yīng)用，并且成功獲得了一系列抗性增強(qiáng)的寄主材料[22-23]。由于病毒載體介導(dǎo)的基因瞬時(shí)沉默技術(shù)周期短，體系成熟，因此多數(shù)研究將VIGS與HIGS技術(shù)結(jié)合起來，利用病毒介導(dǎo)的HIGS技術(shù)來快速鑒定病原菌致病基因的功能[24]。Qi等[22]首先利用BSMV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)，在大麥中瞬時(shí)表達(dá)BSMV-PsCPK1，初步確定了在增強(qiáng)大麥條銹病抗性中的作用，隨后利用HIGS技術(shù)獲得持久穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因大麥株系；Xu等[23]利用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)在棉花中成功鑒定了黃萎病G蛋白信號(hào)基因的功能；Andrade等[25]在煙草中表達(dá)了核盤菌幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA，獲得了菌核病抗性增強(qiáng)的T1代轉(zhuǎn)基因煙草，證實(shí)了HIGS技術(shù)在核盤菌基因功能研究中的可行性。因此，利用病毒介導(dǎo)的HIGS技術(shù)可以作為鑒定核盤菌致病基因功能的有效手段?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究中鑒定到核盤菌在侵染過程中有93個(gè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的差異表達(dá)基因，但其中大多數(shù)基因的功能還不清楚[11]。因此，本研究采用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)對(duì)其中8個(gè)未知功能基因進(jìn)行功能鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)靶向8個(gè)未知功能的核盤菌基因的siRNA，通過菌核病抗性評(píng)價(jià)及基因表達(dá)量分析，篩選與核盤菌致病性相關(guān)的候選基因，探究利用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)快速鑒定核盤菌致病相關(guān)基因的可行性，為進(jìn)一步解析核盤菌的致病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年11月至2019年5月在西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院油菜資源研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

供試本氏煙、核盤菌野生菌株1980、pTRV1及pTRV2等相關(guān)載體均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心提供。大腸桿菌（）DH5、農(nóng)桿菌（）GV3101等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（TransGen Biotech）。

本氏煙培養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中，參數(shù)設(shè)定為28℃，18 h光照，光照強(qiáng)度8 000 lx；20℃，6 h黑暗。

1.2 候選基因序列分析

前期對(duì)核盤菌侵染甘藍(lán)葉片和莖稈過程中的差異基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在侵染莖稈過程中有93個(gè)具有分泌信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的核盤菌差異表達(dá)基因[11]。選擇其中8個(gè)在感病甘藍(lán)的葉片及莖稈中表達(dá)量都顯著高于抗病甘藍(lán)的基因作為候選基因，并在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=）下載它們的蛋白序列，利用SMART軟件（http://smart.embl- heidelberg.de/）進(jìn)行基因編碼多肽的序列結(jié)構(gòu)分析。隨后將SMART分析得到的結(jié)構(gòu)域分別在Pfam（http://pfam.xfam.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）以及SCOP（http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋。

1.3 TRV-HIGS載體的構(gòu)建

從核盤菌基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.broadinstitute. org/annotation/genome/sclerotinia_sclerotiorum/MultiDownloads.html）中下載8個(gè)核盤菌候選基因的編碼序列，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異引物，并加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)（引物信息見表1）。以核盤菌野生型菌株1980不同生長階段的混合cDNA為模板，用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段膠回收后連接到pGEMT-Easy載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5。挑選陽性單克隆送Invitrogen公司測(cè)序，培養(yǎng)測(cè)序正確的克隆（菌株）提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶組合RI/I分別對(duì)陽性克隆質(zhì)粒和pTRV2進(jìn)行雙酶切，將目的片段與骨架進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行菌落PCR，選取陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取pTRV2-Gene載體的質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，挑選陽性單克隆的菌液加入50%的甘油1﹕1等體積混合于2 ml離心管中，保存于-80℃。利用相同方法成功構(gòu)建了對(duì)照重組質(zhì)粒pTRV2-GFP。

1.4 TRV-HIGS載體侵染煙草

煙草侵染參照Liu等[26]的方法進(jìn)行。分別活化pTRV1、pTRV2-Gene及pTRV2-GFP，挑取單克隆預(yù)培養(yǎng)后，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD=0.8左右。隨后5 000 r/min離心15 min，棄上清，收集菌體后用重懸液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150mmol·L-1AS）重懸至OD=0.8—1.6。等量混合pTRV1及pTRV2-Gene，pTRV1及pTRV2-GFP，室溫靜置3 h后，用針筒浸潤法對(duì)5—6周齡的煙草進(jìn)行侵染。暗培養(yǎng)48 h后，在正常光照條件下培養(yǎng)7 d。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)侵染3株煙草。

