招春飛 李文生 廖淑珍 王思捷 劉華鋒 潘慶軍

(湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎臟疾病研究所，湛江 524001)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID)指機體的免疫系統(tǒng)對自身的組織結構抗原產生免疫應答，進而造成自身組織損害所引起的一類疾病，典型疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)和類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)等。SLE是一種女性高發(fā)，特別是育齡期女性，可累及多系統(tǒng)的(腎臟、皮膚、血液、神經系統(tǒng)等)，高度個體化的自身免疫性疾病[1,2]。RA是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。其特征是手、足小關節(jié)的多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥，經常伴有關節(jié)外器官受累及血清類風濕因子陽性，可以導致關節(jié)畸形及功能喪失[3,4]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是不能編碼蛋白質的RNA，各種生命體內廣泛存在，具有調控生命活動的作用。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類特殊的非編碼RNA，在真核細胞中廣泛存在，為閉合環(huán)狀結構的RNA，與線性RNA不同，其由前體RNA(pre-mRNA)的3′末端和5′末端共價結合形成的內源性ncRNA，具有物種間序列保守和結構穩(wěn)定，以及細胞或組織特異性表達等特征[5]，在過去被認為是錯誤剪接所產生的。據現有文獻報道，circRNA主要有3 種來源形式：第一種僅由外顯子組成的外顯子環(huán)狀RNA(exonic circular RNAs,ecircRNAs)是通過5′端-3′端連接成環(huán)，片段大小各異，可充當競爭性內源RNA(ceRNA)結合天然微小RNA(miRNA)并阻斷其對靶基因表達的抑制作用，如作為miRNA的分子“海綿”發(fā)揮功能[6-9]；第二種源自內含子套索的circRNA是通過5′-2′末端連接成環(huán)，片段大小各異，存在較穩(wěn)定[10]；第三種同時包含外顯子和內含子的circRNA(eIciRNAs)，其片段大小為250～400 nt[11]。近年來，circRNA在SLE和RA中的研究備受關注[12]，研究發(fā)現，circRNA可通過多種途徑發(fā)揮作用：可充當為miRNA的分子海綿(miRNA sponge)調控其表達[13-15]；參與調節(jié)基因的轉錄[16-18]；與蛋白結合互作調節(jié)[19,20]；參與蛋白翻譯等生物學功能[21-23]。由此，circRNA具備強大的生物學功能，其在SLE和RA發(fā)病中的作用和機制，概述如下。

1 circRNA與系統(tǒng)性紅斑狼瘡

SLE的發(fā)病主要由遺傳背景和環(huán)境互作介導，近年發(fā)現，SLE在血漿、PBMC或腎組織等組織中的circRNA表達異常[24]，并可通過多種模式，如作為miRNA sponge調控其表達等參與SLE發(fā)病[25,26]。

有研究報道，SLE患者PBMC中circIBTK源自IBTK基因位點的hsa_circ_0077179，表達顯著下調，并與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體呈負相關[27]，與補體C3水平呈正相關；SLE患者中miR-29b的表達顯著上調，并與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平呈正相關，與補體C3水平則呈負相關。另外，miR-29b可誘導DNA去甲基化[28-30]，可能與SLE患者常見的DNA去甲基化相關[31,32]。且miR-29b誘導DNA去甲基化后，可激活AKT信號通路，而circIBTK可能通過與SLE患者中的miR-29b結合，抑制miR-29b誘導的DNA去甲基化，從而阻止AKT信號通路的激活[27]。有研究證明SLE患者淋巴細胞中Akt-473和GSK3β(ser9)的磷酸化水平升高，Akt-GSK3β信號通路的異常激活增加了狼瘡淋巴細胞的增殖[33]。另有研究證實了SLE患者所有B淋巴細胞亞群中Akt-1(PKB)的磷酸化增加，這是PI3激酶的關鍵下游靶標，PI3激酶調節(jié)增殖、存活和分化，PI3激酶活性受損會導致免疫缺陷，而其活性增強會導致自身免疫性疾病[34]。PTEN在SLE患者中低表達，PTEN表達水平與疾病活動呈負相關[32]。此研究發(fā)現PTEN可能是miR-29b的潛在靶標，并驗證了circIBTK的上調促進了PTEN的表達并抑制了AKT的磷酸化，miR-29b的過表達顯著減弱了circIBTK誘導的PTEN表達的增加和AKT信號通路的失活，因此，circIBTK的下調導致PTEN表達降低，從而增加AKT的磷酸化；敲低miR-29b后可以顯著逆轉circIBTK抑制誘導的PTEN下調和AKT信號通路的激活[27]。綜上提示，circIBTK和miR-29既可作為SLE的生物標志物，也可作為潛在的治療靶點。

