陸 峰 陳威鵬 顏 勛 于建秀 錢 雷③

(濱?？h人民醫(yī)院普外科，鹽城 224500)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的具有高死亡率的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在許多國(guó)家都在增加，每年在全世界范圍內(nèi)影響超過120萬人[1]。患者腫瘤組織內(nèi)含有較多腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和單核巨噬細(xì)胞，其中，巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞群，作為先天免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)腫瘤組織內(nèi)免疫細(xì)胞的功能[2]。巨噬細(xì)胞可通過表達(dá)程序性細(xì)胞死亡蛋白配體1(PD-L1)與T淋巴細(xì)胞表面程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞增殖和活化，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用下降，引起腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[3]。研究表明，腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞與乳腺癌等腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[4]，但結(jié)直腸癌腫瘤組織中巨噬細(xì)胞比例及其PD-L1表達(dá)，及其對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響缺乏研究，本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌腫瘤組織中巨噬細(xì)胞比例及其PD-L1表達(dá)，探討其在結(jié)直腸癌中的作用。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 選擇2017年1月～2018年8月在濱海縣人民醫(yī)院住院結(jié)直腸癌患者26例，收集手術(shù)切除的組織標(biāo)本，所有患者病理結(jié)果確診為結(jié)直腸癌。分別取離體30 min內(nèi)腫瘤邊緣組織和距離腫瘤組織5 cm的相匹配的癌旁良性組織0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm作為癌組織和癌旁組織，立即放入裝有4℃ 磷酸鹽緩沖液(PBS)的保存管內(nèi)。納入標(biāo)準(zhǔn)：病例均為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前未行任何放、化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者伴感染、自身免疫性疾病。患者年齡(62.9±5.3)歲，其中男性18例，女性8例。結(jié)腸癌13例，直腸癌13例；組織類型：管狀腺癌20例，黏液腺癌6例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期18例，該研究由濱?？h人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.2儀器和試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和單核細(xì)胞系THP-1購自上海生物細(xì)胞研究所；異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人CD3單克隆抗體(mAb)、藻紅蛋白(PE)-鼠抗人CD4 mAb、葉綠素蛋白(PerCP)-cy5.5鼠抗人CD8 mAb、FITC-鼠抗人CD64 mAb、PE-鼠抗人CD11b mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人PD-L1 mAb、PerCP-cy5.5鼠抗人CD163 mAb、別藻青蛋白(APC)鼠抗人-CD206 mAb和紅細(xì)胞裂解液均為BD Biosciences產(chǎn)品；用于增殖測(cè)定的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)購自Thermo Fisher；膠原酶-P購自Sigma公司；細(xì)胞濾網(wǎng)購自美國(guó)BD Falcon公司；抗PD-1抗體購自Bristol-Myers Squibb公司；RPMI1640和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Invitrogen公司；采用美國(guó)BD CantoⅡ流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記。

1.2方法

1.2.1腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分離 根據(jù)文獻(xiàn)[5]分離腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，將新鮮癌組織和癌旁組織在含有抗生素(慶大霉素和青霉素)的PBS中洗滌，用無菌手術(shù)刀機(jī)械解離組織，將樣品切成約1 mm3的組織塊，并在PBS中加入膠原酶P(1 mg/ml)酶促消化，在37℃、5%CO2輕輕搖動(dòng)30 min。將上清液用70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過篩，用含10% 胎牛血清(FBS)和抗生素的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，終濃度為2×105個(gè)/ml。在完成分離方案后，立即熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)志。

1.2.2巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)及單個(gè)核細(xì)胞分離 先將單核細(xì)胞系THP-1誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，將THP-1細(xì)胞接種在24孔板(5×105個(gè)/孔)，在RPMI1640培養(yǎng)基中加入佛波酯(100 ng/ml)刺激培養(yǎng)24 h，懸浮的單核細(xì)胞分化為貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞。采用Ficoll-Hypaque密度離心法獲得健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，濃度為2×105個(gè)/ml，接種于24孔板。