1.5 菌核病抗性鑒定

在馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）平板上活化核盤菌野生型菌株1980，用直徑6 mm的打孔器取生長2 d的邊緣菌絲用于接種。在TRV-HIGS載體侵染煙草9 d后，將直徑6 mm的核盤菌PDA菌絲塊接種于侵染后的煙草葉片左右葉腹的中央，帶菌面緊貼葉片。接種后，將接種植株置于可控溫控濕房間內(nèi)，其中溫度設(shè)置為22℃，相對(duì)濕度保持在85%左右。接種48 h后統(tǒng)計(jì)病斑的長徑和短徑，利用公式S =π×a×b/4計(jì)算病斑面積（其中a代表病斑長軸長度，b代表病斑短軸長度），并利用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 本試驗(yàn)所用引物信息

序列中斜體及下劃線處字母代表相應(yīng)的酶切位點(diǎn)The italicized and underlined letters represent the cleavage sites in the sequence

1.6 候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

取接種48 h后的病斑及病斑周圍組織葉片（距腐爛組織邊緣1 cm左右），采用TRIzol?試劑分離提取總RNA，采用Bio RAD的iScriptTMcDNA Synthesis Kit試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Bio-Rad的iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix試劑盒，利用CFX96TMreal-time PCR儀進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法[27]計(jì)算目的基因表達(dá)量。每個(gè)基因的qRT-PCR引物信息見表1，其中內(nèi)參基因?yàn)楹吮P菌基因（）。

2 結(jié)果

2.1 候選基因表達(dá)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖1為8個(gè)候選基因在侵染感病、抗病甘藍(lán)葉片上的表達(dá)熱圖。為了進(jìn)一步了解這8個(gè)候選基因的功能，分析了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。SMART分析顯示，這8個(gè)具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的候選基因具有不同類型的SCOP功能域，其中有4個(gè)候選基因（、、和）具有不同類型的PDB功能域，此外有4個(gè)基因具有不同類型Pfam功能域，其中具有Glyco_hydro_7結(jié)構(gòu)域，具有ASP結(jié)構(gòu)域，具有NPP1結(jié)構(gòu)域，具有Pro-kuma_activ結(jié)構(gòu)域。則包含重復(fù)結(jié)構(gòu)域（表2）。將SMART分析得到的候選基因的結(jié)構(gòu)域分別在Pfam、PDB以及SCOP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了功能注釋，隨后對(duì)這8個(gè)候選可能參與的功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)?？赡軈⑴c核盤菌對(duì)藥物耐受性的調(diào)節(jié)，可能參與多糖的水解，可能參與蛋白的水解，可能參與誘導(dǎo)植物的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）引發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）或物質(zhì)的異構(gòu)化過程，可能參與生物素合成，可能參與核酸分子磷酸基團(tuán)的水解，可能參與壞死誘導(dǎo)蛋白或毒素的產(chǎn)生從而誘導(dǎo)植物的效應(yīng)蛋白所引發(fā)的免疫反應(yīng)（effector-triggered immunity，ETI），可能參與肽鏈或蛋白質(zhì)的水解過程（表2）。

核盤菌候選基因在接種抗、感甘藍(lán)莖稈（A）0、12、24 h和葉片（B） 0、6、12 h后的表達(dá)量Relative expression levels of candidate genes in the susceptible and resistant B. oleracea after inoculation with S. sclerotiorum in stem (A) post 0, 12, 24 h and leaf (B) post 0, 6, 12 h。Rs：抗病甘藍(lán)材料的莖稈resistant B. oleracea stem；Ss：感病甘藍(lán)材料的莖稈susceptible B. oleracea stem；Rl：抗病甘藍(lán)材料的葉片resistant B. oleracea leaf；Sl：感病甘藍(lán)材料的葉片susceptible B. oleracea leaf。以lg (FPKM+1)值繪制基因表達(dá)量的熱圖，紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因。顏色從紅到藍(lán)，表示lg (FPKM+1)從大到小?；虮磉_(dá)熱圖構(gòu)建方法見文獻(xiàn)[11] The lg (FPKM+1) value was used for the heatmap. Red indicated high expression genes and blue indicated low expression genes. The colors ranged from red to blue, indicating that lg (FPKM+1) from large to small. The heatmap was conducted according to reference [11]