Luan等[35]研究了初發(fā)狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)患者的腎組織中的circRNA譜和circRNA與miR-150之間的相互作用。在人腎組織中共鑒定出18 505個circRNA，與正常的腎組織相比，LN患者中有11 411個上調和7 094個下調的circRNA，其中171個在兩組之間差異顯著。選擇142個顯著上調的circRNA進行GO富集分析，發(fā)現其參與多種生物學功能，如調節(jié)樹突狀細胞(DC)的分化、細胞質mRNA加工體的組裝、MHC蛋白復合物和肽抗原的結合等。研究顯示，過表達的circRNA可能通過調節(jié)上述生物學功能在LN的發(fā)病中起作用。KEGG分析揭示了缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路和神經營養(yǎng)因子信號通路都參與調節(jié)NF-κB的表達，而NF-κB可通過增加炎癥反應而促進LN的進展[36]。此研究發(fā)現7個驗證的circRNA包括circHLA-C、circZNF609、circEKL4、circFAM188A、circUBR5、circPDE4B和circSP100在LN組織中顯著上調。其中，circHLA-C與24 h尿蛋白排泄率、總腎小球中新月體腎小球占的百分比和腎臟活動指數呈顯著正相關，有與血清肌酐呈正相關的趨勢，與LN疾病活動度呈正相關，研究提示，circHLA-C可能參與LN的發(fā)病。該課題組還發(fā)現circHLA-C和miR-150存在負相關，并存在相互結合的位點。在新發(fā)的Ⅳ期LN患者中，發(fā)現上調的circHLA-C可能通過結合miR-150，促進腎臟損傷，包括腎小球中新月體的形成和蛋白尿的排泄等。綜上提示，circHLA-C可能通過分子海綿miR-150在LN的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[35]。

Li等[37]報道，大量circRNA在SLE患者與正常人血漿存在差異表達，包括113個上調和94個下調等，其中，has_circ_102584、has_circ_400011和has_ circ_101471在SLE患者中顯著上調，has_circ_100226在SLE患者中顯著下調。Zhang等[38]也報道了血漿和PBMC中有112個circRNA存在差異表達，包括53個上調和59個下調，其中hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308在SLE患者血漿和PBMC中下調，hsa_circRNA_001308的表達與血漿中的CRP和抗SSA及PBMC中的白細胞減少相關，hsa_circRNA_406567與血漿中的抗RNP相關。Li等[39]在SLE患者和健康對照組T細胞的circRNA表達譜中發(fā)現127個差異表達的circRNA，其中hsa_circ_0045272在SLE患者T細胞中顯著降低，hsa_circ_0045272可能通過下調其特定的ceRNA NM_003466(PAX8)的表達而負調控T細胞凋亡和IL-2的產生，提示hsa_circ_0045272在T細胞活化中發(fā)揮重要作用[39]。

