李萬奎，楊惠然，黃杰

(1.河南圣德醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 信陽 464000；2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.醫(yī)學(xué)部;b.體育部，河南 信陽 464000)

近年來研究表明，腦出血后由于釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)、凝血酶及其他代謝產(chǎn)物，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，血腦屏障破壞，炎癥因子大量釋放，從而導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞損傷[1]。在這些炎癥因子中，以白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)關(guān)系最為密切[2]。鈣離子通道作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，在腦出血后神經(jīng)功能損傷中起重要作用[3]。尼莫地平是新一代二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，具有較好的脂溶性，可透過血腦屏障，已廣泛應(yīng)用于腦出血的臨床治療。本研究采用注入自體血的方法建立大鼠腦出血模型，給予尼莫地平干預(yù)，通過觀察大鼠腦組織含水量及腦組織勻漿液中IL-6、TNF-α含量，探討尼莫地平對(duì)腦出血后腦水腫、炎癥因子的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1藥物 尼莫地平標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.1.2器材 立體定向儀、微量注射儀(瑞沃德生命科技有限公司)，微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)，電子天平(上海精科天平)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械有限公司)，721分光光度計(jì)(上海湖光科技儀器廠)，酶標(biāo)儀(北京市六一儀器廠)。

1.1.3試劑 IL-6試劑盒、TNF-α試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)對(duì)象 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，雌雄不限，體質(zhì)量為250～300 g，許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001，由信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究方案由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有試驗(yàn)均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施GB 14925-2010》，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與造模 將大鼠以隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組、腦出血模型組和尼莫地平治療組，每組24只。模型組采用Fredrik法[4]取自體股動(dòng)脈血50 μL注入大鼠基底節(jié)區(qū)復(fù)制實(shí)驗(yàn)性腦出血模型。尼莫地平治療組在造模后予以尼莫地平5 mg·kg-1腹腔注射治療，每12 h注射1次，直至處死前12 h。假手術(shù)組制備過程相同，基底節(jié)區(qū)注入等體積9 g·L-1的NaCl溶液。術(shù)后72 h時(shí)，斷頭處死大鼠，做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2檢測(cè)方法

1.2.2.1腦組織含水量觀察 腦組織含水量采用干濕重法[5]測(cè)定：每組各取12只大鼠，斷頭處死后迅速取腦組織(去除腦干、小腦及嗅球)，將取出的腦組織放在9 g·L-1的NaCl溶液濕潤(rùn)的濾紙培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)。去除腦皮質(zhì)表面的腦膜和血塊，濾紙吸干表面水分，迅速放入預(yù)先稱重(A)帶瓶塞的玻璃瓶中，立即稱重(B)，B-A即得濕重。去掉瓶塞，放入70 ℃恒溫干燥箱中烘干72 h，取出腦組織，待其恢復(fù)到室溫，再將瓶塞扣緊稱重(C)，C-A即得干重。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/濕重×100%，即(B-C)/(B-A)×100%。

1.2.2.2IL-6、TNF-α含量測(cè)定 再取各組12只大鼠，冰上斷頭處死，迅速取血腫邊緣腦組織約0.2 g，分離后稱重，用9 g·L-1的NaCl溶液除去血液，濾紙吸干，放入5 mL小燒杯中，加入適量冰鹽水。將腦組織放入玻璃勻漿器中進(jìn)行勻漿，充分研磨腦組織，制成40%腦組織勻漿液，4 ℃，每分鐘3 000轉(zhuǎn)，離心30 min，取上清液置-20 ℃冰箱中保存，酶聯(lián)免疫法測(cè)定按試劑盒說明書方法操作，計(jì)算出樣品含量。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量腦出血模型組腦組織含水量為(83.71±4.89)%，高于假手術(shù)組的(73.19±3.33)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 1)。尼莫地平治療組腦組織含水量為(78.79±3.59)%，低于腦出血模型組的(83.71±4.89)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034 2)。

2.2 IL-6和TNF-α含量腦出血模型組腦組織勻漿液IL-6、TNF-α高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 4、0.007 3)。尼莫地平治療組腦組織勻漿液IL-6、TNF-α低于腦出血模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034 5、0.017 1)。見表1。

表1 各組IL-6和TNF-α測(cè)定結(jié)果比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血模型組比較，bP<0.05；IL-6—白細(xì)胞介素-6；TNF-α—腫瘤壞死因子-α。

3 討論

目前認(rèn)為，腦出血后血腫邊緣存在的水腫，既有血管源性水腫，又有細(xì)胞源性水腫[6]。腦水腫的產(chǎn)生除了因細(xì)胞內(nèi)鈣超載致使受鈣調(diào)節(jié)的磷脂酶、蛋白酶、核酸內(nèi)切酶等被激活而導(dǎo)致血腦屏障破壞外[7]，還與腦出血后產(chǎn)生的炎癥因子IL-6、TNF-α等的釋放有關(guān)[8-9]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，IL-6主要源于巨噬細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞、有活性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)既有神經(jīng)保護(hù)作用，又有神經(jīng)毒性作用，正常情況下，神經(jīng)細(xì)胞中低水平IL-6發(fā)揮中樞介導(dǎo)、神經(jīng)修復(fù)等生理作用，但腦出血后IL-6表達(dá)異常增高，參與神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程[10]。異常升高的IL-6可抑制前列腺素E2的產(chǎn)生，引起血管收縮，加重腦水腫，增加細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，加重血腦屏障破壞和神經(jīng)功能損害[11]。IL-6作為重要的炎癥因子，反映急性腦血管疾病的促炎狀態(tài)，可作為患者預(yù)后判斷的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)[12]。在正常情況下，外周巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α不能通過血腦屏障，但在腦出血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后，由于血腦屏障的破壞，致使TNF-α可進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，可通過促進(jìn)凝血、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性及誘導(dǎo)黏附分子或其他炎癥介質(zhì)的表達(dá)，增加血腦屏障的通透性，加重腦損傷[13]。大量研究表明，腦出血后血腫周圍腦組織TNF-α mRNA蛋白表達(dá)升高[14-15]。作為鈣離子拮抗劑的尼莫地平，可有效地減輕神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，減輕病灶部位的血管痙攣[16]，提高腦出血后局部血流量[17]，保護(hù)血腦屏障，緩解腦出血后腦水腫，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。本研究中，腦出血模型組腦含水量升高，IL-6和TNF-α水平亦升高，說明腦出血后，除了引起腦組織水腫，還引起炎癥介質(zhì)的釋放。尼莫地平組大鼠腦組織含水量及腦組織勻漿中IL-6、TNF-α降低，說明尼莫地平不僅可改善腦水腫，還可抑制炎癥反應(yīng)。楊燚等[18]研究表明，大鼠腦梗死后出血腦水腫高峰期與IL-6、TNF-α表達(dá)高峰時(shí)間基本一致，說明IL-6和TNF-α介導(dǎo)了腦梗死后出血腦組織炎癥反應(yīng)，參與了腦水腫的發(fā)生和神經(jīng)功能的損害。

綜上，尼莫地平可有效減輕腦水腫，減輕腦出血后異常產(chǎn)生IL-6和TNF-α對(duì)腦組織的損害，抑制炎癥反應(yīng)。但是抑制炎癥反應(yīng)這一療效是因尼莫地抑制鈣超載引起，還是尼莫地平本身的其他藥理作用，目前尚不清楚，還需要長(zhǎng)時(shí)間、大樣本、更深入的進(jìn)一步研究。