1.2.3細(xì)胞共培養(yǎng)體系 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×105個(gè)/孔)，分別將巨噬細(xì)胞(2.5×105個(gè)/室)和單個(gè)核細(xì)胞(2.5×105個(gè)/室)接種于Transwell小室，然后將Transwell小室置于6孔板上，建立非接觸共培養(yǎng)體系，在37℃和5%CO2下共孵育5 d(共培養(yǎng)組)，以不含人結(jié)腸癌細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞的共培養(yǎng)體系為空白對(duì)照組。收集共培養(yǎng)細(xì)胞,PBS洗滌后,根據(jù) CD64+CD11b+陽性選取巨噬細(xì)胞,然后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD163、CD206及PD-L1陽性細(xì)胞比例；根據(jù)CD3選取淋巴細(xì)胞，檢測(cè)CD4+,CD8+T細(xì)胞表面PD-1陽性率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取100 μl巨噬細(xì)胞和/或單個(gè)核細(xì)胞懸液，加入10 μl FITC-鼠抗人CD3 mAb、10 μl PE-鼠抗人CD4 mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人CD8 mAb及APC-鼠抗人PD-1 mAb；取100 μl 細(xì)胞懸液，加入10 μl FITC-鼠抗人CD64 mAb、10 μl PE-鼠抗人CD11b mAb、10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人PD-L1 mAb、或10 μl PerCP-cy5.5鼠抗人CD163 mAb、或10 μl APC鼠抗人-CD206 mAb標(biāo)記細(xì)胞，并在4℃下黑暗中孵育30 min，然后用PBS洗滌并重懸。同時(shí)用匹配的同種型抗體用作陰性對(duì)照。使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)記。根據(jù)腸道巨噬細(xì)胞表面CD64+CD11b+表達(dá)，檢測(cè)組織中巨噬細(xì)胞比例[6]。

1.2.5增殖試驗(yàn) PBMC、巨噬細(xì)胞與人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480共培養(yǎng)，用不含有腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)體系作對(duì)照組，加入終濃度為5 μg/ml抗-PD-1抗體阻斷PD-L1/PD-1相互作用，在37℃和5%CO2下共孵育5 d。此后用CFSE-FITC對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)增殖。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中免疫細(xì)胞比例 與癌旁組織相比，腫瘤組織中巨噬細(xì)胞和CD4+/CD3+T細(xì)胞比例顯著上升，CD8+/CD3+T細(xì)胞比例顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.2結(jié)直腸癌組織巨噬細(xì)胞表面分子檢測(cè) 根據(jù)CD64+CD11b+陽性選取巨噬細(xì)胞，然后檢測(cè)其表面PD-L1、CD206和CD163表達(dá)(圖1)。與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞PD-L1、CD206和CD163陽性細(xì)胞比例顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表1 結(jié)直腸癌與癌旁組織浸潤(rùn)細(xì)胞比較

Tab.1 Comparison of infiltrating cells between colorectal cancer and adjacent tissues

GroupsnMacrophages(%)CD4+/CD3+T cell(%)CD8+/CD3+T cell(%)Cancer tissue265.6±0.61)20.9±6.41)4.6±1.71)Paracancerous tissue260.9±0.30.8±0.341.4±10.5 t35.7215.9917.64P<0.001<0.001<0.001

Note：Cancer tissue vs paracancerous tissue，1)P<0.05.

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者巨噬細(xì)胞分子的表達(dá)Fig.1 Analysis of molecules expression on macrophages in colorectal cancer by flow cytometryNote: A.Percentage of PD-L1 positive macrophage;B.Percentage of CD206 positive macrophage;C.Percentage of CD163 positive macrophage.

表2 結(jié)直腸癌與癌旁組織浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞表面分子比較

Tab.2 Comparison of molecules expression on macropha-ges between colorectal cancer and adjacent tissues

GroupsnPD-L1(%)CD206(%)CD163(%)Cancer tissue2613.6±2.61)12.9±2.41)14.6±2.71)Paracancerous tissue262.9±0.72.8±0.8 2.4±0.8 t20.2620.3522.09P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs paracancerous tissue，1)P<0.05.

2.3與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá) 與對(duì)照組相比，與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表面PD-L1、CD206和CD163表達(dá)顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表3。

2.4與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞表面PD-1檢測(cè) 與對(duì)照組相比，與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表4。

2.5與結(jié)腸癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 與空白對(duì)照組相比，與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖率顯著下降，與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞共培養(yǎng)組相比，抗-PD-1對(duì)照組淋巴細(xì)胞增殖率顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表5。

表3 與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)

Tab.3 Molecules expression on macrophage surface co-cultured with colon cancer cells

GroupsPD-L1(%)CD206(%)CD163(%)Co-culture group14.2±2.11)32.6±6.51)35.1±5.81)Control group6.3±1.412.9±3.320.2±4.6t15.9613.7710.26P<0.001<0.001<0.001

Note：Vs control group，1)P<0.05.

表4 共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞表面PD-1陽性率比較

Tab.4 Percentage of PD-1 positive lymphocytes co-cultured with colon cancer cells

GroupsCD4+T cell PD-1(%)CD8+T cell PD-1(%)Co-culture group4.7±2.51)2.8±0.61)Control group1.5±0.51.1±0.3t6.4012.92P<0.001<0.001

Note：Vs control group,1)P<0.05.

表5 共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖率比較

Tab.5 Proliferative rates of lymphocyte co-cultured with macrophage and SW480 cells

GroupsCD4+T cell(%)CD8+T cell(%)Control group28.5±7.51)26.3±4.51)Co-culture group13.3±2.214.4±2.5Co-culture group+Anti-PD-123.1±5.22)21.2±2.42)F56.461.2P<0.001<0.001

Note：Vs co-culture group，1)P<0.05；vs co-culture group，2)P<0.05.

