卞書(shū)迅，韓曉蕾，袁高鵬，張利義，田義，張彩霞，叢佩華

蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的克隆及功能分析

卞書(shū)迅，韓曉蕾，袁高鵬，張利義，田義，張彩霞，叢佩華

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家蘋(píng)果育種中心，遼寧興城 125100）

【】U6啟動(dòng)子是CRISPR/Cas9基因組編輯載體系統(tǒng)中驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件，其可能存在物種特異性因子，且長(zhǎng)度不同轉(zhuǎn)錄活性存在差異。迄今在蘋(píng)果（×）上對(duì)U6啟動(dòng)子尚缺乏研究。因此，篩選出轉(zhuǎn)錄活性高且片段大小合適的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子，可以優(yōu)化蘋(píng)果CRISPR/Cas9基因編輯體系。利用軟件DNAMAN以及啟動(dòng)子元件在線分析網(wǎng)站PLACE和plant CARE對(duì)蘋(píng)果U6啟動(dòng)子進(jìn)行比對(duì)分析；克隆并構(gòu)建U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因（Firefly luciferase，）的融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)染蘋(píng)果愈傷組織和本氏煙草（）葉片；通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性對(duì)各U6啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性比較。蘋(píng)果基因組中共檢索到6條U6 snRNA（E-value＜3e-40），分別位于第6、7、9、10、15和17號(hào)染色體上，取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作為候選U6啟動(dòng)子。序列比對(duì)結(jié)果顯示，蘋(píng)果U6啟動(dòng)子與擬南芥相同，均具有兩個(gè)保守的元件，包括上游序列元件（Upstream sequence element，USE）和TATA-Like box。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，10號(hào)染色體上的U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高，10號(hào)染色體上5′端截短的U6啟動(dòng)子（長(zhǎng)度分別為1 500、959、275和116 bp）中275 bp的啟動(dòng)子活性最強(qiáng)。另外，在蘋(píng)果愈傷組織中，蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性要顯著高于擬南芥U6啟動(dòng)子。從蘋(píng)果基因組克隆6條U6啟動(dòng)子，并篩選出一條轉(zhuǎn)錄活性高且片段長(zhǎng)度較短的U6啟動(dòng)子。

