黃文麗， 夏永軍， 熊智強(qiáng)， 張 匯， 艾連中， 王光強(qiáng)

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093）

高血脂癥通常表現(xiàn)為血漿中血清總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol, LDL-C）中的至少有一項(xiàng)指標(biāo)濃度過高，而高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoproteincholesterol, HDL-C）卻濃度過低[1]。血液中膽固醇水平過高早已被確認(rèn)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟?。–HD）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。研究表明：人體血清膽固醇水平每高于正常值1 mmol/L，冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)就增加35%左右；但是其含量每降低1%，發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)性可降低2%～3%[3]。因此，降低血清膽固醇水平對(duì)預(yù)防心血管疾病至關(guān)重要。目前控制和降低血脂水平主要采用藥物治療和飲食干預(yù)的方法，大部分藥物初期服用階段控制血脂效果顯著，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生不同程度的副作用及依賴性，加重患者健康問題[4]。飲食控制雖然能夠在一段時(shí)間內(nèi)起到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用，但往往長(zhǎng)期效果欠佳且稍不注意還易反彈。相比之下，食用降血脂功能性食品可能是長(zhǎng)期控制血脂更理想的方法[5]。其中被公認(rèn)的機(jī)制之一為通過益生菌產(chǎn)生膽鹽水解酶（bile salt hydrolase, BSH）將腸腔內(nèi)的結(jié)合型膽酸水解成游離型膽酸，游離型膽酸不易被小腸吸收，大部分隨糞便排出體外，抑制了腸道膽汁酸的重吸收[6]，為了保證膽汁酸內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，血清中膽固醇被用于合成新的膽汁酸以彌補(bǔ)隨糞便排出的膽汁酸部分，因此降低了血清膽固醇濃度[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有體外實(shí)驗(yàn)水解膽鹽能力較強(qiáng)的 植物乳桿菌Lactobacillus plantarumAR113l和水解膽鹽能力較差的干酪乳桿菌Lactobacillus caseiLC2W 對(duì)高脂模型小鼠降膽固醇效果進(jìn)行初步探究，以期為進(jìn)一步開發(fā)降血脂功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

植物乳桿菌編號(hào)AR113，分離自泡菜，實(shí)驗(yàn)室保藏；干酪乳桿菌編號(hào)LC2W，實(shí)驗(yàn)室保藏。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料：ICR（雄性）小鼠30 只，體質(zhì)量18±2 g，購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。輻照無菌的基礎(chǔ)飼料與高脂飼料購(gòu)自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

基礎(chǔ)飼料組成見表1。高脂飼料組成：基礎(chǔ)飼料83.7%、豬油10%、蔗糖5%、膽固醇1%、膽鹽0.3%[8]。TC，TG，HDL-C，LDL-C 測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；其他化學(xué)試劑均為分析純。

表 1 基礎(chǔ)飼料配方[8]Tab.1 Composition of experimental diet

液體MRS 培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀0.2 g、硫酸錳 0.025 g、乙酸鈉0.5 g、檸檬酸氫二銨0.2 g、硫酸鎂0.058 g、吐溫?80 mL。用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。固體MRS 培養(yǎng)基：在液體MRS 培養(yǎng)基中按2%的配比加入瓊脂粉，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱Bugbox，英國(guó)Ruskinn；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax i3x，奧地利Molecular Devices；HVE/HVA 系列高壓蒸汽滅菌鍋，日本Hirayama；超凈工作臺(tái)SW-CJ-IFD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；動(dòng)物天平，上海豪晟科學(xué)儀器有限公司；超低溫冰箱RevcoTM，美國(guó)Thermo Scientific。

1.3 方法

1.3.1 灌胃液制備

將保藏的植物乳桿菌AR113 與干酪乳桿菌LC2W 活化3 代后按3%的量接種到液體MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h 后，4 000×g 離心10 min收集菌體，用滅菌生理鹽水離心洗滌兩次，再用生理鹽水混勻，混勻后涂布于固體MRS 培養(yǎng)基上進(jìn)行活菌數(shù)確認(rèn)，調(diào)整菌液濃度為1.0×109CFU/mL，用于小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)。

圖 1 小鼠飼養(yǎng)流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of mice feeding

1.3.2 動(dòng)物分組及飼喂方式

30 只ICR 小鼠喂食普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 星期后，按組間體重?zé)o顯著差異隨機(jī)分為4 組，對(duì)照組9 只喂食基礎(chǔ)飼料，高脂模型組9 只及其余兩組各6 只喂食高脂飼料。喂食高脂飼料4 星期后驗(yàn)證高脂模型是否建成。高脂模型建立后，每星期稱1 次體重并調(diào)整灌胃量，每天上午按表2所示方式進(jìn)行灌胃，按1 mL/100 g 灌胃量進(jìn)行。試驗(yàn)期間小鼠自由飲水，保持動(dòng)物房通風(fēng)、清潔和透光，維持室溫在22 ± 1 ℃。

