王佳慧，顧凱迪，王楚堃，由春香，胡大剛，郝玉金

蘋果乙烯響應(yīng)因子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)

王佳慧，顧凱迪，王楚堃，由春香，胡大剛，郝玉金

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

【】乙烯響應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物根系形成、下胚軸伸長(zhǎng)、果實(shí)成熟、器官衰老等生長(zhǎng)發(fā)育過程，在調(diào)節(jié)植物生物和非生物脅迫反應(yīng)及果實(shí)品質(zhì)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?？寺√O果乙烯響應(yīng)因子，通過表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因功能分析，研究其在抵御非生物脅迫過程中的功能，為探索在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能提供理論依據(jù)。以‘王林’蘋果（×Borkh.）愈傷組織為試材，利用RT-PCR技術(shù)克隆，利用生物信息學(xué)方法分析其編碼氨基酸序列組成、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、親緣關(guān)系、空間結(jié)構(gòu)等，并利用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，與擬南芥ERF-B2亞家族進(jìn)行蛋白序列同源性分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探明其在蘋果組織中的表達(dá)和果實(shí)發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特征；同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)‘嘎拉’蘋果組培苗中對(duì)ACC、NaCl以及低溫的響應(yīng)；構(gòu)建基因的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得穩(wěn)定遺傳的過表達(dá)蘋果愈傷組織；檢測(cè)NaCl以及低溫處理后，野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的鮮重、丙二醛含量、電導(dǎo)率、過氧化氫含量以及超氧陰離子含量的差異。位于蘋果第13號(hào)染色體上，該基因存在1個(gè)ERF家族特有的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，與擬南芥序列同源性較高，都屬于ERFs家族的B2亞家族。氨基酸理化性質(zhì)分析表明，編碼253個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為27.61 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.10。另外，親疏水預(yù)測(cè)結(jié)果顯示疏水部分大于親水部分，表明其屬于疏水性蛋白。磷酸化位點(diǎn)分析顯示，只有蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，表明該蛋白可能受到磷酸化作用的調(diào)控。啟動(dòng)子序列中含有與茉莉酸（JA）、生長(zhǎng)素及干旱信號(hào)相關(guān)的順式作用元件。是乙烯正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在蘋果的各組織中均有表達(dá)，在果實(shí)和莖中表達(dá)量相對(duì)較高；并且在果實(shí)中隨著果實(shí)的成熟，表達(dá)量逐漸升高。蘋果組培苗中的表達(dá)明顯受到高鹽和低溫的誘導(dǎo)。過量表達(dá)的蘋果愈傷組織在高鹽和低溫脅迫處理下，生長(zhǎng)勢(shì)明顯比野生型對(duì)照強(qiáng)，電導(dǎo)率，丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子的含量都低于野生型，表明提高了對(duì)鹽和低溫脅迫的抗性。在響應(yīng)高鹽、低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用，過表達(dá)可以提高蘋果愈傷組織對(duì)高鹽和低溫脅迫的抗性。

