楊志遠，段會娟，王小蕾，劉立新，趙際成，潘潔，劉月煥，林健

4株鴨坦布蘇病毒的毒力、E基因序列和抗原差異性

楊志遠，段會娟，王小蕾，劉立新，趙際成，潘潔，劉月煥，林健

（北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

【】比較鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus, DTMUV）分離株的毒力、分析E蛋白基因序列、研究抗原差異性，為鴨坦布蘇病防控提供依據(jù)。【】將DTMUV-HB(2011)、DTMUV-AH(2014)、DTMUV-GX1(2012)、DTMUV-GX2(2015) 4株病毒接種10日齡易感鴨胚進行增殖，并利用6日齡SPF雞胚測定ELD50。根據(jù)測定的病毒含量，將分離毒株稀釋為100ELD50/0.5mL，人工感染40只180日齡健康北京鴨，進行臨床癥狀觀察、病毒分離、大體剖檢，分析分離毒株的毒力有無差異。提取8株DTMUV分離病毒株的RNA，通過RT-PCR擴增E基因，分析比較不同地區(qū)的DTMUV的E基因核苷酸和氨基酸序列相似性，構(gòu)建進化樹。利用實驗室建立的鴨坦布蘇病毒血凝抑制試驗分別測定4株病毒陽性血清對4株病毒的HI效價。同時采用固定病毒稀釋血清法，利用C6/36細胞測定4株病毒陽性血清對4株DTMUV的血清中和效價。通過交叉血凝抑制試驗和血清交叉中和試驗比較4株病毒的抗原差異性（R值）。【】(1)各毒株的病毒含量范圍在104.7—105.3ELD50/0.1mL。人工感染鴨試驗，攻毒后3 d鴨采食量和產(chǎn)蛋量均顯著下降，各組病毒分離陽性率均在85%以上，剖檢病變主要表現(xiàn)為卵泡變形、出血。(2)分離株序列分析結(jié)果表明，核苷酸序列相似性為95.7%—100%，推導氨基酸序列相似性在98.2%以上。遺傳進化分析表明共同構(gòu)成了一個進化分支。(3)4株病毒及其陽性血清進行血凝抑制交叉試驗，計算的抗原性差異R值在0.79—1.12之間；進行細胞中和交叉試驗，計算的R值在0.79—1.20之間?！尽糠蛛x的4株DTMUV在毒力、E蛋白基因和抗原性上未見顯著差異。

鴨坦布蘇病毒；毒力；E基因；抗原性

0 引言

【研究意義】鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus, DTMUV）屬于黃病毒科黃病毒屬，2010年春季開始在浙江、江蘇、山東、河北和北京等地區(qū)暴發(fā)，以鴨產(chǎn)蛋量下降為主要臨床特征[1-3]。疫病暴發(fā)初期，研究人員根據(jù)臨床癥狀和主要病理變化，曾將該病命名為鴨出血性卵巢炎[4]、類減蛋綜合征[5]和鴨病毒性腦炎[6]，2011年首屆“水禽疫病防控研討會”將該病統(tǒng)一命名為“鴨坦布蘇病毒病”[7]。北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨、麻鴨、康貝爾鴨和鵝等禽類均可發(fā)病[8]，目前已成為養(yǎng)鴨生產(chǎn)中的一種地方流行性疫病，幾乎每年都會給養(yǎng)鴨業(yè)造成明顯的經(jīng)濟損失。開展鴨坦布蘇病毒的流行情況調(diào)查和遺傳變異分析，可為該病的有效防控提供科學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】Tembusu病毒首次于1968年在馬來西亞Sarawak地區(qū)的蚊子體內(nèi)分離到[9]，隨后分別于1982和1992年在泰國北部日本腦炎流行地區(qū)的蚊子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[10-11]。2000年，有研究報道一種與Tembusu病毒核酸的同源性為92%的Sitiawan病毒，感染雞后能夠引起雞生長發(fā)育受阻[12]。引起我國鴨群發(fā)病的坦布蘇病毒與Bagaza病毒的核酸高度同源[13]。萬春和等在鴨坦布蘇病毒病滅活疫苗、活疫苗和活載體疫苗研制方面做了大量的研究工作，試驗結(jié)果均表明疫苗有效[14-21]。在使用疫苗的選擇壓力下，鴨坦布蘇病毒的遺傳變異情況如何，目前已有多名研究人員對流行的鴨坦布蘇病毒株主要進行了E基因的序列分析[22-26]，因為囊膜蛋白（E蛋白）是黃病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白和主要的包膜蛋白，是宿主抗感染免疫的重要保護性抗原[27]。結(jié)果表明，各分離株之間沒有顯著性差異，但沒有直接數(shù)據(jù)表明抗原性有無差異?！颈狙芯壳腥朦c】自2010年鴨坦布蘇病毒病暴發(fā)以來，雖然曾一度呈現(xiàn)零星散發(fā)，但從2012年起該病在我國主要養(yǎng)鴨地區(qū)再次大面積流行[28]。該病流行期間，病毒的生物學特性、基因序列和抗原性是否發(fā)生變異，尚未見有系統(tǒng)的研究報道。為了回答這些問題，我們利用2010至2016年間分離自山東、河北、廣西、安徽、河南等不同地區(qū)的DTMUV開展了毒力、E蛋白基因和抗原差異性的比較研究，為DTMUV分子流行病學的研究提供參考信息，為該病的防控和疫苗的研制奠定理論基礎。【擬解決的關鍵問題】鴨坦布蘇病毒的毒力是否發(fā)生了變化，抗原性是否改變。

