江連洲 朱 穎 王中江

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

大豆是我國重要的經(jīng)濟作物之一，營養(yǎng)豐富，含有約40%的蛋白質(zhì)、18%的脂肪、25%的碳水化合物、維生素和生理活性物質(zhì)，是人類生存不可或缺的重要食品來源。為促進我國大豆加工業(yè)的持續(xù)發(fā)展，明確加工過程中大豆各組分的分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)及功能特性等因素的變化規(guī)律及其相互作用機制至關(guān)重要。蛋白質(zhì)的空間三維結(jié)構(gòu)是其生化功能及細胞功能的基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)可以了解蛋白質(zhì)的生物角色、分子間相互作用等重要特征。天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不是靜止不動的，它的隨機運動造成蛋白質(zhì)側(cè)鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變，使蛋白質(zhì)表現(xiàn)出一定的結(jié)構(gòu)柔性，在不同環(huán)境條件下，實現(xiàn)其功能的多樣性[1]。蛋白質(zhì)的柔性區(qū)間（Flexible region）一般可以理解為在蛋白質(zhì)分子中的空間結(jié)構(gòu)中，易于發(fā)生改變的部分，而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定固化不易改變的部分稱為剛性區(qū)間（Rigid region）[2]。

目前，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性的認知僅局限于分子識別、酶催化、藥物分子設(shè)計、抗原-抗體相互作用和變構(gòu)調(diào)節(jié)等領(lǐng)域，并未直接引入食品蛋白加工領(lǐng)域。本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)大豆蛋白結(jié)構(gòu)存在柔性區(qū)間，且柔性區(qū)間部分影響大豆蛋白結(jié)構(gòu)折疊/解折疊、亞基聚合/解離等，然而，現(xiàn)有研究并未準(zhǔn)確定位大豆蛋白柔性區(qū)間分布，且未清晰描述出柔性結(jié)構(gòu)的形態(tài)。另外，對大豆蛋白分子折疊的具體過程尚未了解，而通過研究蛋白質(zhì)的柔性區(qū)間，可以深入探索這一問題。對于大豆蛋白柔性區(qū)間預(yù)測及結(jié)構(gòu)模擬具有重要意義。

大豆蛋白因其優(yōu)越的界面功能性（如乳化性、泡沫性及成膜性等）而被廣泛應(yīng)用于食品加工中。研究表明，大豆蛋白分子進入液/液或氣/液界面，可通過分子間交互作用在界面處形成致密的蛋白吸附層，發(fā)生構(gòu)象重排。大豆蛋白在界面處發(fā)生的不可逆去折疊過程一般被稱為“柔性舒張”。大豆蛋白在此過程中的柔性區(qū)間遷移及轉(zhuǎn)變決定了大豆蛋白的界面學(xué)性質(zhì)?，F(xiàn)行研究多從分子靜態(tài)結(jié)構(gòu)角度探究蛋白質(zhì)界面功能的構(gòu)效關(guān)系，大多忽略柔性區(qū)間的作用，而結(jié)構(gòu)柔性區(qū)間可用于描述蛋白質(zhì)構(gòu)象的運動性，進而深入解讀界面吸附大豆蛋白結(jié)構(gòu)重排規(guī)律。明確大豆蛋白在界面吸附、舒張過程中，區(qū)間結(jié)構(gòu)的剛/柔性轉(zhuǎn)變規(guī)律，對開發(fā)具有良好界面功能性的大豆蛋白具有重要的現(xiàn)實意義。