蘋果；；乙烯響應(yīng)因子；脅迫應(yīng)答

0 引言

【研究意義】植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遭受許多環(huán)境脅迫，如土壤鹽漬化導(dǎo)致的鹽脅迫和極端天氣引發(fā)的溫度脅迫等。鹽脅迫是自然界普遍存在的非生物脅迫之一，鹽堿化土壤中NaCl和MgCl2等可溶性鹽的過量積累對(duì)植物造成離子脅迫，從而影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程[1]。低溫脅迫是植物栽培中常常遇到的一種脅迫，它對(duì)植物的影響主要體現(xiàn)在酶活性、膜系統(tǒng)、細(xì)胞失水等，輕則導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株死亡。前人研究發(fā)現(xiàn)，ERF類轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控高鹽、低溫等脅迫相關(guān)基因表達(dá)的功能[2]。因此，研究ERF類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)改良植物對(duì)鹽及溫度脅迫的耐性，從而提高作物的抗逆性具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF家族中的一個(gè)亞家族，每個(gè)成員都含有1個(gè)由大約60個(gè)氨基酸組成的非常保守的DNA結(jié)合域。ERF轉(zhuǎn)錄因子在多種植物中廣泛存在，擬南芥中發(fā)現(xiàn)124個(gè)ERF家族基因[3]，水稻中有139個(gè)ERF家族基因[4]。近年來，在煙草[5]、玉米[6]、番茄[7]等植物中也分離出這類家族基因。關(guān)于ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)理及抗逆脅迫功能的研究，在模式植物擬南芥、水稻、大豆等植物中已經(jīng)有大量報(bào)道。研究證明ERFs家族基因受高鹽、機(jī)械損傷、低氧、溫度、氧化脅迫等非生物脅迫誘導(dǎo)。許多ERF轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中異源表達(dá)能增強(qiáng)植株對(duì)非生物脅迫的抗性[8]。其中，DREB蛋白對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的研究較為透徹。過表達(dá)擬南芥中的提高了油菜的抗寒性[9]，相反，擬南芥或的RNAi株系削弱了植物的耐寒力[10]。在番茄、煙草和水稻中異源表達(dá)擬南芥基因可以提高植物耐寒性[11-14]。玫瑰亞家族基因在擬南芥中被冷脅迫迅速誘導(dǎo)[15]。蒺藜苜蓿轉(zhuǎn)入蒺藜狀苜蓿和中國(guó)玫瑰中也分別提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)寒冷的耐受性[16]。在番茄中異位超表達(dá)煙草可以提高對(duì)低溫脅迫的耐受能力，而反義表達(dá)的番茄植株則對(duì)低溫耐受力降低[17]。在鹽脅迫方面，植物ERF家族基因中甘蔗[18]、水稻和[19]、大麥[20]、甘薯和[21]等對(duì)鹽脅迫均有響應(yīng)。劉文奇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ERF類基因轉(zhuǎn)入煙草中可以提高抗鹽能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，雖然在擬南芥及水稻等植物中鑒定了ERF家族部分成員的功能，例如在抵抗辣椒疫霉病、黃瓜花葉病[23]等生物脅迫和高鹽、低溫、干旱等非生物脅迫方面發(fā)揮著重要功能，但是，蘋果中有關(guān)的相關(guān)報(bào)道較少。前期研究發(fā)現(xiàn)，小金海棠負(fù)調(diào)控蘋果缺鐵響應(yīng)[24]，但蘋果中對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)尚未有研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過表達(dá)蘋果愈傷組織，在對(duì)的表達(dá)量與高鹽、低溫等非生物脅迫之間的關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)上，探究對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，進(jìn)一步了解的功能，為蘋果砧木的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 植物材料與處理

2018年5月開始對(duì)樹齡9年的實(shí)生‘嘎拉’的生長(zhǎng)根、莖、葉片、花（初花期）和果實(shí)（花后60、90、120、150、180、210和230 d）進(jìn)行取樣。根主要取自當(dāng)年生新生根，莖和葉取自于當(dāng)年生春梢新梢及梢部葉片，花為初花期整個(gè)花序，為保證一致性，取樣時(shí)所有材料均取自一棵樹，并且3個(gè)不同樣品作為重復(fù)。

‘嘎拉’蘋果組培苗培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基[30 g·L-1蔗糖+4.7 g·L-1MS+0.2 mg·L-1indole-3-acetic acid（IAA）+0.5 mg·L-16-Benzylaminopurine（6-BA）+8 g·L-1瓊脂（pH 6.0）]上。用50 μmol·L-1乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）、100 μmol·L-1NaCl和4℃低溫分別處理生長(zhǎng)狀況良好的組培苗，分別于處理0、1、3、6、12和24 h取樣，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)的表達(dá)水平。

‘王林’蘋果愈傷組織培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基[30 g·L-1蔗糖+4.74 g·L-1MS+0.5 mg·L-16-BA+1 mg·L-12,4-D+8 g·L-1瓊脂（pH 6.0）]上，黑暗培養(yǎng)，溫度25℃。

1.2 總RNA的提取和定量分析

采用韓朋良等[25]的方法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。然后以cDNA為模板，以5′-CCACCATCCTC TTCACCG-3′和5′-CACCCGCCACCTCTTTCT-3′為特異性引物，檢測(cè)蘋果中的表達(dá)水平。

采用張全艷等[26]方法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每樣本進(jìn)行3次重復(fù)。最后采用2-??CT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