1 材料與方法

本試驗于2015年2月至2017年8月在北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株 DTMUV-SD株（2010）、DTMUV-HB株（2011）、DTMUV-GX1株（2012）、DTMUV-BJ株（2013）、DTMUV-AH株（2014）、DTMUV-GX2株（2015）、DTMUV-HN株（2015）、DTMUV-AX株（2016）由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病研究室分離鑒定、保存。

1.1.2 實驗動物 180日齡健康DTMUV抗體陰性北京鴨和10日齡易感鴨胚，購自北京南口北京鴨育種中心，試驗鴨及種鴨群未經(jīng)DTMUV疫苗免疫且無DTMUV疫病流行史；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司。

1.1.3 細胞 C6/36細胞，123代，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學），北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病研究室增殖擴繁。

1.1.4 試劑 0.5%乳漢液、0.33%鵝紅細胞懸液等，均由北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物疫病研究室配制；MEM培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS），購自Life Technology公司；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0、均購自Takara公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病毒的增殖及雞胚半數(shù)致死量（ELD50）的測定 將DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒用無菌0.5%乳漢液1﹕200倍稀釋。將稀釋的毒種經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡易感鴨胚，每胚0.1 mL，置36—37℃孵育，收獲尿囊液。-70℃保存?zhèn)溆谩?株病毒尿囊液分別用無菌0.5%乳漢液作10倍系列稀釋至10-6，每個稀釋度經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1 mL，置36—37℃孵育，觀察和記錄接種后24—168 h死亡雞胚，采用K?rber法計算ELD50。

1.2.2 人工感染鴨試驗及病毒陽性血清的制備 共40只180日齡健康北京鴨，經(jīng)檢測DTMUV抗體呈陰性，隨機分成5組，每組8只，1組健康對照，肌肉注射PBS 0.5 mL/只，其余4組各用1株試驗用毒株進行人工感染，胸部肌肉接種病毒液0.5 mL/只（含100個ELD50），觀察臨床癥狀；攻毒后2 d采血分離血清，按照文獻[29]進行病毒分離；攻毒后8 d每組隨機取5只進行剖檢，觀察病理變化。剩余試驗鴨在攻毒后14 d，使用相同劑量和相同毒株再次接種加強免疫，接種后15 d采血，分離血清，分別制備成相應毒株的陽性血清，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 分離毒株E基因分析 利用TaKaRa MiniBESTViral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取7株分離病毒株尿囊液病毒RNA，參照GenBank已發(fā)布DTMUV的E基因序列設計一對引物，引物序列為DTMUV-EF：5′-ttcagctgtctggggatgc-3′，DTMUV-ER：5′-cggcattgacatttactgcc-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通過TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0進行RT-PCR擴增，目的片段大小為1 506 bp，PCR產(chǎn)物送測序后應用DNAstar ( Version 5. 07) 分析軟件比較不同時間不同地區(qū)的鴨坦布蘇病毒E蛋白的核苷酸和氨基酸序列相似性，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4 分離毒株交叉血凝抑制試驗 參照文獻[30]，將DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV- GX2 4株病毒接種C6/36細胞后，獲得了對0.33%鵝紅細胞的血凝特性，利用實驗室建立的鴨坦布蘇病毒血凝抑制試驗操作方法，分別測定了4株病毒陽性血清對4株病毒的HI效價。

