孫 勃 劉士波 王 培 薛鑫鑫 高云峰 付世杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手足外科，承德 067000)

近年來，骨質(zhì)疏松和骨折患者的發(fā)病率不斷升高，骨愈合需要比較長的周期，因此促進(jìn)骨愈合對于骨質(zhì)疏松和骨折患者的治療具有重要意義。由感染所致的內(nèi)毒素血癥以及創(chuàng)傷引起的骨感染均可造成骨壞死，感染性骨壞死是骨科領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。但感染性骨壞死的機(jī)制尚不十分清楚，因此探討骨壞死的機(jī)制對早期預(yù)防和治療骨壞死具有重要意義。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病成分，可引起組織細(xì)胞的功能紊亂，研究發(fā)現(xiàn)LPS可影響成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，延遲骨愈合[1，2]。MAPK/ERK1/2信號通路在成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控MAPK/ERK1/2信號通路可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，抑制成骨細(xì)胞凋亡[3-5]。本文通過研究LPS對成骨細(xì)胞活性和凋亡以及MAPK/ERK1/2信號通路的影響，探討LPS是否通過MAPK/ERK1/2信號通路影響成骨細(xì)胞活性和凋亡。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠前體成骨細(xì)胞株MC3T3-E1(美國ATCC公司)，LPS、Hochest 33258(美國Sigma公司)，DEME/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)，ERK1/2激酶抑制劑U0126(德國Merck公司)，噻唑藍(lán)(MTT)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)活性測定試劑盒(美國invitrogen公司)，兔抗鼠C-Caspase 3單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2單克隆抗體、兔抗鼠p-ERK1/2單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗等(美國Gibco公司)等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MC3T3-E1細(xì)胞接種到DEME/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)的96孔板中培養(yǎng)，3 d進(jìn)行1次換液，細(xì)胞生長至80%以上融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)(傳代比例1∶2)。

1.2.2細(xì)胞分組和處理 將第3代生長良好的MC3T3-E1細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、LPS組、LPS+U0126組，對照組不給予LPS處理，LPS組待細(xì)胞達(dá)65%貼壁生長時(shí)添加10 mmol/L LPS(研究證實(shí)LPS對成骨細(xì)胞的影響呈劑量和時(shí)間依賴性，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[6，7]選擇LPS劑量為10 mmol/L、作用24 h進(jìn)行研究)，LPS+U0126組待細(xì)胞達(dá)65%貼壁生長時(shí)添加10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制劑U0126，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3采用MTT比色法測定細(xì)胞活性 將3組處理后的MC3T3-E1細(xì)胞置于DEME/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl培養(yǎng)4 h，移去上清液，加入二甲基亞砜100 μl振蕩10 min溶解結(jié)晶，繼續(xù)培養(yǎng)至氣泡溶解，采用酶標(biāo)儀測定每孔570 nm波長處吸光度值，以吸光度值表示MC3T3-E1細(xì)胞活性。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡 將3組處理后的MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)離心、收集、漂洗，加入Binding Buffer 100 μl制成細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC 5 μl 混勻，再加入PI染色液10 μl孵育15 min，加入Binding Buffer定容到500 μl，上機(jī)，每份收集10 000個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)7次。

1.2.5成骨活性指標(biāo)ALP和BGP活性測定 取3組處理過的MC3T3-E1細(xì)胞，采用硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動力學(xué)法測定ALP活性；采用放射免疫法測定BGP活性。

1.2.6采用Hochest 33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 將3組MC3T3-E1細(xì)胞爬片放置到6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)70%融合后，對照組不加入LPS處理，LPS組加入10 mmol/L LPS，LPS+U0126組加入10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制劑U0126，培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗，用Hochest 33258染液5 μg/ml覆蓋細(xì)胞爬片染色10 min，PBS漂洗，取出細(xì)胞爬片，在熒光顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.2.7采用Western blot測定細(xì)胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平 將3組MC3T3-E1細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，對照組不加入LPS處理，LPS組加入10 mmol/L LPS，LPS+U0126組加入10 mmol/L LPS和25 μmol/L ERK1/2激酶抑制劑U0126，培養(yǎng)24 h，將處理后細(xì)胞收集到EP管中，3 500 r/min離心5 min，共3次，棄去上清液，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，BCA法測定MC3T3-E1細(xì)胞蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(兔抗鼠C-Caspase 3單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗鼠ERK1/2單克隆抗體、兔抗鼠p-ERK1/2單克隆抗體)(1∶1 000)過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)孵育2 h，加入ECL顯影，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image Lab軟件分析蛋白條帶。目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.13組MC3T3-E1細(xì)胞活性比較 與對照組比較，LPS組和LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞活性降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞活性升高(P<0.05)。見表1。

