郭彥君，鄭召君，葉 展，劉元法

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

青霉素等抗菌藥物的廣泛使用會(huì)使病原菌出現(xiàn)極強(qiáng)的適應(yīng)性。細(xì)菌等微生物和抗生素等抗菌藥多次接觸后，對(duì)藥物的敏感性會(huì)逐漸減小或消失[1]?？咕幬镒饔冒悬c(diǎn)與其化合物結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，不同結(jié)構(gòu)單元的作用靶點(diǎn)基本不同，常用的抗菌藥物應(yīng)用到臨床后，容易出現(xiàn)耐藥菌株，發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)的抗菌化合物或?qū)σ阎咕钚缘幕衔镞M(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是攻克耐藥菌株難關(guān)的重要手段。自然界中化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，有生物活性，所以研究自然界中具有抗菌活性的物質(zhì)一直是抗菌研究的主要方向。

鴯鹋油，提取自鴯鹋背部的厚脂肪袋，被認(rèn)為用于保護(hù)鴯鹋免受澳大利亞極端天氣的傷害[2]。鴯鹋、鴕鳥(niǎo)和美洲鴕是澳洲常見(jiàn)的鳥(niǎo)類，鴯鹋是三者當(dāng)中最小的，但其脂肪組織占比最高，得到的鴯鹋油極具價(jià)值。澳大利亞的原住民一直通過(guò)外敷鴯鹋油治療創(chuàng)傷，促進(jìn)傷口恢復(fù)和減輕疼痛[3]。鴯鹋油有很多用途：可以改善腸胃炎，緩解關(guān)節(jié)炎，降低膽固醇，減輕動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)藥物滲透[4-9]。鴯鹋油也被報(bào)道具有抗菌性：鴯鹋油基靜電紡絲纖維具有廣譜抗菌功效，混有鴯鹋油、荷荷巴油、鱷梨油和茶樹(shù)油的護(hù)膚霜可抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，鴯鹋油和其他抗菌成分混合制成抗菌藥物[10-11]。鴯鹋油由于其廣泛的功能性受到了越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注。

鴯鹋油雖然被報(bào)道具有抗菌性，但是多為和其他成分共同作用，目前尚未報(bào)道鴯鹋油自身的抗菌性及抗菌機(jī)理。前期研究發(fā)現(xiàn)，鴯鹋油水溶性較差，不能在固體瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)清晰的抑菌圈，所以將鴯鹋油同乙醇、Tween 80混合均勻制成乳液，同對(duì)照組進(jìn)行比較檢測(cè)鴯鹋油的抗菌性，研究鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制機(jī)理，以期為鴯鹋油在食品產(chǎn)業(yè)中的抗菌應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

鴯鹋油塊，無(wú)錫德誠(chéng)樂(lè)邦生物技術(shù)有限公司提供；中性蛋白酶，諾維信公司；大腸埃希菌(E.coliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 25923)、沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏；Tween 80、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、氯化鉀、氯化鈣、葡萄糖、乳糖、七水硫酸鎂、β-巰基乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)；溶菌酶、細(xì)菌活性化蛋白制備裂解液、Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；超微量總ATP酶(ATPase)測(cè)定試劑盒(比色法)、堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒(微板法)、β-半乳糖苷酶,南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RW20DS025攪拌器；ME204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司; HH-601恒溫水浴；FD23烘箱，德國(guó)賓得；V4BS000旋渦混勻器；T25DS25高速分散機(jī)，德國(guó)IKA公司；立式壓力蒸汽滅菌器；BSC生物安全柜；BSD臺(tái)式恒溫振蕩器；容聲BCD526WD11HY冰箱; YXQ-LS 立式壓力蒸汽滅菌器；DNM-9602G酶標(biāo)儀;Zetasizer nano ZS納米粒度及Zeta電位儀，英國(guó)馬爾文公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鴯鹋油的提取

將200 g鴯鹋油塊和180 g去離子水置于燒杯中，于60℃水浴低速攪拌。加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7后，加入5 g中性蛋白酶，反應(yīng)3 h后100℃滅酶2 min。4 500 r/min離心10 min，取上層加入干燥無(wú)水硫酸鈉過(guò)夜，抽濾所得鴯鹋油分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鴯鹋油乳液的制備及分組