1.3 MdERF72的克隆

以-F（5′-ATGTGTGGTGGTGCTATCA TTTCCG-3′）和-R（5′-ATACAGAAGCT GCCCTTGTTGCTG-3′）分別為上、下游引物，‘嘎拉’組培苗葉片的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：其中ddH2O 17.25 μL，dNTPs（2 mmol·L-1）2 μL，HiFi buffer I 2.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，HiFiTaq DNA Polymerase0.25 μL。

1.4 MdERF72的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載及擬南芥中ERF-B2亞家族中的基因；用DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列氨基酸同源性比較并用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用ProtParam工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量與理論等電點(diǎn)；分別在PlantCARE（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/ protscale.pl）和Netphos 3.1 Serve（http://www.cbs. dtu.dk/services/NetPhos/）上分析啟動(dòng)子上的順式作用元件，氨基酸的親/疏水性以及預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化

參照Hu等[27]的方法對(duì)‘王林’蘋果的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.6 NaCl和低溫處理蘋果愈傷組織相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

將生長(zhǎng)良好的野生型和轉(zhuǎn)基因‘王林’蘋果愈傷組織在25℃常溫及4℃低溫下處理。在暗處培養(yǎng)，分別于0、5、10和15 d測(cè)量鮮重、丙二醛（MDA）含量、相對(duì)電導(dǎo)率、過氧化氫（H2O2）含量及超氧陰離子（OFR）含量。

將‘王林’蘋果野生型和過量表達(dá)愈傷組織分別鋪于愈傷固體培養(yǎng)基、添加100 mmol·L-1NaCl的愈傷固體培養(yǎng)基和添加150 mmol·L-1NaCl的愈傷固體培養(yǎng)基，在暗處培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察表型及檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

蘋果愈傷組織中MDA含量采用硫代巴比妥酸法[28]測(cè)定，相對(duì)電導(dǎo)率采用崔之益等[29]的方法。過氧化氫（H2O2）含量及超氧陰離子含量（OFR）分別用過氧化氫（H2O2）測(cè)試盒（科銘生物，蘇州，中國(guó)）、超氧陰離子（OFR）試劑盒（科銘生物，蘇州，中國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用DPS統(tǒng)計(jì)軟件Tukey法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 MdERF72全長(zhǎng)的克隆

以‘嘎拉’蘋果組培苗cDNA為模板，- F和-R為上、下游引物進(jìn)行基因克隆。結(jié)果（圖1）顯示，PCR擴(kuò)增獲得了1條約750 bp的條帶。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該基因包含長(zhǎng)為759 bp完整的開放閱讀框。與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 MdERF72生物信息學(xué)分析

在AppleGFDB（http://www.applegene.org/blastp. asp）數(shù)據(jù)庫中檢索的序列號(hào)MDP0000128979，發(fā)現(xiàn)位于蘋果第13號(hào)染色體上，含有一個(gè)內(nèi)含子。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因含有1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子家族特有的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域（圖2），因此，推斷該基因?yàn)橹参顴RF轉(zhuǎn)錄因子家族成員。

圖1 MdERF72 PCR擴(kuò)增

用MEGA5.0軟件最大似然法，對(duì)NCBI登錄的擬南芥AtERF-B2亞家族的5個(gè)蛋白與MDP0000128979進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果ERF蛋白（MDP0000128979）與擬南芥AtERF72（At3g16770）親緣關(guān)系最近（圖3），因此將該基因命名為。

氨基酸理化性質(zhì)分析表明，MdERF72編碼253個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為27.61 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.10。另外，親疏水預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MdERF72疏水部分大于親水部分，表明其屬于疏水性蛋白。磷酸化位點(diǎn)分析顯示，MdERF72只有蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，表明該蛋白可能受到磷酸化作用的調(diào)控。

圖2 MdERF72及其同源基因的氨基酸序列比對(duì)分析

圖3 蘋果ERF蛋白MDP0000128979與擬南芥ERF-B2家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 MdERF72啟動(dòng)子順式作用元件分析

PlantCARE分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列含有多個(gè)與抗逆性相關(guān)的調(diào)控元件：低溫響應(yīng)元件LTR，厭氧脅迫相關(guān)順式作用元件ARE，干旱脅迫相關(guān)順式作用元件MBS；另外，還發(fā)現(xiàn)了不同激素響應(yīng)作用元件：生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)相關(guān)順式作用元件TGA-box，茉莉酸響應(yīng)順式作用元件TGACG-motif core以及調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的光響應(yīng)順式作用元件Sp1（表1）。