1 蛋白質(zhì)柔性區(qū)間預(yù)測

蛋白質(zhì)柔性區(qū)間通常包括側(cè)鏈柔性和骨架柔性兩種。側(cè)鏈柔性已有較清晰地解釋，且已被應(yīng)用于大量蛋白質(zhì)-配體對接和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接應(yīng)用中。相對而言，骨架柔性在現(xiàn)階段并未得到有效應(yīng)用，由于其比前者更復(fù)雜[3]。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的柔性部分往往與蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可以隨周圍環(huán)境的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化，或者在與其它生物大分子，如蛋白質(zhì)及核酸等相互作用時，發(fā)生相應(yīng)的變化，因此蛋白質(zhì)的柔性區(qū)間對于其正常發(fā)揮功能至關(guān)重要?？梢岳靡阎鞍踪|(zhì)的鏈狀結(jié)構(gòu)特點，選擇某種特定的算法，從一條可見的鏈狀結(jié)構(gòu)氨基酸序列，預(yù)測該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，從而確定蛋白的柔性區(qū)間。

郝海霞等[4]通過計算機設(shè)計出模擬蛋白質(zhì)折疊構(gòu)型的HP正交格點模型，該模型廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)和折疊動力過程，最優(yōu)構(gòu)象表現(xiàn)出明顯的疏水核心，疏水氨基酸聚集在網(wǎng)格中央，親水氨基酸分布在網(wǎng)格外圍，符合真實蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特點。此外，三維歐式空間的連續(xù)模型為蛋白質(zhì)預(yù)測問題提供一種新的有力算法。已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列由疏水氨基酸和親水氨基酸組成，其空間構(gòu)型由疏水氨基酸緊密結(jié)合在一起。依據(jù)這種特性，陳克賓等[5]提出了相關(guān)的模型和算法，通過對現(xiàn)有的預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型和算法的比較和分析，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有算法都是利用離散模型來描述蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用模擬退火、遺傳算法等方法來通過對蛋白質(zhì)的一維氨基酸序列的演算，而獲得蛋白質(zhì)的三維空間構(gòu)型。欒忠蘭等[6]利用Backrub模型對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行柔性建模，它是一個基于高分辨率晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的構(gòu)象波動而建立的一個簡單描述柔性的運動模型，模擬真實蛋白質(zhì)的運動，將兩種建模方法應(yīng)用于點突變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測問題中，并將預(yù)測結(jié)果與Rosetta串行擾動模型相比較，分析天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性建模符合一定的生物學(xué)意義，能夠更好地模擬真實蛋白質(zhì)構(gòu)象上的波動。Rohl等[7]利用Rosetta算法對內(nèi)源性蛋白質(zhì)進行預(yù)測，模型細化，循環(huán)建模，剛性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)對接及蛋白質(zhì)設(shè)計。Bornot等[8]通過生物信息學(xué)的方法研究表明，蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)比剛性結(jié)構(gòu)更能體現(xiàn)蛋白質(zhì)的功能性，并且嘗試從蛋白質(zhì)序列的角度來預(yù)測其結(jié)構(gòu)柔性。Marsh等[9]研究表明，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域有助于同源和非同源的亞基組合成4級結(jié)構(gòu)，來表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象特征。Scott等[10]使用Fleximatch方法，采用核磁共振，X-射線衍射或分子模擬，研究蛋白質(zhì)的空間折疊、蛋白質(zhì)剛/柔性結(jié)構(gòu)、原子旋轉(zhuǎn)時蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，研究可視化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并對剛/柔性結(jié)構(gòu)部分進行定位。Hao等[11]結(jié)合核磁共振和石英晶體微量天平來測定蛋白柔性，通過離子交換色譜中蛋白分子的保留時間、保留因子及靜態(tài)結(jié)合能力來定量蛋白柔性。

2 蛋白結(jié)構(gòu)柔性對界面功能性的影響

蛋白質(zhì)的剛性、柔性影響蛋白質(zhì)的工程特性、營養(yǎng)特性和生物功能。葛世軍等[12]最早探討了蛋白質(zhì)的平均分子質(zhì)量、水化面積、極性、疏水性、柔性及電荷分布與酶作用的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)柔性是決定蛋白質(zhì)性質(zhì)，尤其是功能性質(zhì)的重要因素之一，其實質(zhì)上反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的運動性，而功能性質(zhì)，如乳化性質(zhì)、起泡性質(zhì)、溶解度等都與蛋白質(zhì)構(gòu)象的運動性有關(guān)。通過現(xiàn)代高新技術(shù)手段，對蛋白質(zhì)進行適當(dāng)?shù)募庸砀淖兊鞍踪|(zhì)天然的剛性結(jié)構(gòu)，使其柔性化，從而極大地提高蛋白質(zhì)的工程特性、營養(yǎng)特性和生物功能等綜合應(yīng)用價值，使得蛋白質(zhì)更好地發(fā)揮其功能作用。