乳液體系按照鴯鹋油、水、無(wú)水乙醇和Tween 80混合均勻，10 000 r/min高速剪切3 min，常溫下備用[12]。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的乳液成分見(jiàn)表1。

表1 各組的乳液成分

1.2.3 鴯鹋油最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

鴯鹋油的MIC通過(guò)二倍稀釋法測(cè)得[13]。將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌分別接種到LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)7 h，用LB培養(yǎng)基稀釋至濃度為105CFU/mL的菌懸液。將21 μL一系列二倍稀釋濃度的鴯鹋油乳液加入到179 μL LB菌懸液中，輕輕振蕩使其混合均勻， 96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板中樣品在595 nm下的OD值。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 鴯鹋油時(shí)間殺菌曲線的測(cè)定

鴯鹋油抑菌活性可以通過(guò)平板計(jì)數(shù)法評(píng)估。將895 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液(105CFU/mL)和105 μL特定濃度(4MIC,2MIC,1MIC)的鴯鹋油乳液混合均勻。混合物37℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min。在培養(yǎng)時(shí)間0、1、2、3、4 h時(shí)，分別從混合物中取出100 μL，經(jīng)梯度稀釋后涂板。平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫升的細(xì)菌存活數(shù)，繪制時(shí)間殺菌曲線[13]。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞通透性的影響

取LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，離心并且用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，再懸浮于0.02 mol/L、pH 6.0磷酸鹽緩沖液中。菌懸液(OD600值為0.2)加入鴯鹋油乳液使終濃度為4MIC，置于37℃搖床中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4 h時(shí)取菌懸液測(cè)定260 nm處的OD值[14]。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算細(xì)胞膜破壞程度，評(píng)價(jià)鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞通透性的影響。

(1)

式中：A1為含有鴯鹋油的樣品組在各取樣時(shí)間點(diǎn)的OD值；A0為含有鴯鹋油的樣品組在0 h時(shí)的OD值；Ac為不含鴯鹋油的樣品組在各取樣時(shí)間點(diǎn)的OD值。

1.2.6 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的待測(cè)細(xì)菌菌液離心，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，接種10 mL的M9乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，離心，洗滌，用β-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸至OD600值為0.4。取895 μLβ-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液重懸的待測(cè)菌液，加入105 μL鴯鹋油乳液使終濃度為4MIC，再加入100 μL 1 mg/mL 的ONPG混勻，37℃水浴，每隔1 h測(cè)定405 nm處的ODt值[1]。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，吸光度為OD0，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面電位的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的待測(cè)細(xì)菌菌液離心，無(wú)菌超純水洗滌2次后重懸，加入鴯鹋油乳液使終濃度為4MIC，混勻，37℃孵育10 min，1 mmol/L KNO3(pH 6.2)溶液清洗兩次，重懸并稀釋至OD600值為0.2，室溫下用Zeta電位儀測(cè)定細(xì)菌表面電位[15]。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面疏水性的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的待測(cè)菌液離心，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，用0.1 mol/L KNO3(pH 6.2)溶液重懸至OD600值為0.2。取895 μL菌懸液于1.5 mL EP管，加入鴯鹋油乳液使終濃度為4MIC，再加入0.4 mL十六烷作為有機(jī)相，封口后，渦旋振蕩混勻，37℃孵育15 min，兩相完全分離，用移液槍快速吸取下層水相200 μL，以KNO3溶液為空白對(duì)照于600 nm處測(cè)定OD1值; 陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，渦旋振蕩混勻，37℃孵育15 min，取菌液在600 nm處測(cè)OD0值[16]。同時(shí)測(cè)定不加鴯鹋油的菌懸液的OD0及OD1值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)定十六烷對(duì)供試菌吸附率的變化檢測(cè)鴯鹋油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的影響。

十六烷吸附率=(1-OD1/OD0)×100%

(2)