Miao等[40]通過RNA高通量測序(RNA-seq)分析SLE患者和健康人PBMC circRNA的表達，選擇了兩個上調的circRNA(circLRRK2和circPPHLN1)和兩個下調的circRNA(circPTPN22和circMY-BL1)，確定了一個從未發(fā)表的circRNA，此circRNA命名為circPTPN22，是蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型(PTPN22)的親本基因，PTPN22已被反復證明與SLE有關[41,42]。此研究結果顯示SLEDAI評分高患者比SLEDAI評分較低患者的circPTPN22表達水平要低，所有SLE患者治療前circPTPN22的表達水平比健康對照組的低，反映了circPTPN22表達水平與SLE患者的SLEDAI得分呈負相關[40]；此外SLEDAI評分較高的患者經過長期激素治療可顯著提高circPTPN22水平，因此推斷circPTPN22不僅與SLE疾病嚴重程度顯著相關，而且還可能反映了SLE患者的治療效果。但是其臨床意義和潛在機制仍未明確，例如，總淋巴細胞、單核細胞和/或CD4+或CD8+T細胞是否表達相同水平的circPTPN22,治療是否會引起這些細胞亞群數量的任何變化。

Zhang等[43]在SLE患者和健康對照組CD4+T細胞經過circRNA基因芯片分析得到circRNA表達譜。SLE患者組中有12個circRNA上調，而2個circRNA下調。SLE患者hsa_circ_0012919水平比健康對照組顯著上調，SLE患者合并關節(jié)損害、LN、抗dsDNA(+)、抗Sm(+)、C3或C4缺乏癥的hsa_circ_0012919表達明顯高于無這些癥狀的患者，hsa_circ_0012919表達與C3和C4水平呈負相關，并且未接受藥物治療的患者的hsa_circ_0012919表達明顯高于治療后的患者。數據顯示hsa_circ_0012919與CD70和CD11a表達呈正相關，與DNMT1的表達呈負相關，推測hsa_circ_0012919可能與SLE的CD4+T細胞DNA甲基化異常有關。此研究發(fā)現hsa_circ_0012919和miR-125a在細胞質中共定位，表明hsa_circ_0012919與miR-125a結合，hsa_circ_0012919與狼瘡CD4+T細胞中miR-125a-3p的表達呈負相關。一些學者證明了miR-125a可以調控RNATES和KLF13，而miR-125a-3p可以作為miR-125a的活性片段，因此推測hsa_circ_0012919通過miR-125a-3p來調控RNATES和KLF13。并發(fā)現hsa_circ_0012919與狼瘡CD4+T細胞中RNATES和KLF13的表達呈負相關，而miR-125a-3p降低了RNATES和KLF13的表達，hsa_circ_0012919逆轉并增加了RNATES和KLF13的表達。為了證明hsa_circ_0012919與miR-125之間存在直接關系，進行了劑量依賴性實驗。結果表明，RNATES和KLF13的表達呈劑量依賴性，受miR-125和hsa_circ_0012 919的影響[43]。以上結果表明hsa_circ_0012919可能通過miR-125a調控KLF13和RANTES。因此hsa_circ_0012919可作為SLE的生物標記物，hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的ceRNA。

2 circRNA與RA

RA是一種慢性全身性自身免疫疾病，其特征為慢性關節(jié)炎，主要損傷關節(jié)滑膜，導致關節(jié)進行性損傷、殘疾和死亡[44]。其病因迄今為止尚不明確。環(huán)境因素、遺傳背景以及IL-27、IL-35、TNF-α等促炎因子已被證實與RA的發(fā)病有關[45,46]，circRNA可作為miRNA的分子海綿發(fā)揮其生物學功能調節(jié)RA的發(fā)病機制。circRNA在RA中的研究剛剛興起，其在RA的診斷和治療中都可能發(fā)揮重要作用。