表1 MdERF72基因啟動(dòng)子重要順式作用元件分析

2.4 蘋果中MdERF72的表達(dá)分析

用50 μmol·L-1ACC處理‘嘎拉’蘋果組培苗后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，表達(dá)量相比對(duì)照明顯升高，說明是乙烯正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（圖4）。

通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在‘嘎拉’蘋果生長(zhǎng)根、莖、葉、花、果實(shí)（花后60 d）中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，在根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，但莖和果實(shí)中的表達(dá)量較高（圖5）。因此，檢測(cè)了處于不同成熟階段的果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)成熟，的表達(dá)量逐漸升高，在230 d達(dá)到頂峰（圖6）。

2.5 ‘嘎拉’組培苗中MdERF72對(duì)NaCl及4℃低溫脅迫的響應(yīng)

100 mmol·L-1NaCl以及4℃低溫處理‘嘎拉’蘋果組培苗后，于0、1、3、6、12和24 h取樣后進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，在NaCl以及4℃低溫處理后，隨處理時(shí)間增加，表達(dá)量逐漸升高，在NaCl處理1 h達(dá)到最高值（圖7-A），4℃低溫處理6 h時(shí)達(dá)到頂峰（圖7-B）。

不同字母在0.05水平上有顯著差異。下同 Different letters indicate significant difference at 0.05 levels. The same as below

圖5 MdERF72在蘋果不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平

圖6 MdERF72在蘋果不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平

2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

構(gòu)建::過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染‘王林’蘋果愈傷組織。獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因愈傷組織（圖8），分別命名為-OE1、-OE2、-OE3。

圖7 ‘嘎拉’組培苗中MdERF72對(duì)NaCl（A）和4℃（B）低溫的響應(yīng)

2.7 過量表達(dá)MdERF72蘋果愈傷組織對(duì)NaCl及4℃低溫脅迫的抗性

將過量表達(dá)蘋果愈傷組織（OE1、OE2、OE3）與野生型愈傷組織（WT）分別用0、100和150 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含有100和150 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d（圖9），3個(gè)過表達(dá)愈傷組織的生長(zhǎng)速率均高于野生型（圖10-A）、丙二醛含量（圖10-B）、相對(duì)電導(dǎo)率（圖10-C）、過氧化氫含量（圖10-D）和超氧陰離子含量（圖10-E）都低于野生型，表明可以提高轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對(duì)高鹽脅迫的抗性。

圖8 MdERF72轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織的鑒定

同樣將過量表達(dá)蘋果愈傷組織（OE1、OE2和OE3）與野生型愈傷組織（WT）分別在25℃和4℃培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4℃培養(yǎng)15 d后（圖11），3個(gè)過表達(dá)愈傷組織的生長(zhǎng)速率都高于野生型（圖12-A），丙二醛含量（圖12-B）、相對(duì)電導(dǎo)率（圖12-C）、過氧化氫含量（圖12-D）和超氧陰離子含量（圖12-E）都低于野生型，表明轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織對(duì)低溫脅迫抗性提高。

3 討論

蘋果是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。中國(guó)是世界上蘋果種植面積最大、產(chǎn)量最高的國(guó)家，隨著國(guó)際農(nóng)業(yè)合作力度的不斷加深，我國(guó)也成為世界上蘋果及相關(guān)加工品主要出口國(guó)之一。然而，近年來極端天氣頻發(fā)，蘋果的生長(zhǎng)面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，其中鹽堿化、干旱、低溫等脅迫對(duì)蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重?fù)p傷，因此，選育抗鹽、抗旱、耐寒的優(yōu)良蘋果砧木是目前所要解決的關(guān)鍵問題。