蘋(píng)果；U6啟動(dòng)子；熒光素酶；本氏煙草；愈傷組織

0 引言

【研究意義】人工優(yōu)化后的II型CRISPR/Cas9基因編輯體系[1-2]，因操作簡(jiǎn)單、效率高，以及脫靶效應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)受到全世界的廣泛關(guān)注。目前，該系統(tǒng)已應(yīng)用于多種植物[3-4]，在植物分子育種中展現(xiàn)出巨大的前景。具有雙鏈斷裂能力的Cas9蛋白和一個(gè)人工融合的小向?qū)NA（single guide RNA）構(gòu)成了常規(guī)的CRISPR/Cas9基因編輯體系[5]，其中sgRNA起到靶向結(jié)合目的位點(diǎn)的功能，因此，篩選合適的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯體系發(fā)揮功能有至關(guān)重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】U6 snRNA（Small nuclear RNA）是一種小的非編碼RNA，全長(zhǎng)102 bp且序列非常保守[6]，受RNA聚合酶III的識(shí)別和轉(zhuǎn)錄，廣泛參與細(xì)胞核中mRNA前體（pre-mRNA）的剪接成熟[7-9]。驅(qū)動(dòng)U6 snRNA轉(zhuǎn)錄的U6啟動(dòng)子常作為CRISPR/Cas9基因編輯載體中驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄的重要元件。U6啟動(dòng)子在真核生物中發(fā)揮作用需具備兩個(gè)重要的序列元件USE（Upstream sequence element）和TATA-Like box[6,10]，均處于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前[11-12]。此外，U6啟動(dòng)子具有明確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)‘G’堿基，可以精確轉(zhuǎn)錄sgRNA[13]，但精確的起始轉(zhuǎn)錄要求轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周?chē)蛄斜３址€(wěn)定[14]，前人[15-16]對(duì)攜帶5′端不同長(zhǎng)度snRNA（+1 bp，+19—+27 bp）的U6啟動(dòng)子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄活性比較，發(fā)現(xiàn)攜帶27 bp snRNA序列的U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較高。目前，已有多種植物的U6啟動(dòng)子應(yīng)用于CRISPR/Cas9基因編輯體系[17-21]，LI等[3]和FENG等[22]利用擬南芥中已克隆的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，在擬南芥中成功建立CRISPR/Cas9基因組編輯體系，并成功敲除擬南芥中和。JIANG等[17]克隆水稻U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，并在水稻原生質(zhì)體中敲除和。JACOBS等[23]克隆了大豆U6啟動(dòng)子，構(gòu)建靶向敲除綠色熒光蛋白（GFP）基因的Cas9/sgRNA載體，并成功修飾9個(gè)大豆內(nèi)源基因。NISHTANI等[24]利用擬南芥U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄，成功突變了蘋(píng)果葉綠素合成相關(guān)基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然多種植物的U6啟動(dòng)子在CRISPR/Cas9基因編輯體系中得到應(yīng)用，但U6啟動(dòng)子在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中并不適用[6]，LI等[18]發(fā)現(xiàn)僅擬南芥U6啟動(dòng)子具備保守的序列元件‘CAT框’，推測(cè)其可能是擬南芥U6啟動(dòng)子的物種特異性因子。并且，不同序列長(zhǎng)度、不同組織類(lèi)型對(duì)U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性也存在一定影響[18,25-26]。目前，還未有蘋(píng)果內(nèi)源U6啟動(dòng)子介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯體系。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性比較，篩選到長(zhǎng)度合適且轉(zhuǎn)錄活性高的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子，以期為進(jìn)一步發(fā)展蘋(píng)果CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/蘋(píng)果育種中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用‘金冠’蘋(píng)果幼嫩葉片和本氏煙草種子于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所種質(zhì)資源圃及實(shí)驗(yàn)室中保存；質(zhì)粒由新西蘭皇家植物和食品研究所博士惠贈(zèng)；（Accession No. KR029101.1）質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈(zèng)；pTOPO-Blunt Clone kit購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司；Prime STAR MAX高保真DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司；DH5α和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)購(gòu)于莊盟生物科技有限公司；熒光素鈉鹽購(gòu)于上海生工生物工程公司；測(cè)序及引物合成由天津金唯智生物公司完成。

1.2 蘋(píng)果U6啟動(dòng)子克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

用擬南芥保守的102 bp U6 snRNA序列在薔薇科植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GDR（http://www.rosaceae.org/ node/1）中檢索蘋(píng)果候選的U6啟動(dòng)子，在基因組共檢索到超過(guò)10條U6 snRNA，選擇E-value＜3e-40的6條，分別取其5′端27 bp U6 snRNA以及上游1 500 bp作為候選蘋(píng)果U6啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增（表1）。用植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)蘋(píng)果品種‘金冠’基因組DNA進(jìn)行提取，使用Prime STAR MAX高保真DNA聚合酶對(duì)蘋(píng)果U6啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增。電泳檢測(cè)正確的片段與pTOPO-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)測(cè)序后進(jìn)行質(zhì)粒提取。將T-MdU6-Ps和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（酶切位點(diǎn)見(jiàn)表1），確定正確后用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)并提取質(zhì)粒。為比較蘋(píng)果和擬南芥U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，本試驗(yàn)以質(zhì)粒為模板克隆長(zhǎng)度為301 bp的啟動(dòng)子（表1），并連接至載體，命名為::。不同U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因的融合表達(dá)載體示意圖如圖1。

圖1 U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LUC報(bào)告基因的融合表達(dá)載體構(gòu)建

表1 本研究使用的引物序列

小寫(xiě)字母為限制性酶切位點(diǎn)序列 Restriction site sequences are indicated by lowercase letters

1.3 MdU6啟動(dòng)子序列元件分析

利用DNAMAN軟件對(duì)BLAST檢索到的6條蘋(píng)果U6啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)，分析其保守的序列元件。利用PLACE和Plant CARE啟動(dòng)子在線分析網(wǎng)站預(yù)測(cè)蘋(píng)果U6啟動(dòng)子序列元件。

1.4 本氏煙草種植

本氏煙草種子于濕潤(rùn)環(huán)境中避光發(fā)芽后移入土中（蛭石﹕腐殖土﹕田園土=1.5﹕1﹕1）。溫度23℃，光照強(qiáng)度12 000 lx，濕度70%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)4—6周，選取第4片之后的功能葉進(jìn)行注射。