表2 候選基因的結(jié)構(gòu)域功能分析

2.2 TRV-HIGS載體構(gòu)建及侵染

擴(kuò)增8個(gè)基因的片段，克隆入載體pTRV2，并利用RI/I對(duì)pTRV2-gene進(jìn)行酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示在8個(gè)pTRV2-Gene質(zhì)粒的泳道均能檢測(cè)到目的條帶大小的片段（圖2），表明成功構(gòu)建了8個(gè)基因的TRV-HIGS載體。利用相同方法克隆GFP（綠色熒光蛋白）片段，并成功構(gòu)建了陽性對(duì)照載體pTRV2-GFP。

分別將pTRV1、pTRV2-GFP及pTRV2-Gene的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 GV3101后，侵染5—6周齡的煙草。提取侵染9 d后攜帶TRV-Gene重組質(zhì)粒的煙草植株葉片的DNA，利用表1中的引物進(jìn)行目的片段的PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，侵染煙草葉片部位均能檢測(cè)到相應(yīng)大小的目的基因片段（圖3-A）。同時(shí)將侵染9 d后的攜帶TRV-GFP載體的煙草植株葉片進(jìn)行熒光信號(hào)觀察，發(fā)現(xiàn)葉片組織存在綠色熒光信號(hào)（圖3-C），而侵染不含重組質(zhì)粒的重懸液的煙草沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)（圖3-B）。

M: Marker; 1: SS1G_00263; 2:SS1G_04945; 3:SS1G_03181; 4: SS1G_04343; 5: SS1G_03146; 6: SS1G_02250; 7: SS1G_11912; 8: SS1G_07655

A：注射含有TRV-Gene重組質(zhì)粒9 d后的煙草植株的PCR鑒定The identification of N. benthamiana at 9 days post TRV-Gene inoculation. M: Marker; 1: SS1G_00263; 2: SS1G_04945; 3: SS1G_03181; 4: SS1G_04343; 5: SS1G_03146; 6: SS1G_02250; 7: SS1G_11912; 8: SS1G_07655；B：注射不含重組質(zhì)粒的重懸液9 d后的煙草植株的GFP信號(hào)觀察GFP signal observation of N. benthamiana at 9 days after suspension without recombinant vectors inoculation；C：注射TRV-GFP載體9 d后的煙草植株的GFP信號(hào)觀察GFP signal observation of N. benthamiana at 9 days post TRV-GFP inoculation。標(biāo)尺Bar = 30 μm

2.3 目的基因的表達(dá)分析

核盤菌接種TRV-HIGS煙草植株48 h后，提取病斑及周圍組織RNA，進(jìn)行目的基因的qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，與對(duì)照植株中的目的基因表達(dá)量相比，在TRV-HIGS煙草植株上基因表達(dá)水平與對(duì)照差異不顯著（＞0.05），其余7個(gè)基因在所對(duì)應(yīng)的TRV-HIGS煙草植株上的基因表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照（≤0.05），基因表達(dá)水平較對(duì)照相比下降了26.0%—89.3%（圖4）。

*：差異顯著significant difference (P≤0.05)；ns：差異不顯著no significant difference (P＞0.05)

2.4 TRV-HIGS煙草植株的菌核病抗性

為了分析這8個(gè)基因?qū)吮P菌致病性的影響，在農(nóng)桿菌侵染煙草9 d后進(jìn)行核盤菌活體接種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接種48 h后，除的TRV-HIGS煙草植株的病斑面積與對(duì)照差異不顯著外（＞0.05），其余7個(gè)基因所對(duì)應(yīng)的TRV-HIGS煙草植株的病斑面積相比對(duì)照植株均顯著減?。ā?.05）（圖5-A、5-B）。其中對(duì)照TRV-GFP植株的平均病斑面積為3.44 cm2，而攜帶7個(gè)有差異基因的煙草植株的病斑面積介于1.63—2.61 cm2，的TRV-HIGS煙草植株上的平均病斑面積最小（圖5-B）。

TRV-HIGS轉(zhuǎn)基因煙草活體接種核盤菌48 h后的發(fā)病情況（A）及病斑大小統(tǒng)計(jì)（B），柱上不同字母表示差異顯著（P≤0.05）Phenotypes (A) and lesion sizes (B) of TRV-HIGS N. benthamiana at 48 hours post inoculation with S. sclerotiorumin vivo. Different letters on the columns indicate significant difference (P≤0.05)