面對(duì)復(fù)雜的環(huán)境變化，植物通過一系列的信號(hào)傳遞和能量代謝抵御外界不良環(huán)境的侵害。在這一過程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。因此，研究轉(zhuǎn)錄因子的功能，對(duì)提高植物的抗逆性及選育優(yōu)良品種具有重要意義。乙烯應(yīng)答因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，與生物/非生物脅迫密切相關(guān)。例如，在水稻和菊花中過表達(dá)，可以提高轉(zhuǎn)基因植株在干旱、高鹽和低溫脅迫處理下的耐受性[30-32]；在煙草中過表達(dá)可以提高對(duì)煙草花葉病毒的抗性[33]；在煙草中過表達(dá)陸地棉可以提高對(duì)赤星病的抗性[34]。關(guān)于蘋果中的功能，前人研究發(fā)現(xiàn)，蘋果參與茉莉酸（JA）介導(dǎo)的果實(shí)成熟[35]。然而，蘋果中對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，的表達(dá)受高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)；并且隨著果實(shí)的成熟，內(nèi)源乙烯釋放量增多，的表達(dá)量逐漸升高，因此，推斷是乙烯響應(yīng)的正調(diào)控因子。另外，本研究表明，除在蘋果莖中表達(dá)量較高外，在果實(shí)中的表達(dá)量也很高，可能參與蘋果果實(shí)抵御外界不利的非生物和生物脅迫；而且前人的研究表明，乙烯響應(yīng)因子作為激素和脅迫信號(hào)的一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)中心[36]，這一報(bào)道支持乙烯響應(yīng)因子家族基因可能參與非生物脅迫抵抗力；同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)在蘋果愈傷組織中過表達(dá)確實(shí)可以提高其對(duì)高鹽和低溫脅迫的抗性。

圖9 蘋果野生型（WT）和MdERF72過量表達(dá)愈傷組織（OE1、OE2和OE3）在NaCl處理下的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖10 蘋果野生型（WT）和MdERF72過量表達(dá)愈傷組織（OE1、OE2和OE3）在NaCl處理下的鮮重（A），丙二醛含量（B），電導(dǎo)率（C），過氧化氫含量（D），超氧陰離子含量（E）

圖11 蘋果野生型（WT）和MdERF72過量表達(dá)愈傷組織（OE1、OE2和OE3）在4℃低溫處理下的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖12 蘋果野生型（WT）和MdERF72過量表達(dá)愈傷組織（OE1、OE2和OE3）在4℃低溫處理下的鮮重（A），丙二醛含量（B），電導(dǎo)率（C），過氧化氫含量（D），超氧陰離子含量（E）

提高作物對(duì)鹽脅迫的抗性，可以有效的提高產(chǎn)量和品質(zhì)。由于氣候多變、植被破壞加劇及耕作管理不當(dāng)?shù)仍?，土壤鹽堿化越來越嚴(yán)重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球9億多hm2土地面臨土壤鹽堿化問題。土壤鹽堿化會(huì)導(dǎo)致植物根系對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)的吸收受到抑制，使樹勢(shì)衰弱，抗性下降，病害頻發(fā)。面對(duì)土壤鹽堿化，除了從改良土壤方面入手，還可以通過提高植物的耐鹽性來改善。在水稻中，植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制已經(jīng)有較為完善的研究。在蘋果中，植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)尚不明確。本研究中發(fā)現(xiàn)的正調(diào)控蘋果對(duì)高鹽及低溫的脅迫響應(yīng)，對(duì)于選育抗鹽、耐寒的優(yōu)良蘋果砧木具有重要指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

克隆獲得蘋果乙烯響應(yīng)因子基因，該基因編碼253個(gè)氨基酸。包含一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析顯示，與擬南芥親緣關(guān)系最近。在蘋果莖和果實(shí)中表達(dá)量較高，并且對(duì)高鹽和低溫脅迫有明顯響應(yīng)。轉(zhuǎn)基因愈傷在高鹽和低溫脅迫下生長(zhǎng)勢(shì)要明顯強(qiáng)于野生型，說明在響應(yīng)高鹽和低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要的正調(diào)控作用。

[1] 楊志佳. 鹽堿脅迫下擬南芥14-3-3蛋白對(duì)蛋白激酶SOS2和PKS5調(diào)控的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

YANG Z J. Regulation of protein kinases SOS2 and PKS5 by 14-3-3 protein under salt and alkali stress in. Beijing: China Agricultural University, 2019. (in Chinese)

[2] LICAUSI F, OHME-AKAGI M, PERATA P. APETALA 2/Ethylene Responsive Factor (AP2/ERF) transcription factors: mediators of stress responses and developmental programs., 2013, 199(3): 639-649.