1.5 本氏煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)分析

將鑒定正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。于液體YEB培養(yǎng)基中搖至OD600值為0.8—1.0，離心收集菌體，重懸浮于注射緩沖液（10 mmol?L-1MgCl2+200 μmol?L-1AS）中。將重懸液于28℃靜置3 h，注射本氏煙草葉片，避光過(guò)夜后于23℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)96 h。每片葉為一次重復(fù)，3次重復(fù)。

1.6 蘋(píng)果愈傷組織中瞬時(shí)表達(dá)分析

方法同1.5，待目的菌液搖至OD600值為0.6—0.8，離心收集菌體，重懸浮于注射緩沖液中，28℃靜置活化3 h，取狀態(tài)良好的蘋(píng)果‘王林’愈傷組織放入其中，于28℃震蕩侵染15 min，無(wú)菌水沖洗后用濾紙吸干，置于愈傷培養(yǎng)基中28℃避光共培養(yǎng)96 h，再次沖洗并吸水后放于無(wú)抗性愈傷培養(yǎng)基上，重復(fù)3次。

1.7 生物發(fā)光檢測(cè)

對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化96 h后的植物組織的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。將植物材料與100 mmol?L-1熒光素鈉鹽進(jìn)行反應(yīng)，煙草葉片浸泡3—5 min，蘋(píng)果愈傷組織浸泡10 min。通過(guò)高分辨力制冷CCD檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（Tanon 5200Multi，中國(guó)），運(yùn)用成像軟件對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成彩色圖像。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行分析, 并采用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 MdU6啟動(dòng)子序列比對(duì)分析

基于‘金冠’蘋(píng)果基因組中的BLAST結(jié)果，對(duì)E-value＜3e-40的6條U6 snRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其分別位于蘋(píng)果第6、7、9、10、15和17號(hào)染色體上（表2），全長(zhǎng)均為102 bp且序列保守，另外，其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)均為‘G’堿基。參照PAUL等[15]的結(jié)論，本試驗(yàn)選取各U6 snRNA的5′端27 bp及其上游 1 500 bp作為蘋(píng)果U6啟動(dòng)子候選序列，分別命名為MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-9P、MdU6-10P、MdU6- 15P和MdU6-17P。選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前后150 bp序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其均存在-30位點(diǎn)的TATA-like box和-60位點(diǎn)的USE（5′-GTCCCACATCG-3′），且兩個(gè)元件之間的距離較為保守（圖2），其中TATA- like box與RNA聚合酶III的識(shí)別和結(jié)合相關(guān)。

表2 蘋(píng)果U6 snRNA染色體定位

圖2 MdU6啟動(dòng)子序列分析

2.2 蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的克隆及鑒定

從‘金冠’基因組DNA中成功克隆出MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-9P、MdU6-10P、MdU6-15P和MdU6-17P，測(cè)序結(jié)果顯示序列正確。將各啟動(dòng)子片段分別連入載體，并命名為::、::、::、::、::和::（圖3）。

2.3 蘋(píng)果U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性鑒定

將各::載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法注射于煙草葉片，并以::為陽(yáng)性對(duì)照，空載體為陰性對(duì)照。96 h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MdU6-10P熒光信號(hào)最強(qiáng)，MdU6-9P僅次于MdU6-10P，而MdU6-6P、MdU6-7P、MdU6-15P以及MdU6-17P的熒光信號(hào)均較弱（圖4）。

A：M：2 kb DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量M: DL2000 DNA marker; 1: MdU6-6P; 2: MdU6-7P; 3: MdU6-9P; 4: MdU6-10P; 5: MdU6-15P; 6: MdU6-17P: B：M：5 kb DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量M: DL5000 DNA marker; 1: MdU6-6P::LUC; 2: MdU6-7P::LUC; 3: MdU6-9P::LUC; 4: MdU6-10P::LUC; 5: MdU6-15P::LUC; 6: MdU6-17P::LUC

6P: MdU6-6P::LUC; 7P: MdU6-7P::LUC; 9P: MdU6-9P::LUC; 10P: MdU6-10P::LUC; 15P: MdU6-15P::LUC; 17P: MdU6-17P::LUC

為比較MdU6-9P和MdU6-10P在蘋(píng)果中的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步將::和::載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化蘋(píng)果愈傷組織，對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)并將熒光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖5）。發(fā)現(xiàn)::的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著高于::，證明MdU6-10P具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，因此，選取蘋(píng)果10號(hào)染色體上的U6啟動(dòng)子用于后續(xù)試驗(yàn)。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