3 討論

目前基于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）原理研究寄主-病原菌互作主要集中于兩個(gè)方面，一方面是利用VIGS等技術(shù)篩選寄主的抗病基因。VIGS是指利用重組病毒載體沉默植物內(nèi)源基因的技術(shù)[14]，目前利用該技術(shù)已經(jīng)成功挖掘出了一系列植物抗病基因[15,28-30]。在植物抗菌核病研究中，也有研究者利用VIGS技術(shù)在煙草及番茄中篩選到了抗菌核病基因，如[29]、[30]、[30]等；另一方面利用HIGS等技術(shù)鑒定病原菌致病基因。HIGS是通過寄主植物作為媒介間接沉默病原菌內(nèi)源基因的技術(shù)，主要用于創(chuàng)制抗性材料和病原菌致病基因的功能鑒定兩個(gè)方面[18-19]。由于病毒載體介導(dǎo)的HIGS技術(shù)具有快速、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而在鑒定病原菌致病基因的研究中得到越來越多的應(yīng)用[19,22,24]。其中，BSMV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)在小麥條銹病、葉銹病等病原菌未知功能基因的鑒定中發(fā)揮著巨大作用[19,22]。本研究利用TRV載體，以GFP基因作為對(duì)照，采用農(nóng)桿菌注射的方法在煙草上建立了利用TRV介導(dǎo)的HIGS鑒定核盤菌致病相關(guān)基因的技術(shù)體系。菌核病抗性鑒定結(jié)果顯示7個(gè)攜帶候選基因的煙草植株的病斑面積與對(duì)照相比顯著減小，表現(xiàn)為煙草的抗病性增強(qiáng)。qRT-PCR結(jié)果顯示在侵染TRV-HIGS煙草植株過程中，核盤菌這7個(gè)候選基因的表達(dá)被顯著抑制。研究結(jié)果證實(shí)了TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)可以用于快速篩選核盤菌致病相關(guān)基因。

分泌蛋白是核盤菌致病的關(guān)鍵“武器”之一[31]。目前針對(duì)分泌蛋白的研究主要集中在兩個(gè)方面：一方面分泌蛋白與核盤菌自身菌核、附著胞結(jié)構(gòu)形成相關(guān)[6-8]；另一方面分泌蛋白可參與抑制宿主植物的抗病反應(yīng)，誘導(dǎo)宿主植物細(xì)胞性壞死[5]。因此挖掘核盤菌致病相關(guān)的分泌蛋白對(duì)于解析核盤菌致病機(jī)理十分重要。本研究中，通過蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)到可能參與生物素合成。生物素為生物體內(nèi)關(guān)鍵酶發(fā)揮作用所必需的輔因子，有研究顯示鴨疫里默氏桿菌（）生物素突變菌株的致病力及生長速度較野生型菌株顯著減弱[32]。本研究結(jié)果顯示攜帶的TRV-HIGS煙草植株病斑面積減少到對(duì)照的47.4%。結(jié)合這些研究，推測(cè)生物素可能是核盤菌致病力的重要因子。此外，本研究預(yù)測(cè)到具有GntR家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。HAYDON等[33]研究表明，GntR家族成員能夠利用其保守結(jié)構(gòu)域通過變構(gòu)效應(yīng)與代謝產(chǎn)物結(jié)合來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；曾潔[34]證明了重組恥垢分枝桿菌（）對(duì)抗生素萬古霉素非常耐受。本研究中發(fā)現(xiàn)的沉默顯著影響了核盤菌的致病性，因而推測(cè)編碼的分泌蛋白在侵染過程中可能參與了核盤菌對(duì)藥物或植物抗菌物質(zhì)等的調(diào)節(jié)過程。

植物的免疫系統(tǒng)可分為兩道防線[35]：第一道防線是病原相關(guān)分子模式引發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）；第二道防線是病原菌產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白所引發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI）。有研究證實(shí)是核盤菌編碼的一個(gè)可以被植物識(shí)別的保守PAMP[4]，而病原菌侵染過程需要多種PAMP協(xié)同作用。在本研究中，預(yù)測(cè)到具有翻譯延伸因子的保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)驗(yàn)證了其與核盤菌致病力相關(guān)。Kunze等[36]利用細(xì)菌的翻譯延伸因子EF-Tu 的保守肽段elf18處理植物后能引起植物產(chǎn)生PTI反應(yīng)。根據(jù)這些研究，推測(cè)可能是與核盤菌致病力相關(guān)的一種PAMP，是提高宿主菌核病抗性的關(guān)鍵因子。此外，預(yù)測(cè)可能編碼壞死誘導(dǎo)蛋白和毒素，壞死誘導(dǎo)蛋白能夠觸發(fā)植物體的ETI反應(yīng)，誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)，引起植物細(xì)胞死亡[35]。菌核病抗性鑒定結(jié)果也證實(shí)參與影響了核盤菌的致病性，故推測(cè)通過影響植物的ETI反應(yīng)，從而參與核盤菌的致病過程。