[3] RIECHMANN J L, HEARD J, MARTIN G, REUBER L, JIANG C Z, KEDDIE J, ADAM L, PINEDA O, RATCLIFFE O J, SAMAHA R R, CREELMAN R, PILGRIM M, BROUN P, ZHANG J Z, GHANDEHARI D, SHERMAN B K, YU G L.transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes., 2000, 290(5499): 2105-2110.

[4] NAKANO T, SUZUKI K, FUJIMURA T, SHINSHI H. Genome-wide analysis of the ERF gene family inand rice., 2006, 140(2): 411-432.

[5] OHME-TAKAGI M, SHINSHI H. Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element., 1995, 7(2): 173-182.

[6] MOOSE S P, SISCO P H. Glossy15, an APETALA2-like gene from maize that regulates leaf epidermal cell identity., 1996, 10(23): 3018-3027.

[7] GU Y Q, WILDERMUTH M C, CHAKRAVARTHY S, LOH Y T, YANG C, HE X H, MARTIN G B. Tomato transcription factors Pti4, Pti5, and Pti6 activate defense responses when expressed in., 2002, 14(4): 817-831.

[8] MITO T, SEKI M, SHINOZAKI K, TAKAGI M O, MATSUI K. Generation of chimeric repressors that confer salt tolerance inand rice., 2011, 9(7): 736-746.

[9] JAGLO K R, KLEFF S, AMUNDSEN K L, ZHANG X, HAAKE V, ZHANG J Z, DEITS T, THOMASHOW M F. Components of theC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved inand other plant species., 2001, 127(3): 910-917.

[10] NOVILLO F, MEDINA J, SALINAS J.CBF1 and CBF3 have a different function than CBF2 in cold acclimation and define different gene classes in the CBF regulon., 2007, 104(52): 21002-21007.

[11] HSIEH T H, LEE J T, YANG P T, CHIU L H, CHARNG Y Y, WANG Y C, CHAN M. Heterology expression of theC-repeat/ dehydration response element binding Factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato., 2002, 129(3): 1086-1094.

[12] KASUGA M, MIURA S, SHINOZAKI K, SHINOZAKI K Y. A combination of theDREB1A gene and stress-induciblepromoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer., 2004, 45(3): 346-350.

[13] ITO Y, KATSURA K, MARUYAMA K, TAJI T, KOBAYASHI M, SEKI M, SHINOZAKI K, SHINOZAKI K Y. Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice., 2006, 47(1): 141-153.

[14] PINO M T, Skinner J S, JEKNI? Z, HAYES P M, SOELDNER A H, THOMASHOW M F, CHEN T H H. Ectopicover- expression enhances freezing tolerance and induces cold acclimation- associated physiological modifications in potato., 2008, 31(4): 393-406.

[15] LIU Q, KASUGA M, SAKUMA Y, ABE H, MIURA S, Yamaguchi- HINOZAKI K, SHINOZAKI K. Two transcription factors, DREB1

and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature- responsive gene expression, respectively, in., 1998, 10(8): 1391-1406.

[16] CHEN J R, Lü J J, LIU R, LIU R, XIONG X Y, WANG T X, CHEN S Y, GUO L B, WANG H F. DREB1C fromenhances freezing tolerance in transgenicand China Rose (Jacq.)., 2010, 60(3): 199-211.

[17] ZHANG Z, HUANG R. Enhanced tolerance to freezing in tobacco and tomato overexpressing transcription factoris modulated by ethylene biosynthesis., 2010, 73(3): 241-249.

[18] TRUJILLO L E, SOTOLONGO M, MENENDEZ C, OCHOGAVíA M E, COLL Y, HERNáNDEZ I, HIDALGO O B, THOMMA B P H J, VERA P, HERNáNDEZ L. SodERF3, a novel sugarcane ethylene responsive factor (ERF), enhances salt and drought tolerance when overexpressed in tobacco plants., 2008, 49(4): 512-525.

[19] SERRA T S, FIGUEIREDO D D, CORDEIRO A M, ALMEIDA D M, LOUREN?O T, ABREU I A, SEBASTIáN A, FERNANDES L, MOREIRA B C, OLIVEIRA M M, SAIBO N J M. OsRMC, a negative regulator of salt stress response in rice, is regulated by two AP2/ERF transcription factors., 2013, 82(4/5): 439-455.