已有研究表明大豆蛋白界面功能特性取決于亞基組成、親/疏水性、分子積聚狀態(tài)、亞基締合/解離形式、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用等方面。蛋白質(zhì)的界面功能性表達經(jīng)過分子吸附、結(jié)構(gòu)重排、界面擴張等復(fù)雜過程，從蛋白質(zhì)的天然穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)中，難以分析界面功能性表達的構(gòu)效關(guān)系，而通過柔性結(jié)構(gòu)分析，確定功能單位或結(jié)構(gòu)域，可為大豆蛋白界面功能性質(zhì)的研究，提供可靠依據(jù)。

Vicedo等[13]研究發(fā)現(xiàn)天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中原子的隨機運動造成蛋白質(zhì)側(cè)鏈的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的區(qū)域具有不同程度的柔性表現(xiàn)，以適應(yīng)不同環(huán)境條件，并實現(xiàn)其功能的多樣性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性取決于骨架結(jié)構(gòu)及微環(huán)境變化，且反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的運動性，研究表明，界面功能性如乳化性、起泡性和成膜性等均與大豆蛋白構(gòu)象的運動性有關(guān)。Kato等[14]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的界面功能與結(jié)構(gòu)柔性密切相關(guān)，分子結(jié)構(gòu)柔性越大，起泡性、成膜性及界面吸附能力越強。Maruyama等[15]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)特征和理化功能性質(zhì)（如溶解度、乳化性）存在一定的相關(guān)性，大豆蛋白結(jié)構(gòu)變化可影響界面吸附蛋白結(jié)構(gòu)的重排速率，進而影響界面吸附行為表達。Townsend等[16]研究表明大豆蛋白起泡性取決于柔性/剛性區(qū)間比例，兩者比例越大，蛋白質(zhì)起泡性越強。天然大豆蛋白中多存在剛性區(qū)間，因此界面功能性差。通過調(diào)控大豆蛋白結(jié)構(gòu)柔性，可加速蛋白界面處吸附速率，提高蛋白質(zhì)液/液及氣/液界面穩(wěn)定性。Tang等[17]研究表明糖基化過程中蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生柔性舒張，并指出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性對其界面學(xué)性質(zhì)影響顯著。Gutin等[18]通過研究提出了蛋白質(zhì)分子發(fā)生柔性舒張過程的機理：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)間構(gòu)象易于發(fā)生改變，從而使整個蛋白質(zhì)分子具有易吸附于液/液或氣/液界面處的空間構(gòu)象。Flores等[19]提出，蛋白質(zhì)在界面處柔性區(qū)間舒張過程中，以鉸鏈?zhǔn)降膹澢\動為主。Tang等[20]通過探索氧化修飾牛血清蛋白空間結(jié)構(gòu)的柔性對其乳化性的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白的骨架結(jié)構(gòu)對其乳化性質(zhì)有重要影響，例如：界面吸附蛋白更易于解折疊或產(chǎn)生交互作用，形成黏彈性界面層。大豆蛋白吸附到油水界面后通過調(diào)整疏水/親水的平衡，使結(jié)構(gòu)發(fā)生一定重排，空間結(jié)構(gòu)在油滴表面展開，形成致密的蛋白膜以維持界面層的穩(wěn)定性。Freer等[21]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)吸附動力學(xué)受分子尺寸和結(jié)構(gòu)的強烈影響，蛋白接近界面的難易程度受分子形態(tài)的影響，進一步證實柔性蛋白比球蛋白更容易在界面上展開和重排。根據(jù)Anfinsen的“熱力學(xué)假定”，適當(dāng)?shù)臒崽幚怼㈦x子強度或pH值變化可誘導(dǎo)大豆蛋白柔性結(jié)構(gòu)舒張，利于其在界面處迅速展開，改善大豆蛋白的界面學(xué)性質(zhì)。