2.23組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡比較 與對照組比較，LPS組和LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見表2和圖1。

2.33組MC3T3-E1細(xì)胞成骨活性指標(biāo)ALP和BGP活性比較 與對照組比較，LPS組和LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞ALP和BGP活性降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞ALP和BGP活性升高(P<0.05)。見表3。

GroupsnCell viabilityControl group7115.35±11.24LPS group761.24±9.031)LPS+U0126 group7 78.57±10.421)2)F50.666P0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the LPS group,2)P<0.05.

GroupsnApoptosis ratesControl group76.24±1.47LPS group727.13±1.621)LPS+U0126 group713.16±1.511)2)F336.575P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the LPS group,2)P<0.05.

圖1 3組MC3T3-E1細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖Fig.1 Apoptotic flow cytometry of three groups of MC3T3-E1 cells

2.43組MC3T3-E1細(xì)胞核形態(tài)比較 對照組細(xì)胞核完整，染色均勻，呈卵圓形或圓形；LPS組細(xì)胞核縮小，呈碎塊狀致密濃染的固縮狀，染色質(zhì)凝聚，呈明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)；LPS+U0126組凋亡形態(tài)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖2。

2.53組MC3T3-E1細(xì)胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較 與對照組比較，LPS組和LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞C-Caspase 3、Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞C-Caspase 3、Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表4和圖3。

2.63組MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較 3組MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p-ERK1/2蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中與對照組比較，LPS組和LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞p-ERK1/2蛋白水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+U0126組MC3T3-E1細(xì)胞p-ERK1/2蛋白水平降低。見表5和圖4。

GroupsnALP(U/g)BGP(ng/ml)Control group76.84±1.250.53±0.06LPS group72.47±0.961)0.28±0.051)LPS+U0126 group74.21±1.131)2)0.39±0.071)2)F27.02629.973P0.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the LPS group，2)P<0.05.

圖2 3組MC3T3-E1細(xì)胞核形態(tài)的Hochest 33258染色(×400)Fig.2 Hochest 33258 staining of nuclear of three groups of MC3T3-E1 cells (×400)

GroupsnC-Caspase 3 proteinBax proteinBcl-2 proteinControl group70.24±0.090.18±0.070.85±0.16LPS group70.47±0.121)0.49±0.141)0.19±0.131)LPS+U0126 group70.35±0.111)2)0.32±0.131)2)0.37±0.141)2)F8.03212.22539.362P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the LPS group，2)P<0.05.

圖3 3組MC3T3-E1細(xì)胞C-Caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白Western blot電泳圖Fig.3 Western blot analysis of C-Caspase 3,Bax,Bcl-2 proteins in three groups of MC3T3-E1 cellsNote: 1.Control group；2.LPS group；3.LPS+U0126 group.

GroupsnERK1/2p-ERK1/2Control group70.42±0.150.13±0.06LPS group70.46±0.170.78±0.211)LPS+U0126 group70.52±0.190.31±0.141)2)F0.60835.146P0.5550.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the LPS group，2)P<0.05.

圖4 三組MC3T3-E1細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白Western blot電泳圖Fig.4 Western blot analysis of ERK1/2 and p-ERK1/2 proteins in three groups of MC3T3-E1 cellsNote: 1.Control group；2.LPS group；3.LPS+U0126 group.

