鞏子漢 段永強(qiáng) 成映霞 虎峻瑞 王 強(qiáng) 付曉艷 白 敏

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000)

胃潰瘍(gastric ulcer，GU)作為一種常見多發(fā)的消化性潰瘍疾病，臨床遷延難愈、易反復(fù)發(fā)作[1]。研究表明物理刺激及化學(xué)反應(yīng)等均可致使胃黏膜發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，促炎癥細(xì)胞因子的大量釋放也是胃潰瘍發(fā)病的主要因素[2]。白芨味苦性微寒，有止血消腫，生肌斂瘡之功效，與黃連、貝母、輕粉等配伍可治療瘡癰已潰，久不收口者。正如《神農(nóng)本草經(jīng)》所載：“白芨味苦，主癰腫，敗疽，胃中邪氣，惡瘡不收”。白芨的主要化學(xué)成分為白芨多糖，其可促進(jìn)大鼠胃潰瘍創(chuàng)面的愈合，其機(jī)制可能與白芨多糖可以提高創(chuàng)面羥脯氨酸含量，促進(jìn)創(chuàng)面組織中纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，提高創(chuàng)傷巨噬細(xì)胞含量有關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)研究白芨多糖對(duì)GU模型大鼠一般生存狀況及胃組織病理改變的影響，胃組織TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白的表達(dá)水平，以及下游細(xì)胞因子IL-17、IL-23含量的干預(yù)效應(yīng)，進(jìn)一步探討白芨多糖治療GU的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物 白芨多糖，含量(Assay by HPLC)：99%購于西安澤郎生物科技有限公司，批號(hào)：XAZL171026-1；鹽酸雷尼替丁購于湖南漢森制藥股份有限公司，批號(hào)：1808202；將白芨多糖按0.5 g、0.25 g、0.125 g溶于10 ml雙蒸水中，分別制成0.5 g/kg、0.25 g/kg、0.125 g/kg的試劑，鹽酸雷尼替丁按0.3 g溶于10 ml雙蒸水中，制成0.3 g/kg試劑，分別置于4℃冰箱以備灌胃使用。

1.1.2動(dòng)物 SPF級(jí)健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量(180±10)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2015-0002。于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)，相對(duì)濕度45%～55%，室溫22～25℃，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則。

1.1.3試劑 Albumin Bovine V(批號(hào)：Lot.No.829Q052)，Tris 8.8(批號(hào)：Lot.No.20180928)均購于北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸(批號(hào)：2017年3月27日)購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；IL-17、IL-23酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)：201901)購于上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；TRIzol(批號(hào)：LoT152104)購于美國Ambion公司；Real Time qPCR試劑盒(批號(hào)：Lot No.AI61180A)購于TaKaRa公司；GAPDH抗體(批號(hào)：Lot：B1501)購于美國ImmunoWay公司；NF-κB p65抗體，TLR-4抗體(批號(hào)：Lot No.821701523，Lot No.821701346)均購于GeneTex公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號(hào)：112971)購于北京中杉金橋生物科技有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder(批號(hào)：Lot No.00442922)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.4主要儀器 CT14RD型高速低溫離心機(jī)購于上海天美生化儀器設(shè)備工程公司；Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測(cè)定儀、Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)均購于美國Bio-Rad公司；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器購于寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠的分組與處理 將60只SPF級(jí)Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、鹽酸雷尼替丁組、白芨多糖大、中、小劑量組共6組，每組10只。在多種造模方法中乙酸灌胃法制作小鼠胃潰瘍模型簡(jiǎn)便易行，相對(duì)胃黏膜注射法而言乙酸直接灼燒組發(fā)生的潰瘍深而大，是理想的動(dòng)物造模方法，故本研究參照文獻(xiàn)[4]造模：大鼠術(shù)前禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液20 mg/kg 體重腹腔內(nèi)注射麻醉，常規(guī)處理后，自劍突下沿腹中線切開腹壁約2 cm打開腹腔，暴露胃前壁竇體部，自制直徑為5 mm，長(zhǎng)為40 mm的圓柱狀裝置按置于胃前壁胃竇部漿膜層處，吸取20 μl冰乙酸注入圓柱狀裝置中，直接燒灼60 s，再用生理鹽水清創(chuàng)后覆蓋網(wǎng)膜，縫合。待造模3 d后，隨機(jī)抽取3只大鼠麻醉后脫臼處死，肉眼觀察病灶處有無潰瘍，周邊是否充血水腫，HE切片觀察病灶處是否有腺體消失、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或出現(xiàn)壞死層。確定GU模型制備成功后空白組及GU模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，陽性對(duì)照組給予鹽酸雷尼替丁(0.3 g/kg)灌胃，《中華人民共和國藥典》2015年版一部中，白芨生藥飲片成人用量6～15 g[5]，按每天平均用藥量10 g折算成大鼠的用量為生藥1.5 g/kg，但是受白芨藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等影響，白芨多糖含量差異較大(33.11%～48.07%[6]、2.45%～23.57%[7])，綜合考慮確定大鼠白芨多糖的給藥劑量為0.25 g/kg，因此本實(shí)驗(yàn)選取大鼠給予白芨多糖0.5 g/kg、0.25 g/kg、0.125 g/kg作為大、中、小劑量組進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)15 d。