除了參與物質(zhì)合成及藥物耐受性調(diào)節(jié)、植物免疫反應(yīng)相關(guān)外，這7個(gè)與核盤菌致病力相關(guān)的候選基因中還有部分參與編碼水解酶類，主要包括酸性蛋白酶（、）和細(xì)胞壁降解酶（）。后續(xù)將利用基因敲除、超表達(dá)等技術(shù)獲得核盤菌轉(zhuǎn)化子來深入解析這7個(gè)基因的功能，以期拓寬目前對(duì)分泌蛋白功能的認(rèn)知，進(jìn)一步解析核盤菌的致病機(jī)理。同時(shí)，這些致病相關(guān)的基因?qū)橄乱徊嚼肏IGS技術(shù)創(chuàng)制持久穩(wěn)定的高抗菌核病油菜材料提供重要靶標(biāo)。

4 結(jié)論

利用TRV介導(dǎo)的HIGS技術(shù)成功篩選到了7個(gè)與核盤菌致病性相關(guān)的編碼分泌蛋白的基因，其中對(duì)核盤菌致病性影響最大。此外，預(yù)測(cè)可能參與核盤菌生物素合成，及可能參與影響植物的免疫反應(yīng)。

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Identification of genes encoding secretory proteins related to the pathogenicity ofusing TRV-HIGS

YUAN JunHu, DING YiJuan, YANG WenJing, YAN BaoQin, CHAI YaRu, MEI JiaQin, QIAN Wei

(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715)

【】Sclerotinia stem rot (SSR) caused byis the main problem in rapeseed planting in China, which causes serious yield and quality loss. Secretory proteins play an important role in the pathogenesis of pathogens. The genome ofcontains a large number of genes encoding secretory proteins. The objective of this study is toidentify and screen the secretory protein genes related to pathogenicity, reveal the pathogenic mechanism of, and to provide an important target for the prevention and control of SSR. 【】SMART software was used to analyze the protein domains of 8 candidate genes with signal peptides that were differentially expressed in the process ofinfecting the susceptible and resistantlines, then the domains obtained by SMART analysis were annotated in SCOP, Pfam and PDB databases. The fragment with the length of around 300 bp in the encoding region of these genes was cloned into pTRV2 vector together with the GFP fragment. The suspension of pTRV1 was mixed equally with pTRV2-Gene and pTRV2-GFP, respectively. After 3 hours at room temperature, pTRV2-Gene vector and control (pTRV2-GFP) were transformed into 5-6 week-old leaves ofusing syringe infiltration method. Subsequently, the infiltrated plants were cultured in dark for 48 hours and then grown in the normal light for 7 days.PDA mycelium blocks ofwith a diameter of 6 mm were used to inoculate the infiltrated leaves of tobacco at the 9th day after transformation, in which the carrying surface was close to the leaves. After 48 hours of inoculation, the lesion size was measured and RNA from necrotic and infected tissues (around 1 cm from the edge of necrotic tissue) was extracted. qRT-PCR analysis was carried out to estimate the relative expression of target gene inlines carrying TRV-HIGS vector. 【】The putative functions of these 8 genes predicated with SMART and domain annotation were involved in the hydrolysis of proteins, nucleic acids or polysaccharides, the immunity response of host plants, and the tolerance to drugs and biotin synthesis of.The average lesion area of control carrying TRV-GFP was 3.44 cm2at 48 hours post inoculation of. Except for one line (), the lesion area of other 7 lines carrying TRV-HIGS vector was significantly lower than that of the control plants (≤0.05), ranging from 1.63 to 2.61 cm2. qRT-PCR analysis showed that the gene expression level of these 7 genesin the TRV-HIGS lines was significantly lower than that of the control (≤0.05). 【】Eight secretory protein genes with unknown function inwere successfully identified by TRV-HIGS technique. Seven genes related to the pathogenicity ofwere screened out. Among them,with the strongest effect on the pathogenicityofmay be involved in the synthesis of biotin, andandmay be involved in the immune response of host.

; TRV-HIGS;; secretory protein; pathogenicity; qRT-PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.008

2019-05-28；

2019-08-14

國家自然科學(xué)基金（31801395，31971978）、中國博士后科學(xué)基金（2018M633305）、西南大學(xué)本科生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（X201910635284）、西南大學(xué)神農(nóng)班創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目

遠(yuǎn)俊虎，E-mail：jhyuan1998@163.com。丁一娟，E-mail：dding1989@163.com。遠(yuǎn)俊虎和丁一娟為同等貢獻(xiàn)作者。

錢偉，E-mail：qianwei666@hotmail.com

（責(zé)任編輯 岳梅）