1.2.5 分離毒株細胞交叉中和試驗 將C6/36細胞接種96孔微量細胞培養(yǎng)板，利用C6/36細胞進行DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV- GX2 4株病毒株的TCID50測定，將毒種用MEM培養(yǎng)基作10倍系列稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度，每個稀釋度分別接種5孔，每孔100 μL，置28.5℃作用2 h，然后棄去上清液，加入含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液100 μL，28.5℃培養(yǎng)120 h。每孔取25 μL上清液測定對0.33%鵝紅細胞的血凝性，以75%以上的凝集判為HA陽性。記錄接種孔中HA陽性的孔數(shù)，采用Reed-Muench法計算。根據(jù)4株病毒的病毒含量，采用固定病毒稀釋血清法，將4種免疫陽性血清56℃滅活30 min，作2-1—2-6稀釋，分別與等量的含200個TCID50的4株病毒液進行交叉混合，37℃作用1 h后，接種于96孔C6/36單層細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個稀釋度接種5孔，28℃作用2 h，棄去，加入含2%胎牛血清的維持液100 μL。同時設置含100個TCID50、1個TCID50和0.1個TCID50的病毒對照，空白細胞對照，血清對照，繼續(xù)培養(yǎng)120 h，測定每孔對0.33%鵝紅細胞的血凝性，以75%以上的凝集判為HA陽性，按照Reed-Muench公式計算血清中和效價。

如果R=1，表明2株間抗原相同；如果0.67≤R≤1.5，表明2株間抗原性無明顯差異；如果0.5≤R＜0.67，表明2毒株間抗原性有小的差異；如果R＜0.5，表明2毒株間抗原性有明顯差異；R值越小，抗原性差異越大。

2 結(jié)果

2.1 病毒增殖與ELD50的測定

DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒株接種鴨胚后均在48—72 h內(nèi)死亡，死亡鴨胚發(fā)育矮小，收獲的尿囊液透明清亮。4株分離毒株測定的病毒含量分別為104.9、104.7、104.9和105.3ELD50/0.1mL。

2.2 DTMUV分離株對北京鴨的毒力

DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒以相同攻毒劑量（含100個ELD50）人工感染試驗鴨3 d后，攻毒鴨臨床上均出現(xiàn)采食量下降、一過性精神沉郁、體重減輕、拉綠色稀便等癥狀，健康對照鴨精神狀態(tài)良好，未見明顯異常。攻毒后2 d，4株病毒攻毒鴨的病毒分離陽性率均在85%以上，健康對照鴨未分離到病毒，結(jié)果見表1。攻毒后8 d，剖檢攻毒鴨均出現(xiàn)明顯的卵巢或輸卵管萎縮、出血、變形等病變，健康對照鴨未見明顯異常。除剖檢鴨外，剩余試驗鴨均存活。結(jié)果表明，4株試驗用DTMUV對北京鴨的毒力沒有明顯差異。

表1 DTMUV人工感染北京鴨試驗

“A”表示病毒分離結(jié)果陽性鴨數(shù)，“B”表示檢測鴨數(shù)，“/”表示未做

“A” The number of ducks that were positive in virus isolation; “B” The number of ducks in the group; “/” Not done

2.3 DTMUV分離株E基因分析

提取DTMUV-SD、DTMUV-HB、DTMUV-GX1、DTMUV-BJ、DTMUV-AH、DTMUV-GX2、DTMUV- HN、DTMUV-AX等8株病毒核酸，并進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均看到約1 500 bp大小的目的片段，結(jié)果如圖1。送Takara測序與國內(nèi)其他DTMUV比較后發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列相似性為95.7%—100%，推導氨基酸序列相似性在98.2%以上。遺傳進化分析表明，7株DTMUV與近幾年登錄在GenBank的鴨坦布蘇病毒在系統(tǒng)進化上共同構(gòu)成了一個進化分支，圖2表明目前在我國鴨群中流行的DTMUV的E基因未出現(xiàn)明顯的遺傳變異。

M: DL2000 Marker; 1: DTMUV-SD; 2: DTMUV-HB; 3: DTMUV-GX1; 4: DTMUV-BJ; 5: DTMUV-AH; 6: DTMUV-GX2; 7: DTMUV-HN; 8: DTMUV-AX; 9: Negative control

2.4 DTMUV分離毒株交叉血凝抑制試驗

分別測定4種病毒株陽性血清對4株DTMUV抗原的交叉HI效價，每種病毒陽性血清有3份，取幾何平均值，結(jié)果見表2。按照抗原相關系數(shù)R值的計算方法計算4毒株間的抗原性差異，詳見表3。4毒株間的HI抗原性差異R值在0.79—1.12之間，表明沒有明顯的抗原性差異。