3 討論

開放性骨折患者常伴隨有細(xì)菌感染，細(xì)菌感染是引起骨折不愈合或延遲愈合的重要原因。骨折愈合過程是成骨細(xì)胞形成骨質(zhì)，并且發(fā)生鈣化的過程，細(xì)菌感染可引起骨折局部炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而引起免疫功能紊亂，導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡，使骨折愈合困難。LPS包含特異性多糖、非特異性多糖和類脂A，是細(xì)菌內(nèi)毒素的關(guān)鍵成分，其中類脂A是關(guān)鍵毒性成分，可造成多種器官損傷、衰竭。LPS作為細(xì)菌的主要致熱源，可使成骨細(xì)胞活性降低。炎癥反應(yīng)是機(jī)體防御外界損傷的主要機(jī)制，骨折后大量炎癥因子的釋放可造成破骨細(xì)胞活化、成骨細(xì)胞無法成骨，從而抑制骨折愈合[8]。LPA引起骨折不愈合主要為LPS引起的活化因子配基水平升高，使成骨細(xì)胞分泌破骨細(xì)胞激活因子，降低成骨細(xì)胞活性，并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[9]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：體外給予一定濃度的LPS可降低成骨細(xì)胞的增殖和分化能力，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[10]。

細(xì)胞凋亡的信號通路包括死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、線粒體通路等，最為經(jīng)典的通路為線粒體通路。線粒體凋亡途徑主要通過Caspase、Bcl-2凋亡家族成員發(fā)揮作用，Caspase為細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的半胱氨酸蛋白酶，Caspase-3在凋亡級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮最關(guān)鍵作用，活化的Caspase-3促進(jìn)凋亡的發(fā)生[11]；Bcl-2家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，可促進(jìn)或防止凋亡因子從線粒體釋放，破壞或保護(hù)線粒體完整性[12]；Bcl-2通過維持線粒體膜的完整性抑制細(xì)胞凋亡；Bax可破壞線粒體膜，形成通透性孔道，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。ALP由成骨細(xì)胞分泌，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，可反映成骨細(xì)胞功能和成骨細(xì)胞分化成熟程度；BGP由成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成和分泌，是構(gòu)成骨基質(zhì)的成分之一，可反映成骨細(xì)胞分化成熟情況及成骨細(xì)胞的成骨功能；因此ALP和BGP活性可反映成骨細(xì)胞的成骨活性。本研究體外對小鼠前體成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞給予LPS處理，發(fā)現(xiàn)LPS處理后MC3T3-E1細(xì)胞活性及ALP和BGP活性降低，凋亡率增加，細(xì)胞中C-Caspase 3、Bax蛋白水平升高、Bcl-2蛋白水平降低。表明LPS可抑制成骨細(xì)胞活性及成骨活性，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，分析LPS通過降低Bax蛋白水平，使細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡相關(guān)因子-1等組成凋亡體，凋亡體激活下游Caspase 3，活化的Caspase 3(C-Caspase 3)水解底物，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

多種信號通路參與成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡，MAPK為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的主要信號分子，在多種細(xì)胞生理病理過程中發(fā)揮重要作用[14，15]，ERK為MAPK信號通路之一，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[16]。在成骨細(xì)胞中，ERK參與成骨細(xì)胞的分化、存活和增殖，抑制ERK1/2信號通路的激活可抑制Bax表達(dá)升高和Bcl-2下調(diào)，從而抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，抑制Caspase-3激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[17，18]。LPS可通過多種信號通路影響成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡[19]，如LPS通過Notch信號通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖[20]；LPS通過JNK信號通路抑制成骨細(xì)胞分化和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS可降低成骨細(xì)胞中p-ERK1/2水平，表明LPS可激活成骨細(xì)胞ERK1/2信號通路；細(xì)胞中同時(shí)加入ERK1/2信號通路抑制劑處理后，成骨細(xì)胞活性及ALP和BGP活性升高，凋亡率下降，C-Caspase 3、Bax、p-ERK1/2蛋白水平下降，Bcl-2蛋白水平升高。表明LPS可能通過促進(jìn)ERK1/2信號通路的激活使Bax表達(dá)升高和Bcl-2下調(diào)，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-3，從而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LPS可通過激活MAPK/ERK1/2信號通路介導(dǎo)線粒體通路抑制成骨細(xì)胞活性、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。