1.2.2各組大鼠胃組織病理學(xué)改變 HE染色，4%多聚甲醛固定胃組織，石蠟包埋切片后，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟→酒精梯度脫水→蘇木精染色→水洗→鹽酸酒精→水洗→酒精梯度脫水→伊紅染色→酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片→光鏡下觀察。

1.2.3ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清及胃組織IL-17、IL-23含量 遵照ELISA試劑盒說明書按步驟檢測(cè)大鼠血清及胃組織勻漿液中IL-17、IL-23含量，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)胃組織IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表達(dá)水平 采用Trizol法提取總RNA，測(cè)定其OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0之間，反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。β-actin F：5′-TGACAGGATGCAGAAGGA-GATTAC-3′，R：5′-GAGCCACCAATCCACACAGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度102 bp；IL-17 F：5′-AGCGTGTCCAAACACTGAGG-3′，R：5′-ACGTGGAACGGTTGAGGTAG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度125 bp；IL-23 F：5′-CGTATCCAGTGTGGTGATGGTT-3′，R：5′-AAGATGTCCGAGTCCAGT-AGGTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度119 bp；TLR-4 F：5′-CTCTGGCATCATCTTCATTGTCCTT-3′，R：5′-GTTGTTGCTTCTTGTTCTTCCTCTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp；NF-κB p65 F：5′-TCTTCGACTACGCGGTTACGG-3′，R：5′-CTCACGAGCTGAGCATGAAGG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度133 bp。以β-actin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系及參數(shù)依據(jù)GoTaq 3-Step RT-qPCR試劑盒說明書設(shè)置。采用樣點(diǎn)擬合法分析結(jié)果得到目的基因和β-actin 的Ct值，以β-actin為內(nèi)參，用比較Ct值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=(測(cè)試組目的基因Ct值-測(cè)試組內(nèi)參基因Ct值)-(對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值)，相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。

1.2.5Western blot法檢測(cè)胃組織TLR-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，配制抗體：GAPDH抗體溶液配制(1∶1 000)：GAPDH抗體10 μl，封閉液10 ml；TLR-4抗體配制(1∶1 000)：TLR-4抗體10 μl，封閉液10 ml；NF-κB p65抗體配制(1∶2 000)：NF-κB p65抗體5 μl，封閉液10 ml；37℃搖床4 h，1×TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，二抗溶液配制：辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5 000)：山羊抗兔二抗2 μl，牛奶封閉液10 ml；室溫孵育1 h，TBST液洗滌，采用ECL法顯影后用Bio-Rad Quantity One軟件進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果