1.2.9 鴯鹋油對(duì)供試菌總蛋白含量的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的待測(cè)細(xì)菌菌液離心，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，用新鮮的LB培養(yǎng)基重懸至OD600值為0.8。將菌懸液和鴯鹋油乳液混合均勻，使其終濃度為4MIC。在0 h和4 h分別取樣1 mL，5 000 r/min離心5 min，棄上清，收集菌體。金黃色葡萄球菌菌體中加入720 μL 10 mg/mL 溶菌酶，渦旋振蕩均勻，37℃孵育4 h，8 000 r/min離心3 min，轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的離心管中，作為可溶性蛋白質(zhì)部分。大腸埃希菌根據(jù)細(xì)菌活性化蛋白制備裂解液收集蛋白。根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白含量[17]。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10 鴯鹋油對(duì)供試菌DNA含量的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)細(xì)菌菌液離心，無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，新鮮LB培養(yǎng)基重懸至OD600值為0.8。將菌懸液和鴯鹋油乳液混合均勻，使其終濃度為4MIC。0 h和4 h分別取樣1 mL，室溫下8 000 r/min離心1 min[18]。根據(jù)Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒收集DNA。陰性對(duì)照參見(jiàn)表1對(duì)照組配方進(jìn)行制備，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.11 鴯鹋油對(duì)供試菌ATP酶活性的影響。

按1.2.9取0～4 h所得蛋白根據(jù)超微量總ATP酶(ATPase)測(cè)定試劑盒(比色法)進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.2.12 鴯鹋油對(duì)供試菌β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響

按1.2.9取0～4 h得到的蛋白500 μL加入1 000 μLβ-半乳糖苷酶反應(yīng)緩沖液、500 μL 10 mg/mL ONPG，振蕩混勻，37℃孵育2 h，在405 nm處測(cè)定OD值[20]。

1.2.13 鴯鹋油對(duì)供試菌堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響

按1.2.9取0～4 h得到的蛋白根據(jù)堿性磷酸酶(AKP)測(cè)定試劑盒(微板法)進(jìn)行測(cè)定[21]。

1.2.14 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS Statistics 19 軟件分析數(shù)據(jù)，采用Origin 2018b 軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 鴯鹋油最小抑菌濃度(MIC)(見(jiàn)表2)

最小抑菌濃度(MIC)能夠定量表示抑菌劑抑菌性能[22]。如表2所示，大腸埃希菌對(duì)鴯鹋油較為敏感，最小抑菌濃度為0.006 25%，對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.012 5%，并且鴯鹋油對(duì)沙門氏菌沒(méi)有表現(xiàn)出抑菌性。鴯鹋油乳液中雖然有乙醇和Tween 80，但這兩種表面活性劑并不會(huì)完全抑制大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

表2 鴯鹋油對(duì)供試菌的最小抑菌濃度

注：+，有菌生長(zhǎng)；-，無(wú)菌生長(zhǎng)。鴯鹋油濃度以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

2.2 鴯鹋油時(shí)間殺菌曲線(見(jiàn)圖1)

圖1 不同濃度鴯鹋油作用下大腸埃希菌(A)、金黃色葡萄球菌(B)時(shí)間殺菌曲線

細(xì)菌的時(shí)間殺菌曲線是將少量細(xì)菌接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基中，適宜條件進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)稀釋菌液通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液中的細(xì)菌存活數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌存活數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制得到的曲線[23]。如圖1所示，鴯鹋油對(duì)兩種供試菌有一定抑制效果，但抑制作用較為溫和。一般情況下細(xì)菌經(jīng)過(guò)1 h適應(yīng)期后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，但由于鴯鹋油乳液中含有的表面活性劑乙醇和Tween 80具有抑菌作用，所以1 h取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)出現(xiàn)了細(xì)菌存活數(shù)下降的現(xiàn)象。在2 h取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)菌存活數(shù)顯著提升，推測(cè)鴯鹋油對(duì)供試菌的抑制作用較為緩慢。2 h后，大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)開(kāi)始受到鴯鹋油的抑制，并且抑制強(qiáng)度同鴯鹋油濃度成正比。

2.3 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞通透性的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞通透性的影響

細(xì)菌細(xì)胞膜遭到破壞后，會(huì)造成胞內(nèi)大分子物質(zhì)的泄露，細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA會(huì)向外泄漏，通過(guò)測(cè)定260 nm下的OD值可對(duì)其進(jìn)行定量分析。通過(guò)公式(1)計(jì)算得到的比值越大，表明核酸物質(zhì)泄漏量越大。根據(jù)圖2可知，經(jīng)鴯鹋油處理后，兩種供試菌的細(xì)胞膜破壞程度隨時(shí)間的變化情況基本一致，但破壞性可以忽略不計(jì)。推測(cè)鴯鹋油基本不會(huì)破壞大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，細(xì)胞的整體性基本沒(méi)有受到破壞，所以2.2測(cè)定的時(shí)間殺菌曲線中，鴯鹋油處理組細(xì)菌數(shù)雖然減少，但并未降至0。