2.5 DTMUV分離毒株細胞交叉中和試驗

2.5.1 TCID50測定結(jié)果 DTMUV-HB、DTMUV-AH、DTMUV-GX1、DTMUV-GX2 4株病毒的TCID50測定結(jié)果分別為10-3.8/0.1mL、10-3.8/0.1mL、10-3.8/0.1mL、10-4.5/0.1mL。

2.5.2 細胞交叉中和試驗 不同毒株與陽性血清作用1 h后，接種細胞，培養(yǎng)168 h，觀察記錄細胞病變（通過測定HA效價進行最終判定），計算陽性血清對不同毒株的中和效價，結(jié)果見表4和圖3。每種病毒陽性血清有3份，取幾何平均值，按照抗原相關系數(shù)R值的計算方法計算4毒株間的抗原性差異，詳見表3。結(jié)果表明，R值在0.79—1.20之間，4毒株間的沒有明顯的抗原差異性，與血凝抑制試驗結(jié)果一致。

圖2 DTMUV分離株E基因進化樹

表2 4株DTMUV的HI交叉試驗

表3 4株DTMUV的抗原差異性R值

左下方為HI試驗抗原性差異比較，右上方為細胞中和試驗抗原性差異比較

Comparison of antigenic difference with cross hemagglutination inhibition in lower triangle, comparison of antigenic difference with cross neutralization in upper triangle

3 討論

鴨坦布蘇病毒病2010年在我國江浙一帶開始流行，隨后迅速擴散到我國主要的鴨養(yǎng)殖地區(qū)，目前已發(fā)展為地方流行性常在疫病。該病流行期間，DTMUV是否發(fā)生了變異？毒力有無增強？抗原性是否發(fā)生變化？現(xiàn)有的疫苗是否能對目前的“流行毒株”產(chǎn)生保護？這些是國內(nèi)各養(yǎng)鴨企業(yè)、養(yǎng)鴨場包括疫苗生產(chǎn)企業(yè)最為關心的問題。我們利用2010—2016年間不同地區(qū)分離到的DTMUV毒株從病毒毒力、E蛋白基因序列和抗原差異性上進行了系統(tǒng)的比較和研究，為初步回答上述問題提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

圖3 4株DTMUV陽性血清中和效價

表4 4株DTMUV的細胞交叉中和試驗

本研究選用的毒株均為從發(fā)病鴨場分離得到，時間跨度從2010—2016年，分布地點有河北、河南、安徽和廣西等地。從ELD50和對鴨的人工感染試驗來看，病毒含量范圍在104.7—105.3ELD50/0.1mL，人工感染鴨的病毒分離陽性率均在85%以上，4株DTMUV對易感動物的毒力沒有明顯差異，與課題組前期的研究結(jié)果一致[29, 32-33]。多名研究人員也進行了動物回歸試驗，所得的試驗結(jié)果與本文基本一致。于可響[34]對2010年到2012年分離的6株病毒進行了ELD50的測定，范圍在105.0—105.5ELD50/0.2mL。2015年范萍萍[35]利用安徽銅陵分離株進行了動物回歸試驗，同樣也是在攻毒后第3天采食量、產(chǎn)蛋量開始下降，剖檢鴨卵巢萎縮、脾臟腫脹、胰臟出血等病變。

目前多篇關于鴨坦布蘇病毒株基因序列分析的研究表明，不同地區(qū)、不同時間的分離株基因組并無顯著性差異，尚未發(fā)生較大變異。萬春和等[36]發(fā)現(xiàn)不同來源（雞源、鴨源、鵝源、鴿源和蚊源）坦布蘇病毒Ｅ基因同源性均較高，未發(fā)現(xiàn)該病毒在不同家禽之間有明顯宿主特異性。張帥[37]2010—2012年通過對包括其實驗室分離的ZJ-407、YY5、ZJ-06在內(nèi)的35株DTMUV基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的各株病毒之間核酸和氨基酸的同源性分別為97.0%—100%和97.4%— 100%，不同來源的鴨坦布蘇病毒之間E蛋白基因未發(fā)生明顯改變。這與本文對于實驗室分離毒株E基因的分析結(jié)果一致。

R值判定是用于兩種抗原物質(zhì)相似程度的有效方法，可用于不同物種蛋白抗原相似性的分析。本文通過不同抗原與各自的抗體進行交叉反應，采用R值分析方法，經(jīng)數(shù)學處理扣除試驗誤差，定量給出試驗用毒株抗原的相似程度。從交叉血凝抑制試驗、細胞交叉中和試驗2個方面對分離的4株DTMUV抗原性作比較分析，其R值范圍分別為0.79—1.12和0.79—1.20，抗原比值均大于0.67，根據(jù)抗原相關性判定標準可初步判斷試驗用DTMUV沒有明顯的抗原性差異。該結(jié)論與本研究進行的對試驗動物毒力、E基因序列比對及同源性分析結(jié)論相符。YU[28]等利用2010—2012年分離的病毒株進行了血清交叉中和試驗，結(jié)果表明分離毒株為同一血清型。與本文的研究結(jié)果一致。