2.1白芨多糖對(duì)各組大鼠一般體征的影響 空白組大鼠精神狀況良好，反應(yīng)靈敏，飲食正常，皮毛濃密且有光澤，大便成形呈褐色；GU模型組大鼠在造模后出現(xiàn)飲食減少，精神萎靡，嚴(yán)重豎毛，皮毛色澤枯槁易落，便質(zhì)少而軟，并見血便現(xiàn)象；各治療組在藥物干預(yù)1周后，大鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，飲食量持平或增加，毛色恢復(fù)光澤，膿血便逐漸消失，上述癥狀尤以白芨多糖大劑量組好轉(zhuǎn)明顯。

2.2白芨多糖對(duì)各組大鼠血清及胃組織IL-17、IL-23含量的影響 與空白組比較，GU模型組大鼠血清及胃組織IL-17、IL-23含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與GU模型組比較，白芨多糖大劑量組大鼠血清及胃組織IL-17、IL-23含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

2.3白芨多糖對(duì)各組大鼠胃組織病理變化的影響 空白組大鼠胃黏膜鏡下各層組織結(jié)構(gòu)排列完整，未見明顯改變，腺體排列規(guī)整，無水腫、充血。GU模型組大鼠胃黏膜鏡下可見腺體消失，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)壞死層，有明顯肉芽層及瘢痕組織；鹽酸雷尼替丁組大鼠胃黏膜有少量腺體覆蓋及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死層減少；白芨多糖大劑量組大鼠胃黏膜出現(xiàn)較多腺體，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死層明顯減少；白芨多糖中劑量組大鼠胃黏膜腺體排列稀疏且不規(guī)整，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死層減少；白芨多糖小劑量組大鼠胃黏膜損傷程度較重，壞死層及肉芽組織明顯。結(jié)果見圖1。

2.4白芨多糖對(duì)GU模型大鼠胃組織IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表達(dá)水平的影響 與空白組比較，GU模型組大鼠胃組織IL-17、IL-23、TLR-4及NF-κB p65基因表達(dá)水平顯著升高， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與GU模型組比較，白芨多糖大、中劑量組大鼠胃組織IL-17及NF-κB p65基因表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，白芨多糖大劑量組大鼠胃組織IL-23及TLR-4基因表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

GroupsDose(g/kg)Serum IL-17(pg/ml)Tissue IL-17(pg/mg)Serum IL-23(pg/ml)Tissue IL-23(pg/mg)Control-1.63±0.224.26±0.221.34±0.163.23±0.10Model-2.18±0.071)5.98±0.221)1.59±0.091)4.58±0.231)Rh0.3001.90±0.162)5.18±0.222)1.41±0.142)3.60±0.143)Bsp-h0.5001.88±0.272)4.54±0.223)1.37±0.172)3.31±0.173)Bsp-m0.2502.05±0.245.88±0.221.44±0.174.52±0.24Bsp-l0.1252.13±0.215.95±0.221.58±0.134.53±0.11

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

GroupsDose(g/kg)IL-17 mRNA(2-ΔΔCT)IL-23 mRNA(2-ΔΔCT)TLR-4 mRNA(2-ΔΔCT)NF-κB p65 mRNA(2-ΔΔCT)Control-1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00Model-1.34±0.021)1.31±0.041)1.40±0.041)1.32±0.031)Rh0.3001.25±0.052)1.22±0.042)1.23±0.032)1.24±0.032)Bsp-h0.5001.23±0.043)1.20±0.022)1.20±0.032)1.20±0.053)Bsp-m0.2501.29±0.022)1.28±0.021.35±0.041.25±0.022)Bsp-l0.1251.32±0.061.29±0.041.39±0.021.31±0.04

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖1 各組大鼠胃組織病理形態(tài)(HE染色，×100)Fig.1 Pathological morphology of gastric tissues of rats in each group (HE,×100)

2.5白芨多糖對(duì)GU模型大鼠胃組織TLR-4及NF-κBp65蛋白表達(dá)水平的影響 與空白組比較，GU模型組大鼠胃組織TLR-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與GU模型組比較，白芨多糖大、中劑量組大鼠胃組織TLR-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果見表3、圖2。

GroupsDose(g/kg)TLR-4(TLR-4/GAPDH)NF-κB p65(NF-κB p65/GAPDH)Control-0.49±0.030.53±0.03Model-1.49±0.121)1.20±0.141)Rh0.3000.53±0.033)0.58±0.022)Bsp-h0.5000.49±0.033)0.63±0.033)Bsp-m0.2501.06±0.192)0.89±0.052)Bsp-l0.1251.22±0.231.15±0.15

Note:Compared with the Control group,1)P<0.01;compared with the Model group,2)P<0.05,3)P<0.01.

