曹越琦 薛超 黎偉 黃莉 何佩耕

廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腎內科（南寧530007）

原發(fā)性抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎（anti-neutrophi cytoplasmic antibodies associated vasculitis，AAV）是以小血管壁炎癥及纖維素樣壞死為病理特點，寡免疫復合物沉積為特征的自身免疫性疾病［1］。目前我國尚缺乏對AAV 的大型流行病學研究，其臨床表現(xiàn)多樣，后期治療花費大，及早診斷格外重要。AAV 發(fā)病機制復雜，研究表明可能與感染、遺傳、環(huán)境等［2］多重因素相關，其中遺傳因素可能是AAV 發(fā)病的關鍵因素。信號轉導和轉錄激活因子-4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）基因位于人類染色體2q32.35 上，其編碼的轉錄因子負責傳遞多種細胞內信號［3］，參與先天性和適應性免疫等復雜調控過程，介導炎癥反應和組織細胞壞死［4］。已有研究報導，STAT4 基因多態(tài)性與RA、SSc、SLE 等［5-7］諸多自身免疫性疾病遺傳易感性存在關系，但STAT4 基因多態(tài)性在AAV 中的遺傳學意義不甚明確?；谏鲜?，本研究初步探討STAT4 rs10181656位點基因多態(tài)性與廣西漢族人群AAV 及臨床癥狀的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究已獲得廣西醫(yī)科大學倫理委員會的批準及全體納入對象及家屬的知情同意。納入標準：經臨床確診為原發(fā)性AAV 的患者，并未累及全身大中動脈；診斷符合2012年第二屆Chapel Hill 國際血管炎命名會議［8］的標準；相互間無血緣關系的漢族人群。排除標準：繼發(fā)于藥物等因素的小血管炎；合并其他自身免疫性疾病的患者；嚴重感染或合并臟器功能衰竭患者；合并腫瘤、糖尿病或精神疾病的患者；哺乳期及妊娠患者。參照上述標準，確定的病例組為122 例漢族原發(fā)性AAV 患者，均于2005年1月至2018年12月期間在廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院確診。對照組為性別、年齡相仿的同期體檢中心的155 例健康體檢人群。病例組和對照組的年齡、性別間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 外周血DNA提取 每個納入對象均抽取2 mL乙二胺四乙酸抗凝靜脈全血，提取基因組DNA 采用快速DNA 提取試劑盒（北京天根生化公司）。

1.3 基因分型 上游引物：5′-TGGAATAGGGGC AGCTGTTT-3′，下游引物：5′- GCTGCCATGTCGAGAGTAAC-3′（上海生工生物技術有限公司）。PCR 擴增反應體系：上下游引物分別0.5 μL，全血DNA 模板1 μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）（美國Fermentas 公司）10 μL，dd H2O 補足至13 μL。PCR 反應（美國ABI 公司）：94 ℃5 min，94 ℃30 s，61 ℃45 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)后，72 ℃5 min，4 ℃結束。酶切體系20 μL 包括限制性內切酶Dde I 0.5 μL（美國NEB 公司），buffer R 2 μL，dd H2O 7.5 μL，擴增產物10 μL，混和搖勻后于37 ℃水浴。反應完成后電泳跑膠，利用凝膠成像儀（美國Bio-RAD 公司）行基因分型。選取不同基因型標本送上海生工生物技術公司測序驗證。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，Hardy-Wein berg 遺傳平衡以P＞0.05 表示群體具有代表性。計數資料比較采用χ2檢驗，Logistic 回歸分析計算優(yōu)勢比（OR）及95%置信區(qū)間（95%CI）評估基因多態(tài)性與AAV 易感性及臨床癥狀發(fā)生風險之間的關聯(lián)，結果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基因型測定 STAT4 rs10181656 位點PCR 產物長333 bP，限制性內切酶消化后，基因型CC 長度仍為333 bP，GG 被切分為長105 bP 和228 bP 的2 種片段，CG 被切分為長333、228、105 bP 的3 種片段。酶切結果見圖1，測序結果見圖2。

圖1 STAT4 rs10181656 基因測定分型圖Fig.1 Genotyping figure of rs10181656

圖2 rs10181656 測序圖Fig.2 Sequencing figure of rs10181656

2.2 基因型及等位基因頻率分析 STAT4 rs10181656的病例組（χ2=3.673，P=0.055）與對照組（χ2=1.943，P=0.163）均符合Hardy-Weinberg 平衡，比較病例組與對照組的基因型（χ2= 6.189，P=0.045）和等位基因頻率（χ2=5.323，P=0.021），差異均具統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 病例組與對照組的基因型及等位基因頻率對比Tab.1 Comparison of genotype and allele frequency of site in cases and controls 例（%）