表 2 小鼠分組及飼養(yǎng)方案Tab.2 Mice Grouping and feeding schedules

1.3.3 小鼠高血脂模型的建立

喂食高脂飼料4 星期后，隨機(jī)從對(duì)照組與高脂模型組分別抽取3 只小鼠，禁食12 h 過夜，眼球取血，室溫放置1 h，3 000 × g 離心10 min 取血清，利用試劑盒測(cè)定血清TC，TG 和HDL-C 濃度。摘取完整肝臟，用0～4 ℃冷生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干稱重，進(jìn)行肝臟指數(shù)的測(cè)定。取適量肝臟，按重量（g）∶體積（mL） = 1∶9 的比例，加入9 倍體積的無水乙醇，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3 000 × g 離心10 min，取上清于?80 ℃冰箱保存，用于試劑盒測(cè)定肝臟TC，TG 濃度。

1.3.4 小鼠體重和臟器指數(shù)的測(cè)定

灌胃期間，每星期同一時(shí)間記錄小鼠體重。灌胃4 星期處死小鼠后立即解剖取肝、腎、脾和心臟，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干稱重，進(jìn)行臟器指數(shù)測(cè)定。臟器指數(shù)（肝、腎、脾、心臟）（mg/g） = 內(nèi)臟重量/小鼠處死前最終體重。

1.3.5 血清血脂、動(dòng)脈硬化指數(shù)和冠心指數(shù)的測(cè)定與計(jì)算

灌胃4 星期后，全部禁食12 h 過夜，稱好體重后眼球取血制備血清離心收集血清，其中血清血脂測(cè)定方法同1.3.3，均用商業(yè)試劑盒測(cè)定血清TC，TG，HDL-C 及LDL-C 濃度，再根據(jù)公式計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)AI 和冠心指數(shù)R-CHR[9]。

1.3.6 肝臟血脂測(cè)定

解剖小鼠后立即摘取完整的肝臟，用0～4 ℃冷生理鹽水沖洗干凈后，剪取適量大小肝臟，按重量（g）∶體積（mL） = 1∶9 的比例，加入9 倍體積的無水乙醇，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3 000×g離心10 min，取上清于?80 ℃冰箱保存，商業(yè)試劑盒測(cè)定肝臟TC，TG 和LDL-C 水平。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行Duncan 多重比較，概率p<0.05表示有差異，p<0.01 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠高脂模型組的建立

喂食高脂飼料4 星期后，對(duì)照組與高脂模型組小鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)及血清TC，TG，HDL-C濃度和肝臟TC，TG 濃度見表3，圖2 和圖3。

表 3 兩組小鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)Tab.3 Body weight, liver weight and liver index of two mice groups

圖 2 兩組小鼠血清血脂濃度Fig. 2 Serum concentration of TC, TG, HDL-C of two mice groups

圖 3 兩組小鼠肝臟血脂濃度Fig. 3 Hepatic concentration of TC, TG of two mice groups

由表3 可知，喂食高脂飼料4 星期后，高脂模型組小鼠的體重與對(duì)照組存在差異，高脂模型組小鼠肝重和肝臟指數(shù)與對(duì)照組存在顯著差異（p<0.01）。由圖2 和圖3 可知，高脂模型組血清TC 濃度和肝臟TC 濃度顯著高于對(duì)照組（p<0.01），HDLC 濃度顯著低于對(duì)照組（p<0.01）。且與對(duì)照組相比，高脂模型組小鼠肝臟顏色呈淡黃色，說明喂食高脂飼料后小鼠高脂模型建模成功。

2.2 菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠體重和臟器指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠在灌胃各星期結(jié)束時(shí)的體重見圖4。高脂模型組和菌株LC2W 組小鼠體重相比空白對(duì)照組和菌株AR113 組有所增加但差異并不顯著（p＞0.05），可能是由于實(shí)驗(yàn)周期不夠長(zhǎng)（本實(shí)驗(yàn)周期為2 個(gè)月），對(duì)體重的影響尚沒有完全表征出來。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，小鼠生長(zhǎng)狀況良好，無不良反應(yīng)。

臟器指數(shù)一般被用來反映某物質(zhì)對(duì)臟器是否有影響，常作為毒性初步判斷指標(biāo)[10]。表4 為菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠臟器指數(shù)的影響。由表4 可知，喂食高脂飲食的小鼠相比于普通飼料小鼠，腎臟和脾臟指數(shù)略有升高但沒有顯著差異（p＞0.05），肝臟指數(shù)升高明顯（p<0.05），說明一段時(shí)間內(nèi)小鼠持續(xù)攝入過多膽固醇會(huì)對(duì)肝臟造成影響，但不影響其他器官。灌胃菌株AR113 和LC2W一個(gè)月后，小鼠肝臟指數(shù)相比高脂模型組降低明顯（p<0.05），說明菌株AR113 和LC2W 可以在一定程度上降低膽固醇在肝臟上的存積量，減輕肝臟負(fù)擔(dān)。