圖2 各組大鼠胃組織TLR-4及NF-κB p65蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.2 Immunoblot of TLR-4 and NF-κB p65 protein expression in gastric tissues of rats in each groupNote: 1.Control group;2.Model group;3.Ranitidine hydrochloride group;4.Bsp-h group;5.Bsp-m group;6.Bsp-l group.

3 討論

胃潰瘍是一種常見多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制多假設(shè)是環(huán)境因素作用于具有易感傾向的人群，繼而激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，釋放一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如IL-17及IL-23等，進(jìn)一步激活某些信號(hào)通路，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，并逐級(jí)擴(kuò)大和持續(xù)，使胃黏膜免疫反應(yīng)過度亢進(jìn)導(dǎo)致胃損傷和一系列臨床表現(xiàn)。有研究表明白芨多糖具有降低應(yīng)激時(shí)大鼠的胃黏膜損傷的藥理作用[8]。

Toll樣受體(Toll like receptors，TLR)是由先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜蛋白，與機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，TLR配體較多，其中TLR-4是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，是位于細(xì)胞膜上作為TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的起點(diǎn)，激活后的TLR可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路，致使細(xì)胞因子如IL-17、IL-23等的產(chǎn)生及抗原呈遞細(xì)胞在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中對(duì)T細(xì)胞共刺激的激活以參與免疫和炎癥反應(yīng)。有研究表明NF-κB作為炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)樞紐又是TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的終點(diǎn)，通過NF-κB的激活、核轉(zhuǎn)位，繼而下游一系列炎癥因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)[9，10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GU模型大鼠胃黏膜組織TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表達(dá)水平顯著升高，而白芨多糖大劑量組和鹽酸雷尼替丁組均能顯著降低TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表達(dá)水平。

IL-17和IL-23都是重要的免疫因子，IL-17主要由Th17細(xì)胞分泌，它能夠激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生如IL-6、TNF-α、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶等大量致炎因子，引起并加重炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損害[11]。IL-23是一種二聚體結(jié)構(gòu)的致炎因子。主要由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌，可直接作用于破骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞的分化及活化，上調(diào)破骨細(xì)胞數(shù)量及活性，刺激CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，并對(duì)Th17細(xì)胞的功能維持有重要作用，使Th17細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)效致炎因子IL-17[12，13]。本研究結(jié)果顯示，GU模型大鼠血清及胃黏膜組織IL-17、IL-23含量和基因表達(dá)水平顯著升高，而白芨多糖大劑量組和鹽酸雷尼替丁組均顯著降低IL-17、IL-23含量和基因表達(dá)水平。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過乙酸直接燒灼法成功復(fù)制GU模型，GU模型組大鼠病理切片見胃底腺結(jié)構(gòu)紊亂，胃黏膜上皮細(xì)胞脫落；而胃黏膜損傷可能與TLR-4、NF-κB p65高表達(dá)，誘發(fā)促炎因子IL-17、IL-23異常分泌而加重炎癥反應(yīng)有關(guān)；經(jīng)藥物治療后與模型組比較，白芨多糖大劑量組大鼠胃黏膜出現(xiàn)較多腺體，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死層等損傷得到改善或減輕，同時(shí)血清及胃黏膜細(xì)胞因子IL-17和IL-23含量降低，TLR-4、NF-κB p65基因及蛋白表達(dá)水平降低，且以白芨多糖大劑量組作用顯著，說明白芨多糖可通過下調(diào)TLR-4、NF-κB p65基因和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制促炎因子IL-17和IL-23的異常分泌，減輕炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)胃黏膜組織及其功能的作用。