2.3 基因多態(tài)性與AAV 易感性的Logistic 回歸分析 以rs10181656 位點基因型為自變量，AAV 是否發(fā)病為因變量做Logistic 回歸分析，以野生純合型CC 為參照（OR= 1），發(fā)現(xiàn)GG 基因型發(fā)病風險的相對危險度為2.827（OR= 2.827，95%CI：1.207～6.621，P=0.017），較CC 者具有較高的AAV 發(fā)病風險；以等位基因C 為參照（OR= 1），G 等位基因攜帶者發(fā)病風險的相對危險度為1.537（OR=1.537，95%CI：1.066 ～2.217，P=0.021）。見表2。

表2 基因多態(tài)性與AAV 易感性的Logistic 回歸分析Tab.2 Logistic regression analysis of gene polymorphism and AAV susceptibility

2.4 基因型多態(tài)性與臨床癥狀的關系 根據AAV患者是否伴血尿、蛋白尿、咯血、水腫等臨床癥狀分亞組，發(fā)現(xiàn)rs10181656位點基因型及等位基因頻率在AAV 患者伴血尿和不伴血尿亞組中的分布差異均有統(tǒng)計學意義（基因型：χ2= 6.192，P= 0.045；等位基因：χ2=5.337，P=0.021）。見表3。

2.5 基因型多態(tài)性與臨床癥狀的Logistic 回歸分析 分析rs10181656 位點的基因型頻率差異與患者是否伴血尿有關，進一步行Logistic 回歸分析，以野生純合型CC為參照（OR=1），發(fā)現(xiàn)GG+CG基因型具有較高的血尿發(fā)生風險（OR= 2.603，95%CI：1.017 ～2.664，P =0.046）。同樣，以等位基因C 為參照（OR= 1），等位基因G 攜帶者具有較高的血尿發(fā)生風險（OR= 2.393，95%CI：1.127 ～5.081，P=0.023）。

表3 rs10181656 基因型及等位基因在AAV 臨床癥狀亞組中的分布Tab.3 The distribution of rs10181656 genotype and allele in AAV with clinical symptoms 例（%）

3 討論

STAT4 是STAT 家族中較為特殊的一員，其表達譜有限，主要分布在富含免疫細胞的組織，如淋巴和髓系組織中［9］。STAT4 通過編碼轉錄因子激活一系列炎癥因子，加速Th1 和Th17 細胞的分化，導致體內Thl/Th2 細胞失衡［10］，影響IL-12 和IL-23通路，并且激活干擾素（IFN）信號［11］，打破正常人體的免疫耐受。已有研究證實諸多炎性和自身免疫性疾病中均存在上述細胞因子失衡［12］，KLING等［13］發(fā)現(xiàn)AAV 患者中普遍存在以Th-17 為主的Th細胞的異常分化，增強效應細胞的細胞毒性，從而引起相應靶器官的損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，STAT4 rs10181656 位點中，等位基因和基因型在病例組與對照組中分布差異顯著，基因型為GG 及等位基因G 攜帶者的AAV 發(fā)病風險遠大于野生純合型CC 及C 等位基因攜帶者，提示STAT4 rs10181656 可能與中國廣西漢族人群AAV 易感性相關。YAN 等［14］證實在中國漢族人群中，rs10181656 的G 等位基因與自身免疫性甲狀腺疾病存在相關；相反，在韓國人群中，rs10181656中G 等位基因與自身免疫性甲狀腺疾病易感性無關［15］。另一方面，在瑞典人群中，rs10181656 中次要等位基因G 可增加類風濕關節(jié)炎發(fā)病風險［16］，但在希臘人群中并未發(fā)現(xiàn)其與類風濕關節(jié)炎發(fā)病風險有關［17］。筆者推測rs10181656 基因多態(tài)性在不同地區(qū)、不同疾病間的作用機制不甚相同?？紤]到人群及樣本量的限制，仍需后續(xù)更多學者行大樣本、多人群的深層次研究。

另外，GG 基因型頻率在AAV 伴血尿患者中較高，提示STAT4 rs10181656 基因多態(tài)性可能與腎臟累及有關。TEBBUTT等［18］發(fā)現(xiàn)，活化的T細胞對腎臟和肺臟具有較強的親和力，可引起大量中性粒細胞和巨噬細胞聚集在腎及肺臟［19］，使相應的組織嚴重受累，出現(xiàn)不同臨床癥狀。既往研究顯示STAT3基因多態(tài)性與咯血癥狀相關［20］，而腎臟及肺臟受累同樣被證實是血管炎預后不良的主要危險因素［21］。因此筆者推測不同基因家族介導的炎癥通路可能受位點突變影響，導致炎癥細胞活化程度不同，從而引發(fā)不同基因型間患者臟器受累的差異?？紤]患者病情進展程度不同，故結果須辯證看待。

綜上所述，STAT4 rs10181656 基因多態(tài)性與中國廣西漢族人群AAV易感性相關，與患者血尿發(fā)生相關。但由于目前實驗標本規(guī)模較小，納入對象及人群較局限，且隨訪時間較短，未能除個人群分層及實驗方法等誤差可能。后續(xù)仍需更多學者開展不同地區(qū)的STAT4基因通路的研究，將有助于尋找AAV發(fā)病的易感基因，研究開發(fā)針對STAT4或其下游介質的靶向藥物，為AAV臨床治療提供新方法。