2.4 MdU6-10P元件分析

為分析序列長(zhǎng)度對(duì)MdU6-10P轉(zhuǎn)錄活性的影響，使用PLACE和Plant CARE啟動(dòng)子元件在線分析網(wǎng)站對(duì)MdU6-10P進(jìn)行元件分析，以預(yù)測(cè)的‘CAT框’為依據(jù)，對(duì)其進(jìn)行5′端截短（截短長(zhǎng)度分別為959、275和116 bp）。截短后的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子分別命名為MdU6-10-2P、MdU6-10-3P和MdU6-10-4P（圖6）。

2.5 MdU6-10-Ps的克隆及鑒定

從‘金冠’蘋(píng)果基因組中成功克隆出MdU6-10-2P、MdU6-10-3P和MdU6-10-4P，將各啟動(dòng)子片段分別連至載體，將測(cè)序正確的各載體分別命名為::、::C和::（圖7）。

2.6 MdU6-10-Ps轉(zhuǎn)錄活性鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將::、、::和-::載體注射煙草葉片。檢測(cè)熒光素酶活性并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)注射后的煙草葉片均具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，但并無(wú)顯著差異（圖8）。

圖6 5′端截短的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子示意圖

進(jìn)一步在蘋(píng)果愈傷組織中驗(yàn)證各長(zhǎng)度蘋(píng)果U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果與煙草葉片不同，如圖9所示。MdU6-10-Ps轉(zhuǎn)染后的愈傷組織熒光信號(hào)強(qiáng)度存在顯著差異（MdU6-10-3P＞MdU6-10-2P＞MdU6-10P＞MdU6-10-4P），其中，MdU6-10-3P熒光信號(hào)最強(qiáng)，而MdU6-10-4P熒光信號(hào)強(qiáng)度最弱，但仍可檢測(cè)到熒光信號(hào)。

A：M：2 Kb DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量M: DL2000 DNA marker; 1: MdU6-10-2P; 2: MdU6-10-3P; 3: MdU6-10-4P; B：M：5Kb DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量M: DL5000 DNA marker; 1: MdU6-10P::LUC; 2: MdU6-10-2P::LUC; 3: MdU6-10-3P::LUC; 4: MdU6-10-4P::LUC

A: MdU6-10P::LUC; B: MdU6-10-2P::LUC; C: MdU6-10-3P::LUC; D: MdU6-10-4P::LUC

2.7 蘋(píng)果和擬南芥U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性比較

為比較擬南芥和蘋(píng)果U6啟動(dòng)子在蘋(píng)果中的轉(zhuǎn)錄活性，將::和::載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化至蘋(píng)果愈傷組織，結(jié)果如圖10所示。::轉(zhuǎn)染的愈傷組織熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著高于::。說(shuō)明在蘋(píng)果愈傷組織中，蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性高于擬南芥U6啟動(dòng)子。

3 討論

RNA介導(dǎo)的第3代人工核酸酶技術(shù)CRISPR/Cas9在植物基因功能驗(yàn)證及定向育種中展現(xiàn)出巨大的潛力，但由于序列較長(zhǎng)（大于4 000 bp），且驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的35S啟動(dòng)子長(zhǎng)度也有800 bp，如果構(gòu)建同時(shí)編輯多個(gè)靶點(diǎn)的CRISPR/ Cas9基因編輯載體，序列長(zhǎng)度將達(dá)到15 000 bp，載體過(guò)長(zhǎng)將會(huì)對(duì)細(xì)菌轉(zhuǎn)化和植物組織轉(zhuǎn)染造成困難。因此，篩選合適的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA轉(zhuǎn)錄將為該體系的應(yīng)用提供便利。U6啟動(dòng)子常被用來(lái)驅(qū)動(dòng)sgRNA的轉(zhuǎn)錄。U6啟動(dòng)子屬于RNA聚合酶III識(shí)別的啟動(dòng)子，III型啟動(dòng)子主要是對(duì)tRNA、5S rRNA等含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[8]，因此，U6啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的sgRNA時(shí)具有天然優(yōu)勢(shì)，并且可以確保轉(zhuǎn)錄的sgRNA在細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