[20] JUNG J, WON S Y, SUH S C, KIM H, WING R, JEONG Y, HWANG I, KIM M. The barley ERF-type transcription factor HvRAF confers enhanced pathogen resistance and salt tolerance in., 2007, 225(3): 575-588.

[21] KIM Y H, JEONG J C, PARK S, LEE H S, KWAK S S. Molecular characterization of two ethylene response factor genes in sweetpotato that respond to stress and activate the expression of defense genes in tobacco leaves., 2012, 169(11): 1112-1120.

[22] 劉文奇, 陳旭君, 徐曉暉, 凌建群, 郭澤建. ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因的超表達(dá)提高煙草的耐鹽能力.植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 28(6): 473-478.

LIU W Q, CHEN X J, XU X H, LING J Q, GUO Z J. Overexpression of ERF transcription factorgene enhances salt tolerance of tobacco.. 2002, 28(6): 473-478. (in Chinese)

[23] SHIN R, PARK J M, AN J M, PAEK K H. Ectopic expression ofbacterial, and oomycete pathogens., 2002, 15(10): 983-989.

[24] 劉偉. 乙烯響應(yīng)因子ERF4/ERF72參與蘋果砧木缺鐵應(yīng)答的功能研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

LIU W. Functional research of ethylene response factor ERF4/ERF72 involved in iron deficiency response of apple rootstocks. Beijing: China Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[25] 韓朋良, 劉肖娟, 劉鑫, 董元花, 胡大剛, 郝玉金. 蘋果生長(zhǎng)素阻遏蛋白基因的分子克隆與功能鑒定. 園藝學(xué)報(bào), 2018, 45(6): 1041-1053.

HAN P L, LIU X J, LIU X, DONG Y H, HU D G, HAO Y J. Molecular cloning and functional identification of apple auxin repressor protein gene., 2018, 45(6): 1041-1053. (in Chinese)

[26] 張全艷, 于建強(qiáng), 王佳慧, 胡大剛, 郝玉金. 蘋果的克隆及其在蘋果愈傷組織的抗鹽功能鑒定. 園藝學(xué)報(bào), 2017, 44(11): 2163-2170.

ZHANG Q Y, YU J Q, WANG J H, HU D G, HAO Y J. Molecular cloning and functional characterization ofreveals its involvement in salt tolerance in apple callus., 2017, 44(11): 2163-2170. (in Chinese)

[27] HU D G, SUN C H, MA Q J, YOU C X, CHENG L, HAO Y J. MdMYB1 regulates anthocyanin and malate accumulation by directly facilitating their transport into vacuoles in apples., 2016, 170(3): 1315-1330.

[28] 趙世杰, 許長(zhǎng)成, 鄒琦, 孟慶偉. 植物組織中丙二醛測(cè)定方法的改進(jìn). 植物生理學(xué)通訊, 1994, 30(3): 207-210.

ZHAO S J, XU C C, ZOU Q, MENG Q W. Improvements of method for measurement of malondialdehyde in plant tissues., 1994, 30(3): 207-210. (in Chinese)

[29] 崔之益, 李蕊萍, 胡加新, 奚如春. 電導(dǎo)法在植物研究中應(yīng)用. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(17): 5358-5359, 5366.

CUI Z Y, LI R P, HU J X, XI R C. Application of conductivity method in botanical research., 2014, 42(17): 5358-5359, 5366. (in Chinese)

[30] OH S J, SONG S I, KIM Y S, JANG H J,KIM S Y, KIM M, KIM Y K,NAHM B H, KIM J K.and, 2005, 138(1): 341-351.

[31] HONG B, TONG Z, MA N, KASUGA M, SHINOZAKI Y, GAO J P. Expression of thegene in transgenic chrysanthemum enhances tolerance to low temperature., 2006, 81(6): 1002-1008.

[32] HONG B, TONG Z, MA N, LI J, KASUGA M, YAMAGUCHI S K, GAO J P. Heterologous expression of thegene in chrysanthemum increases drought and salt stress tolerance., 2006, 49(5): 436-445.

[33] FISCHER U, DR?GE-LASER W. Overexpression of, a new member of the tobacco ethylene response transcription factor family enhances resistance to tobacco mosaic virus., 2004, 17(10): 1162-1171.