3 討論

機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用在腫瘤進(jìn)展中起著重要作用，腫瘤的免疫編輯理論認(rèn)為，在腫瘤細(xì)胞逃逸期，腫瘤快速生長(zhǎng)形成一個(gè)抑制免疫細(xì)胞的微環(huán)境。在此微環(huán)境中，可識(shí)別并消除腫瘤細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞等，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)功能受損，在體外分離和培養(yǎng)時(shí)增殖能力和細(xì)胞因子分泌功能降低[7]，另一方面，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)、腫瘤相關(guān)粒細(xì)胞和髓系來源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。TAM分泌高水平的IL-10和低水平的IL-12，促進(jìn)血管的生成、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，通過癌癥疫苗接種、免疫檢查點(diǎn)治療和過繼性CTL轉(zhuǎn)移治療等免疫療法可調(diào)節(jié)腫瘤組織浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的功能，最大化CTL的殺腫瘤能力，抑制TAM等的促腫瘤作用。

腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組織部分，代表了宿主對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答的狀態(tài)。本次研究證實(shí)，與癌旁組織相比，腫瘤組織中巨噬細(xì)胞和CD4+/CD3+T細(xì)胞比例顯著上升，CD8+/CD3+T細(xì)胞比例顯著下降。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是實(shí)體腫瘤中最豐富的細(xì)胞類型，其向腫瘤的浸潤(rùn)與大多數(shù)實(shí)體瘤的預(yù)后不良有關(guān)[9]。Galon等[10]研究表明，原發(fā)性結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞比例降低與腫瘤侵襲性和分期增加有關(guān)，患者存活率下降，臨床預(yù)后不良。卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和膽道癌的不良預(yù)后也與腫瘤浸潤(rùn)低比例的CD8+T細(xì)胞相關(guān)[11]。上述結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為宿主防御的第一線，通過識(shí)別和響應(yīng)腫瘤細(xì)胞，在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中起重要作用。

巨噬細(xì)胞是一類極具異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在體內(nèi)外不同的微環(huán)境下，表現(xiàn)出獨(dú)特的表型，并具有功能的差異。根據(jù)功能的差異，巨噬細(xì)胞主要分為經(jīng)典型(M1)或替代型(M2)。M1巨噬細(xì)胞負(fù)責(zé)促進(jìn)炎癥、抗腫瘤和免疫反應(yīng)，M2巨噬細(xì)胞也稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，參與腫瘤血管生成[12]。TAMs來源于循環(huán)單核細(xì)胞，由腫瘤細(xì)胞分泌的單核細(xì)胞趨化因子CCL2/MCP-1募集到腫瘤部位，腫瘤細(xì)胞通過分泌腫瘤細(xì)胞因子和前列腺素等多種機(jī)制抑制巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用[13]。本次研究通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證，腫瘤浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD163和CD206，呈M2極化。Li等[14]研究證實(shí)高比例的M2巨噬細(xì)胞極化與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞高表達(dá)PD-L1。在特異性免疫應(yīng)答中，巨噬細(xì)胞表面PD-L1與T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)PD-1受體結(jié)合，通過傳遞的內(nèi)在負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，抑制其發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。本次研究通過體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)上升。腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放一些具有免疫抑制功能的分子，如TGF-β、IL-10等，并能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA-4)，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞無反應(yīng)性，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤的免疫耐受[16]。

巨噬細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，還參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過表達(dá)PD-L1與T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞功能。從小鼠和人類實(shí)體腫瘤分離的巨噬細(xì)胞在體外可直接抑制T細(xì)胞反應(yīng)和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性[17]。本次研究證實(shí)，與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖下降，此抑制作用可被抗-PD-1抗體部份阻斷，表明巨噬細(xì)胞通過高表達(dá)PD-L1與PD-1+T細(xì)胞相互作用。與此一致的是，Wu等[18]證實(shí)結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴結(jié)中CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)顯著上調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-2和IFN-γ)和穿孔素功能力下降。在乳腺癌小鼠模型中，去除TAM增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫力[19]，TAM與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的物理接觸抑制了T細(xì)胞的完全活化并阻止其進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[20]，因此，抑制TAM是提高免疫療法療效的重要方法[21]。

綜上所述，本研究表明結(jié)直腸癌腫瘤組織中存在高比例的巨噬細(xì)胞，CD8+/CD3+T淋巴細(xì)胞比例降低，且巨噬細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，淋巴細(xì)胞高表達(dá)PD-1。通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤微環(huán)境可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PD-L1和淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)，巨噬細(xì)胞通過PD-L1與PD-1+T細(xì)胞相互作用抑制T細(xì)胞增殖，從而降低T細(xì)胞免疫功能，可能在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過程中發(fā)揮作用。因此對(duì)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)和PD-1/PD-L1信號(hào)通路的抑制對(duì)于CRC的治療具有重要的作用。