圖10 AtU6-1P::LUC和MdU6-10-3P::LUC在蘋(píng)果愈傷組織中瞬時(shí)表達(dá)

此外，U6啟動(dòng)子具有精確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)‘G’堿基，可以有效降低CRISPR/Cas9基因編輯體系的脫靶效應(yīng)。本試驗(yàn)將擬南芥啟動(dòng)子和蘋(píng)果6條候選U6啟動(dòng)子進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6條候選的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)均為‘G’堿基，且均具有RNA聚合酶III發(fā)揮作用所需的上游序列元件USE和TATA-like box。由于U6 snRNA序列高度保守，通過(guò)熒光定量PCR來(lái)比較各U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性并不可行，因此，本試驗(yàn)通過(guò)利用U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的方式對(duì)蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行比較。目前，常用于啟動(dòng)子活性檢測(cè)的報(bào)告基因有[27][28-29]和[30]，本試驗(yàn)選擇為報(bào)告基因，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后檢測(cè)熒光素酶活性對(duì)各啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所選的6條蘋(píng)果U6啟動(dòng)子均具有轉(zhuǎn)錄活性，但轉(zhuǎn)錄活性存在差異，其中MdU6-10P具有較高的轉(zhuǎn)錄活性。前人研究表明，U6啟動(dòng)子在具備必要元件時(shí)即具有轉(zhuǎn)錄活性，反而序列過(guò)長(zhǎng)可能存在一些抑制因子，使較長(zhǎng)的U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性下降[18]。在番茄[21]上，U6啟動(dòng)子被截取到200 bp左右時(shí)仍具有較高的活性，而在棉花[31]上，U6啟動(dòng)子截取到105 bp仍具有較高的活性。KHAOULA等[32]將擬南芥U6啟動(dòng)子截取到79 bp仍可應(yīng)用于基因編輯體系。本研究對(duì)蘋(píng)果10號(hào)染色體上的U6啟動(dòng)子進(jìn)行5′端截短，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性比較，發(fā)現(xiàn)在蘋(píng)果愈傷組織中，長(zhǎng)度為275 bp的蘋(píng)果U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高，表明在蘋(píng)果U6啟動(dòng)子中可能存在一些抑制因子，且存在于5′末端。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果還顯示，116 bp長(zhǎng)度的U6啟動(dòng)子活性雖減弱，但并未喪失轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明蘋(píng)果U6啟動(dòng)子具有必要元件即有轉(zhuǎn)錄活性，而在序列較短時(shí)轉(zhuǎn)錄活性下降可能是因?yàn)槿鄙倭艘恍┰鰪?qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的元件。至于在本氏煙草和蘋(píng)果愈傷組織中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染展現(xiàn)出不同的結(jié)果，或許是因?yàn)槟承┪锓N特異性因子參與其中，導(dǎo)致U6啟動(dòng)子在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種中轉(zhuǎn)錄活性存在一定差異，這與前人得出的結(jié)論一致[6]。植物的不同組織類(lèi)型可能對(duì)U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性也存在一定影響[18]，而蘋(píng)果不同組織類(lèi)型對(duì)U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響程度還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從蘋(píng)果品種‘金冠’中克隆獲得6條長(zhǎng)度為1 500 bp的U6啟動(dòng)子，均具有轉(zhuǎn)錄活性，其中10號(hào)染色體上的U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高，將該啟動(dòng)子從5′端進(jìn)行截短（長(zhǎng)度分別為959、275和116 bp），其中275 bp的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高。此外，在蘋(píng)果愈傷組織中，蘋(píng)果U6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性高于擬南芥U6啟動(dòng)子。

[1] CHEN K L, GAO C X. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements., 2014,33(4): 575-583.

[2] RAN F A, HSU P D, WRIGHT J, AGARWALA V, SCOTT D A, ZHANG F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system., 2013,8(11): 2281-2308.

[3] LI J F, NORVILLE J E, AACH J, MCCORMACK M, ZHANG D D, BUSH J, CHURCH G M, SHEEN J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing inandusing guide RNA and Cas9., 2013,31(8): 688-691.

[4] LIU X J, XIE C X, SI H J, YANG J X. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in plants., 2017,12(1): 94-102.

[5] XING H L, DONG L, WANG Z P, ZHANG H Y, HAN C Y, LIU B, WANG X C, CHEN Q J. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants., 2014,14(1): 327.