最近報道，在RA患者與健康人的PBMC中，檢測到12個差異表達的circRNA，其中9個上調，3個下調[47]。circRNA微陣列分析和qRT-PCR驗證鑒定出RA患者PBMC中的circRNA_092516、circ-RNA_003524、circRNA_103047、circRNA_104871和circRNA_101873表達與來自健康對照組呈顯著差異并上調，表明這些circRNA可能參與RA的發(fā)病。雖然，這些差異表達的circRNA與疾病活動評分(DAS28)、紅細胞沉積率(ESR)、C反應蛋白(CRP)和健康評估問卷(HAQ)無關，表明這些circRNA可能不是RA患者疾病嚴重性或全身性炎癥的相關生物標志物，但這些circRNA的表達水平存在部分相關，例如circRNA_003524的表達水平與circRNA_103047相關。為了評估顯著差異表達的circRNA對RA診斷的潛在價值，Ouyang[47]進行了ROC曲線分析。確認的circRNA的ROC曲線顯示PBMC中circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873和circRNA_103047的水平可以將RA患者與健康對照組區(qū)分，并發(fā)現circRNA_104871的AUC值最高(AUC：0.833,95%CI 0.721-0.944，P<0.001)，因此，其顯示出最高的ROC AUC值，表明circRNA_104871具有診斷RA生物標志物的高潛力。這些circRNA可能存在直接或間接相互作用，這需要進一步的實驗來驗證。

另有報道，與健康人比較，RA患者外周血血漿中circRNAs(如hsa_circ_0054189，hsa_circ_0008675，hsa_circ_0082689，hsa_circ_0082688，hsa_circ_0010932，hsa_circ_0002473和hsa_circ_0044235)的表達，只有hsa_circ_0044235顯著減少[48]，推測hsa_circ_0044235可能與RA有關，但其水平與類風濕因子(RF)、抗膽堿蛋白抗體ACPA、 CRP、 ESR和DAS28無關，表明外周血中的hsa_circ_0044235可能不能用作RA中全身性炎癥或疾病活動的標志物。但該研究發(fā)現外周血hsa_circ_0044235的AUC高達0.779,基于外周血的hsa_circ_0044235風險評分表明，其表達水平可以有效地區(qū)分RA患者與SLE患者，提示外周血中的hsa_circ_0044235可以特異性識別RA患者，并且診斷準確性更高。經靶標軟件預測，hsa_circ_0044235具有hsa-miR-892a、hsa-miR-135b-5p和hsa-miR-135a-5p三個miRNA靶標，經RA患者外周血檢測發(fā)現，僅has-miR-892a的表達水平顯著升高[48]。推測hsa_circ_0044235可能通過與hsa-miR-892a相互作用，參與RA發(fā)病，當然需要進一步的研究來證實這一假設。

另有報道，通過提取RA患者和健康對照組PBMC的總RNA，并進行circRNA表達譜分析，發(fā)現RA患者的PBMC中的hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794水平顯著上調，而hsa_circ_0088088、hsa_circ_0038644水平則顯著下調。hsa_circ_0088088是RA中最顯著下調的circRNA，hsa-miR-16-5p是hsa_circ_0088088的miRNA反應元件(MRE)之一，意味著hsa-miR-16-5p顯著增加；RA患者中，miR-16主要與疾病的活動程度相關，例如ESR、CRP、關節(jié)壓痛計數(TJC)和TNF-α、DAS28等指標呈正相關；因此可以推斷hsa_circ_0088088可能通過miR-16在RA的發(fā)病機理中起重要作用[49]。盡管該研究未針對RA的病理生理和分子機制選擇和驗證特定的circRNA，但該研究可能為RA的早期診斷和發(fā)病機理提供新的觀點，circRNA在RA的發(fā)展和進程中的作用機制需要進一步深入研究。

3 展望

新近發(fā)現，SLE和RA患者血清和細胞中部分circRNAs的水平顯著上調或下調，其一方面可作為SLE和RA診斷或疾病活動度判斷的新型生物標志物，另一方面可通過與microRNA等靶標相互作用，參與其發(fā)病，但其機制尚不完全清楚，仍需系統(tǒng)和深入地研究其具體表達和調控的分子機制?？傊?，靶向circRNA有望為SLE和RA的診斷及治療提供新思路。