[34] ZUO K J, QIN J, ZHAO J Y, LING H, ZHANG L D, CAO Y F, TANG K X. Over-expressiontranscription factor in tobacco enhances brown spots disease resistance by activating expression of downstream genes., 2007, 391(1/2): 80-90.

[35] LI T, XU Y X, ZHANG L C, JI Y L, TAN D M, YUAN H, WANG A D. The jasmonate-activated transcription factor MdMYC2 regulatesand ethylene biosynthetic genes to promote ethylene biosynthesis during apple fruit ripening., 2017, 29(6): 1316-1334.

[36] Müller M, Munné-Bosch S. Ethylene response factors: A key regulatory hub in hormone and stress signaling., 2015, 169(1): 32-41.

Analysis of Apple Ethylene Response Factorto Abiotic Stresses

WANG JiaHui, GU KaiDi, WANG ChuKun, YOU ChunXiang, HU DaGang, HAO YuJin

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology(Huanghuai Region)and Germplasm Innovation, Tai’an 271018, Shandong)

【】Ethylene response factor (ERF) , a plant-specific transcription factor, is involved in the growth and development of root formation, hypocotyl elongation, fruit ripening, and organ senescence. It also plays a vital role in regulating responses of plant biological and abiotic stress, as well as fruit qualities. In this study, we cloned the apple ethylene response factor. Subsequently, a series of expression analysisand functional identification of transgenic apple calli were performed to study its role in abiotic stress responses. These results provided a theoretical basis for exploring the functions of【】Using Orin apple calli (Borkh.) as the test material, thewas cloned from apple fruits by RT-PCR assay. Bioinformatics methods were used to analyze its amino acid sequence, physicochemical properties genetic relationship, and spatial structure. MEGA5.0 was used to construct the phylogenetic tree for analyzing the homology of its protein sequence with ERF-B2 subfamily in.The real-time fluorescence PCR (qRT-PCR) assays were performed to analyse the expression ofdifferent developmental stages.Meanwhile, the expression ofWe also constructed its overexpression vector and obtained stable overexpression apple calli through-mediated genetic transformation. The fresh weight, malondialdehyde content, electrical conductivity, hydrogen peroxide content and superoxide anion content of the wild type and transgenic apple calli were detected after NaCl and low temperature treatment.【】was located on chromosome 13 in apple genome, which had an AP2/ERF domain, unique to ERF family. Phylogenetic tree analyses indicated that the appleexhibited the highest sequence similarity to, and belonged to the B2 subfamily of ERF family.Analysis of amino acid physicochemical properties indicated thatencodes 253 amino acids, and its protein molecular weight was predicted as 27.61 kD, the isoelectric point (pI) was 5.10. In addition, the pro-hydrophobic prediction showed that the hydrophobic portion ofwas larger than the hydrophilic portion, indicating that it belonged to a hydrophobic protein. Phosphorylation site analysis revealed thathad only one threonine phosphorylation site, suggesting that the protein might be regulated by phosphorylation.The results revealed that thepromoter sequence contains-acting elements associated with jasmonic acid (JA), auxin and drought signals. qRT-PCR analysis showed thatwas a positive regulatory transcription factor of ethylene, which was expressed in all tissues of apple. Its expression in fruits and stems was relatively high, and gradually increased with the fruit ripening. The expression ofsignificantly induced by high salt and low temperature.Under the treatment of high salt and low temperature stresses, the- overexpressing apple calli had stronger growth potential than the wild type control, and the conductivity, malondialdehyde, hydrogen peroxide and superoxide anion content were lower than the wild type control, indicating thatincreased the resistance to salt and low temperature stresses.【】played an important role in the regulation of high salt and low temperature stresses. Overexpression ofcould increase the resistance of apple calli to high salt and low temperature stresses.

apple;; ethylene response factor; stress responses

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.017

2019-03-21；

2019-07-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（31601728，31430074，31772288）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-06-03）、國(guó)家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-27）、山東省自然科學(xué)基金（ZR2016CQ13）

王佳慧，E-mail：wangjhedu@126.com。

郝玉金，E-mail：haoyujin@sdau.edu.cn。通信作者胡大剛，E-mail：fap_296566@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）