[6] DAS G, HENNING D, REDD R. Structure, organization, and transcription of Drosophila U6 small nuclear RNA genes., 1987,262(25): 1187-1193.

[7] TAZI J, FORNE T, JEANTEUR P, CATHALA G, BRUNEL C. Mammalian U6 small nuclear RNA undergoes 3' end modifications within the spliceosome., 1993,13(3): 1641-1650.

[8] BERGET S M, ROBBERSON B L. U1, U2, and U4/U6 small nuclear ribonucleoproteins are required for in vitro splicing but not polyadenylation., 1986,46(5): 691-696.

[9] BLACK D L, STEITZ J A. Pre-mRNA splicing in vitro requires intact U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein., 1986,46(5): 697-704.

[10] WAIBEL F, FILIPOWICZ W. U6 snRNA genes ofare transcribed by RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNA polymerase ll-transcribed U-snRNA genes., 1990,18(12): 3451-3458.

[11] BOGENHAGEN D F, SAKONJU S, BROWN D D. A control region in the center of the 5S RNA gene directs specific initiation of transcription: II. The 3' border of the region., 1980,19(1): 27-35.

[12] GEIDUSCHEK E P, TOCCHINI-VALENTINI G P. Transcription by RNA polymerase III., 1988,57(59): 873-914.

[13] MALI P, YANG L H, ESVELT K M, AACH J, GUELL M, DICARLO J E, NORVILLE J E, CHURCH J M. RNA-guided human genome engineering via Cas9., 2013,339(6121): 823-826.

[14] MA H M, WU Y G, DANG Y, CHOI J G, ZHANG J L, WU H Q. Pol III promoters to express small RNAs: Delineation of transcription initiation., 2014,3(5): e161.

[15] PAUL C P, GOOD P D, WINER I, ENGELKE D R. Effective expression of small interfering RNA in human cells., 2002,20(5): 505-508.

[16] KWAK Y D, KOIKE H, SUGAYA K. RNA interference with small hairpin RNAs transcribed from a human U6 promoter-driven DNA vector., 2003,93(2): 214-217.

[17] JIANG W Z, ZHOU H B, BI H H, FROMM M, YANG B, WEEKS D P. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in, tobacco, sorghum and rice., 2013,41(20): e188.

[18] LI X, JIANG D H, YONG K, ZHANG D B. Varied transcriptional efficiencies of multiplesmall nuclear RNA genes., 2007,49(2): 222-229.

[19] SHAN Q W, WANG Y P, LI J, ZHANG Y, CHEN K L, LIANG Z, ZHANG K, LIU J X. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system., 2013,31(8): 686-688.

[20] 李繼洋, 雷建峰, 代培紅, 姚瑞, 曲延英, 陳全家, 李月, 劉曉東. 基于棉花 U6 啟動(dòng)子的海島棉CRISPR/Cas9基因組編輯體系的建立. 作物學(xué)報(bào), 2018,44(2): 227-235.

LI J Y, Lei J F, Dai P H, Yao R, Qu Y Y, Chen Q J, Li Y, Liu X D. Establishment of CRISPR/Cas9 genome editing system based on GbU6 promoters in cotton (L.)., 2018, 44(2): 227-235. (in Chinese)

[21] 蒲艷, 劉超, 李繼洋, 阿爾祖古麗·塔什, 胡燕, 劉曉東. 番茄 U6 啟動(dòng)子的克隆及 CRISPR/Cas9 基因編輯體系的建立. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(2): 315-326.

PU Y, Liu C, Li J Y, Alzu G T, Hu Y, Liu X D. Differentpromoters cloning and establishment of CRISPR/Cas9 mediated gene editing system in tomato., 2018, 51(2): 315-326. (in Chinese)

[22] FENG Z Y, ZHANG B T, DING W N, LIU X D, YANG D L, WEI P L. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system., 2013,23(10): 1229-1232.

[23] JACOBS T B, LAFAYETTE P R, SCHMITZ R J, PARROTT W A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9., 2015,15(1): 1-10.

[24] NISHITANI C, HIRAI N, KOMORI S, WADA M, OKADA K, OSAKABE K, YAMAMOTO T, OSAKABE Y. Efficient genome editing in appleusing a CRISPR/Cas9 system., 2016,6: 31481.