關于鴨坦布蘇病毒抗體的檢測方法有ELISA[38-39]、乳膠凝集試驗[40]、中和試驗等，尚未見有HI抗體測定方法的報道。本研究利用實驗室建立的HI試驗方法對血清中的HI抗體和中和抗體的相關性同時做了比較，從試驗結(jié)果來看具有良好的相關性，相比ELISA方法和中和試驗法，HI抗體檢測法具有可靠、簡單、用時短和不需要特殊設備等優(yōu)點，可用于該病的診斷和疫苗效力檢驗的替代檢驗方法。

4 結(jié)論

目前，DTMUV還沒有發(fā)現(xiàn)其他血清型，本文試驗研究所用的4株DTMUV在毒力、E基因序列和抗原性上沒有明顯的差異，提示我們目前國內(nèi)流行的毒株還未產(chǎn)生較大的變異。應堅持進行流行病學調(diào)查和疫情監(jiān)控，監(jiān)測該病毒的變異趨勢。但目前來說，不論是利用發(fā)病早期分離的毒株制備的疫苗，還是經(jīng)過弱化的弱毒苗，或是基因工程疫苗，都可以有效控制鴨坦布蘇病毒病的發(fā)生和流行，是預防和控制本病最經(jīng)濟有效的辦法。

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Virulence, E Gene Sequence and Antigenic Difference of 4 Duck Tembusu Virus Isolations

YANG ZhiYuan, DUAN HuiJuan, WANG XiaoLei, LIU LiXin, ZHAO JiCheng, PAN Jie, LIU YueHuan, LIN Jian

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agricultural and ForestrySciences, Beijing 100097)

【】The research aimed to compare the virulence of Duck Tembusu Virus (DTMUV), and to analysis its envelope protein gene sequence analysis and antigenic difference. 【】Susceptible 10-day-old duck embryos were inoculated with four different DTMUV strains, including DTMUV-HB isolated in 2011, DTMUV-AH isolated in 2014, DTMUV-GX1 isolated in 2012 and DTMUV-GX2 isolated in 2015. The median embryo lethal dose (ELD50) of the four strains was measured with 6-day-old SPF chicken embryos. According to that, forty 180-day-old healthy Peking duck were challenged respectively with four strains which were diluted into 100 ELD50/0.5 ml. The clinical, virological, pathological features of different DTMUV strains infection in ducks were characterized. The viral RNA of eight DTMUV strains were extracted from the allantoic fluid, and then the E gene were amplified by RT-PCR and sequenced. Then the similarity analysis of nucleotide and amino acid sequence and phylogenetic analysis were carried out. The HI titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined with duck tembusu virus hemagglutination inhibition test. The neutralization titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined by neutralization assay using C6/36 cell lines. We analyzed the antigenic difference of 4 DTMUV strains by R value, which contained cross hemagglutination inhibition test and cell cross neutralization test. 【】(1) The median embryo lethal dose (ELD50) were 10--4.7-10-5.3/0.1ml. The artificial infection test suggested that, feed intake and egg production of the challenged group decreased significantly on 3 days post inoculation (dpi), and the virus positive isolation rate were more than 85% on 2 dpi. The gross lesions of the reproductive system were mainly deformed and hemorrhaged follicular by necropsying on 8 dpi. (2) The results of sequence analysis showed that nucleotide sequence similarity was 95.7% - 100%, and the similarity of amino acid sequence was 98.2%. Genetic evolutionary analysis illustrated that all the DTMUV isolates in this study gathered into the same clade. (3) The R value showed antigenic difference of cross hemagglutination inhibition test were 0.79-1.12, and that of cell cross neutralization test were 0.79-1.20. 【】There were no significant difference in virulence, E gene sequence and antigenicity of four DTMUV strains isolated in this study.

Duck Tembusu virus; virulence; envelope protein gene; antigenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.021

2019-04-23；

2019-06-28

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD05008006）、北京市農(nóng)林科學院青年科研基金（QNJJ201516）

楊志遠，E-mail：yangzy88@126.com。

林健，Tel：010-51503475；E-mail：dblinjian@sina.com

（責任編輯 林鑒非）