2.4 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌(A)、金黃色葡萄球菌(B)細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響

β-半乳糖苷酶是位于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的、被充分研究的一種水解酶，能夠在多糖代謝過(guò)程中水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。β-半乳糖苷酶可由細(xì)菌在乳糖誘導(dǎo)下產(chǎn)生，ONPG是乳糖的類似物，可以迅速進(jìn)入菌體，被β-半乳糖苷酶水解生成半乳糖和黃色的鄰硝基苯酚，在405 nm處有特征吸收。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜遭到破壞時(shí)，ONPG迅速進(jìn)入細(xì)胞，培養(yǎng)液OD值快速升高[24]，因此可用OD值變化來(lái)檢測(cè)鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的影響。如圖3所示，對(duì)照組乙醇和Tween 80的抑菌效果會(huì)使供試菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性的破壞程度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但3 h后均不再出現(xiàn)明顯增強(qiáng)。鴯鹋油處理可引起2種細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加，但同對(duì)照組相比細(xì)胞質(zhì)膜滲透性影響并非特別明顯，僅在培養(yǎng)末期表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。

2.5 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面電位的影響(見(jiàn)表3)

表3 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面電位的影響

細(xì)菌表面電荷由細(xì)胞表面化學(xué)結(jié)構(gòu)組成決定，大多數(shù)微生物在正常生理?xiàng)l件下都能表現(xiàn)出負(fù)電性的表面電荷。Zeta電位絕對(duì)值越小，菌體分散體系越不穩(wěn)定，各菌體之間的凝聚沉積作用越明顯[15]。如表3所示，鴯鹋油作用于供試菌后，2種細(xì)菌的電負(fù)性顯著減弱。鴯鹋油作用于細(xì)菌表面使表面電位升高的同時(shí)也增加了細(xì)胞表面的疏水性，有研究指出這可能會(huì)使菌體更容易凝集、成團(tuán)、變性。

2.6 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面疏水性的影響(見(jiàn)圖4)

圖4 鴯鹋油對(duì)供試菌細(xì)胞表面疏水性的影響

細(xì)菌在極性水中呈現(xiàn)出的不穩(wěn)定狀態(tài)可由細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性來(lái)表示。十六烷具有較強(qiáng)的疏水性且對(duì)微生物細(xì)胞無(wú)明顯損傷作用，可以通過(guò)測(cè)定十六烷對(duì)供試菌吸附率的變化檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性的變化[14]。如圖4所示，鴯鹋油作用后，2種細(xì)菌的表面疏水性同對(duì)照組相比都有一定程度提高。由此可推測(cè)鴯鹋油能使大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的表面疏水性增大，同時(shí)也會(huì)升高表面電位，同2.5測(cè)定的表面電位相對(duì)應(yīng)。

2.7 鴯鹋油對(duì)供試菌總蛋白含量的影響(見(jiàn)圖5)

圖5 鴯鹋油對(duì)供試菌總蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)的合成是細(xì)菌生命活動(dòng)的重要環(huán)節(jié)之一，蛋白質(zhì)作為酶、離子通道、受體及運(yùn)載體等在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[25]。如圖5所示，同對(duì)照組比較，鴯鹋油能使2種供試菌的總蛋白含量降低。根據(jù)細(xì)胞膜通透性的變化得出鴯鹋油基本沒(méi)有破壞供試菌的細(xì)胞膜，所以總蛋白含量的降低主要是由于合成減少，而不是泄露。這表明鴯鹋油可以抑制大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌總蛋白的合成，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更為顯著。

2.8 鴯鹋油對(duì)供試菌DNA含量的影響(見(jiàn)圖6)

圖6 鴯鹋油對(duì)供試菌DNA含量的影響

DNA是細(xì)胞核內(nèi)染色體的一個(gè)成分，儲(chǔ)藏遺傳信息。鴯鹋油對(duì)DNA合成產(chǎn)生影響時(shí)，也會(huì)對(duì)菌體內(nèi)的大分子合成產(chǎn)生影響，從而對(duì)供試菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[26]。如圖6所示，同對(duì)照組相比，鴯鹋油使2種供試菌DNA含量降低。2.3已推斷出鴯鹋油基本沒(méi)有破壞供試菌的細(xì)胞膜，所以DNA含量的降低主要是由于合成的減少，而不是泄露至菌體外。由此推斷鴯鹋油能夠抑制大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌DNA合成，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更為顯著。