[25] 朱金潔. CRISPR_Cas9介導(dǎo)的玉米基因組定點(diǎn)編輯研究[D]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

ZHU J J. Targeted genome editing in maize using CRISPR-Cas9 [D]. Beijing: China Agricultural University, 2015. (in Chinese)

[26] WANG M B, HELLIWELL C A, WU L M, WATERHOUSE P M, PEACOCK W J, DENNIS E S. Hairpin RNAs derived from RNA polymerase II and polymerase III promoter-directed transgenes are processed differently in plants., 2008,14(5): 903-913.

[27] JEFFERSON R A, KAVANAGH T A, BEVAN M W. GUS fusions: Beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants., 1987,6(13): 3901-3907.

[28] CHIU W L, NIWA Y, ZENG W K, HIRANO T, KOBAYASHI H, SHEEN J. Engineered GFP as a vital reporter in plants., 1996,6(3): 325-330.

[29] ZHANG G H, GURTU V, KAIN S R. An enhanced green fluorescent protein allows sensitive detection of gene transfer in mammalian cells., 1996,227(3): 707-711.

[30] WELSH S, KAY S A. Reporter gene expression for monitoring gene transfer., 1997,8(5): 617-622.

[31] 雷建峰. 棉花U6啟動(dòng)子克隆與功能分析及擬南芥GGB突變體的創(chuàng)制[D]. 烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

LEI J F. Cloning and functional analysis of U6 promoters in cotton and creation ofGGB mutant [D]. Urumqi: Xinjiang Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[32] KHAOULA B, ANGELA C G, SOPHIEN K, NEKRASOV V. Plant genome editing made easy: Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system., 2013,9(1): 39.

Cloning and Functional Analysis of U6 Promoter in Apple

BIAN ShuXun, HAN XiaoLei, YUAN GaoPeng, ZHANG LiYi, TIAN Yi, ZHANG CaiXia, CONG PeiHua

(Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Fruit Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture/National Apple Breeding Center, Xingcheng 125100, Liaoning)

【】U6 promoter is an important element for the transcription of sgRNA in the CRISPR/Cas9 genome editing system. There may be species-specific factors in U6 promoter, and the activity of U6 promoter would be altered when its length changed. So far, in apple (), the transcriptional characterization of U6 promoters has not been reported. Therefore, selecting an apple U6 promoter with high transcriptional activity and suitable fragment size would provide a basis for optimizing apple CRISPR/Cas9 gene editing technology system. 【】DNAMAN, promoter cis element online predicting website PLACE and plant CARE were used to do the comparative analysis of apple U6 promoters; U6 promoters were cloned and constructed into firefly luciferase vector; the apple callus and tobacco () leaves were transformed via-mediated transient transformation; the transcriptional activity of U6 promoter was determined according to the luciferase activity. 【】There were six alternative U6 promoters in apple genome (E-value＜3e-40), which were located on chr 6, chr 7, chr 9, chr 10, chr 15 and chr 17, respectively. 27 bp snRNA at 5′ end and its upstream 1 500 bp were selected as candidate U6 promoter. Sequence analysis results showed that the upstream sequence element (USE) and TATA-like elements were contained in six U6 promoters of apple, the same as. After transient transformation, the luciferase activity assay showed that, the U6 promoter on chromosome 10 had the highest transcriptional activity. Among all U6 promoters which were shortened at 5′ end (1 500 bp, 959 bp, 275 bp, and 116 bp) on chromosome 10, the 275 bp one had the highest transcriptional activity. In addition, compared with the Arabidopsis U6 promoter, in apple callus, the transcriptional activity of the apple U6 promoter was higher. 【】Six U6 promoters were cloned from the apple genome, and a U6 promoter with high transcriptional activity and suitable sequence fragment was obtained.

; U6 promoter; luciferase;; callus

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.016

2019-07-31；

2019-09-19

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-27）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2016-RIP -02）、遼寧省博士科研啟動(dòng)基金（20180540030）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（1610182019007）

卞書(shū)迅，E-mail：bb18236767941@163.com。韓曉蕾，E-mail：hanxiaolei@caas.cn。卞書(shū)迅與韓曉蕾為同等貢獻(xiàn)作者。

張彩霞，Tel：0429-3598135；E-mail：cxzhang-bj@163.com。通信作者叢佩華，Tel：0429-3598103；E-mail：congph@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）