圖 4 菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠體重的影響Fig.4 Effects of AR113 and LC2W on body weight in hyperlipidemia mice

表 4 菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.4 Effects of AR113 and LC2W on organs index in hyperlipidemia mice

2.3 菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠血清血脂、動(dòng)脈硬化指數(shù)和冠心指數(shù)的影響

菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠血清血脂及動(dòng)脈硬化指數(shù)和冠心指數(shù)影響見表5。灌胃4 星期后，高脂模型組和LC2W 組小鼠血清TC，LDLC 濃度高于對(duì)照組（p<0.01）和AR113 組（p<0.05），而HDL-C 濃度又低于對(duì)照組（p<0.01）和AR113 組（p<0.05）。菌株AR113 組小鼠相比菌株LC2W 組小鼠，其血清TC，HDL-C，LDL-C 濃度更接近對(duì)照組。動(dòng)脈硬化指數(shù)AI 和冠心指數(shù)R-CHR 在醫(yī)學(xué)上常被用來表示動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)性和發(fā)生冠心病的危險(xiǎn)性。由表5 可知，小鼠經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)后，AI 和R-CHR 均顯著升高（p<0.01），灌胃菌AR113 和LC2W后，AI 和R-CHR 相比高脂模型組都有所降低（p<0.01，p<0.05），其中菌株AR113 效果更佳。由此可知，菌株AR113 比LC2W 改善血脂代謝的效果更好，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生有預(yù)防和改善作用。

表 5 菌AR113 和LC2W 對(duì)小鼠血清血脂水平、動(dòng)脈硬化指數(shù)和冠心指數(shù)的影響Tab.5 Effects of AR113 and LC2W on serum lipid levels, AI and R-CHR in hyperlipidemia mice

2.4 菌株AR113 和LC2W 對(duì)高脂小鼠肝臟血脂的影響

由表6 可知，對(duì)照組肝臟TC，LDL-C 濃度顯著高于高脂模型組（p<0.01），菌AR113 組的肝臟TC，LDL-C 濃度又明顯低于高脂模型組（p<0.05），菌株LC2W 組的肝臟TC 濃度相比高脂模型組雖然也有所降低，但兩者之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒有顯著差異（p＞0.05）。

表 6 菌株AR113 和LC2W 對(duì)小鼠肝臟TC，TG 和LDL-C 濃度的影響Tab.6 Effects of AR113 and LC2W on hepatic concentration of TC, TG and LDL-C in hyperlipidemia mice

3 討 論

血清TC 濃度升高是增加患心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一，因此近年來關(guān)于降膽固醇乳酸菌體內(nèi)效果評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)越來越多[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)目前乳桿菌屬是具有降血脂功能的主要益生菌種類之一，大多篩選自健康人體糞便或動(dòng)物糞便和酸奶、泡菜等發(fā)酵食品[14]，本實(shí)驗(yàn)所用菌株AR113 和菌株LC2W 分別篩選自泡菜和發(fā)酵乳制品。

本實(shí)驗(yàn)通過飼喂ICR 小鼠4 星期高脂飼料成功建立高脂模型后，再連續(xù)灌胃菌株AR113 和LC2W 4 星期，發(fā)現(xiàn)與高脂模型組相比，菌株AR113 組小鼠血清TC，LDL-C，AI 和R-CHR 濃度均顯著降低，分別下降了20.9%，44.8%，40.7%和32.6%，肝臟血脂TC 和LDL-C 濃度分別下降了23.2%和26.8%，而灌胃菌株LC2W 組血清血脂TC，LDL-C，AI 和R-CHR 濃度只分別下降了8.3%，11.4%，25.9%和20.8%，肝臟血脂TC 和LDL-C 濃度也只分別下降了14.3%和23.1%。由實(shí)驗(yàn)綜合效果可知Lactobacillus plantarumAR113 降血脂能力遠(yuǎn)優(yōu)于Lactobacillus caseiLC2W，體現(xiàn)了不同菌株降血脂效果具有差異性，這與已報(bào)道的研究結(jié)果相似。張澤生等[15]利用高脂飼料誘導(dǎo)倉(cāng)鼠高脂血癥模型，分別給不同組倉(cāng)鼠灌胃濃度為109cfu/mL 的嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌菌懸液6 星期后，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌灌胃組降血清TC，TG濃度的作用最好，而嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌升高血清HDL-C 濃度的作用最好。這可能是由于雖然膽固醇生物降解的機(jī)制是多方面的，但對(duì)于菌本身而言卻是特異性的，由于菌體本身與膽固醇發(fā)生共沉淀或?qū)δ懝檀加形阶饔?，也可能是由于菌體產(chǎn)生的膽鹽水解酶加劇了膽固醇的外排等作用。

本次實(shí)驗(yàn)表明Lactobacillus plantarumAR113相比Lactobacillus caseiLC2W 對(duì)高脂血癥小鼠具有顯著的降血脂功效，可作為良好的輔助降血脂候選菌株進(jìn)一步探究其體內(nèi)降血脂機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)降血脂功能性食品提供參考。