2.9 鴯鹋油對(duì)供試菌ATP酶活性的影響(見(jiàn)圖7)

ATP酶能將ATP催化水解為ADP和磷酸根離子，其活性與菌體的能量代謝密切相關(guān)，影響菌體的物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞。菌體在缺氧及疾病狀態(tài)下，ATP酶活性會(huì)發(fā)生變化[27]。如圖7所示，鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌ATP酶活性均有抑制作用，但是二者效果不一致。乙醇和Tween 80的抑菌作用在鴯鹋油作用于大腸埃希菌的前2 h內(nèi)，使對(duì)照組和鴯鹋油組的ATP酶活性均明顯下降；2 h后，對(duì)照組ATP酶活性恢復(fù)，鴯鹋油的抑菌作用使得4MIC處理組的菌體ATP酶活性上升速度遠(yuǎn)小于對(duì)照組。乙醇和Tween 80使得對(duì)照組的金黃色葡萄球菌中ATP酶活性基本沒(méi)有發(fā)生變化，在一定范圍內(nèi)波動(dòng)；4MIC處理組的ATP酶活性在1 h 時(shí)有輕微下降，2 h時(shí)明顯下降且之后一直處于較低水平。鴯鹋油對(duì)供試菌的ATP酶活性均有一定的抑制作用：減緩大腸埃希菌ATP酶活性的恢復(fù)速度，抑制金黃色葡萄球菌的ATP酶活性恢復(fù)，使其一直處于較低的酶活性。

圖7 鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌(A)、金黃色葡萄球菌(B)ATP酶活性的影響

2.10 鴯鹋油對(duì)供試菌β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響(見(jiàn)圖8)

圖8 鴯鹋油對(duì)供試菌β-半乳糖苷酶表達(dá)活性的影響

微生物來(lái)源的β-半乳糖苷酶有胞外酶和胞內(nèi)酶兩種[28]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的為胞內(nèi)酶。如圖8所示，鴯鹋油使得兩種供試菌的β-半乳糖苷酶表達(dá)活性降低，但是抑制效果不顯著。鴯鹋油不能顯著抑制兩種供試菌的β-半乳糖苷酶活性，表明其對(duì)供試菌的細(xì)胞膜基本沒(méi)有影響，同2.3相對(duì)應(yīng)。

2.11 鴯鹋油對(duì)供試菌堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響(見(jiàn)圖9)

圖9 鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌(A)、金黃色葡萄球菌(B)堿性磷酸酶表達(dá)活性的影響

堿性磷酸酶(AKP)存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，正常情況下胞外檢測(cè)不到其活性[29]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)破碎菌體細(xì)胞來(lái)檢測(cè)AKP活性。如圖9所示：鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的AKP活性均有一定抑制作用，在作用后的3 h內(nèi)，抑制了AKP活性，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制更為顯著；3 h后，鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌的AKP活性基本不再有影響，相比對(duì)照組，鴯鹋油對(duì)金黃色葡萄球菌的AKP活性仍有一定抑制效果，但是AKP活性已逐漸恢復(fù)。

3 結(jié) 論

鴯鹋油對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌具有較好的抑制作用。大腸埃希菌對(duì)鴯鹋油較為敏感，最小抑菌濃度為0.006 25%，金黃色葡萄球菌為0.012 5%。鴯鹋油主要通過(guò)影響供試菌細(xì)胞表面特性抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，減弱細(xì)菌表面電荷負(fù)荷性，提高細(xì)菌表面疏水性，也通過(guò)影響ATP酶活性改變細(xì)菌新陳代謝速率。鴯鹋油基本不影響大腸埃希菌的蛋白合成能力、DNA合成能力、β-半乳糖苷酶及AKP活性，但是能夠降低金黃色葡萄球菌的相應(yīng)大分子合成能力和β-半乳糖苷酶、AKP活性。該研究可以為鴯鹋油抗菌各基礎(chǔ)指標(biāo)研究奠定基礎(chǔ)，也可以為鴯鹋油食物抗菌劑的開(kāi)發(fā)研究提供新的思路與途徑。