蛋白因其有優(yōu)越的功能性（如乳化性、起泡性、成膜性等）被廣泛應(yīng)用于食品加工中，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)間與蛋白質(zhì)的功能性密切相關(guān)，對于蛋白結(jié)構(gòu)柔性對功能性的影響認識多聚集于界面功能性方面，且近年來諸多研究表明高壓、超聲、輻照、脈沖電場、微波和微射流等物理加工技術(shù)可以改變蛋白剛?cè)嵝詤^(qū)域分布，進而影響蛋白質(zhì)界面功能性。

Subirade等[22]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理使β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)柔性展開，并伴隨著亞基的解離與重聚，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，從而提高β-乳球蛋白在界面處的吸附能力。Tang等[23]研究表明酸性條件下，高壓處理可導(dǎo)致大豆蛋白內(nèi)部柔性區(qū)域暴露，能在較溫和條件下使蛋白分子發(fā)生可溶性聚集，有效地改善了蛋白溶解性。Keerati-U-Ra等[24]通過對比高壓對β-大豆伴球蛋白和大豆球蛋白功能性質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，動態(tài)超高壓均質(zhì)會改變大豆蛋白的超分子結(jié)構(gòu)，形成柔性及半柔性聚集體，改善β-伴大豆球蛋白的成膜性。Jambrak等[25]研究表明，超聲處理通過產(chǎn)生空化和機械作用，降低了蛋白質(zhì)粒度及分子質(zhì)量，改變了蛋白中剛/柔性區(qū)間分布。以此為基礎(chǔ)，本團隊進一步研究發(fā)現(xiàn)超聲處理后黑豆蛋白的界面吸附能力及起泡能力分別提高了18%和31%[26]。另外，超聲處理下大豆蛋白結(jié)構(gòu)的柔性舒張促進了糖基化反應(yīng)，改善了蛋白的界面吸附特性[27-30]。輻照處理可促進紅豆蛋白的剛性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為柔性結(jié)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)的界面吸附性、起泡性以及成膜性[17]。Fernandez等[31]發(fā)現(xiàn)利用指數(shù)衰減波脈沖電場處理蛋白，可誘導(dǎo)蛋白柔性結(jié)構(gòu)舒張，進而提高蛋白質(zhì)的持水性及起泡性。

姚玉靜等[32]采用三偏磷酸鈉對大豆蛋白柔性結(jié)構(gòu)變化進行研究，結(jié)果顯示，經(jīng)過STMP處理過的大豆蛋白乳化性能、溶解性能以及持水性有顯著提高，而且等電點向酸性區(qū)域遷移。Tang等[33]研究表明，在酸性條件下大豆蛋白會發(fā)生亞基解離，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)柔性展開，內(nèi)部疏水性基團暴露，在此基礎(chǔ)上配合高壓處理等手段，能在較溫和條件下使蛋白質(zhì)分子發(fā)生可溶性聚集，有效地改善了蛋白界面功能性。近年來，本團隊致力于生物柔性解離技術(shù)提取大豆油脂及蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)伴隨著蛋白質(zhì)逐級水解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子剛性區(qū)間逐步解離，改變了蛋白質(zhì)界面功能特性，提高了目標(biāo)產(chǎn)物的分離效果[34]。團隊成員李楊等[35-37]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆分離蛋白經(jīng)水解為低聚肽混合物，酶解過程并未改變綠豆蛋白的氨基酸組成，然而蛋白質(zhì)剛?cè)釁^(qū)間發(fā)生重組，表現(xiàn)出高水溶性、低黏度、強穩(wěn)定性等特點。團隊成員胡少新等[38]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)“牢固”，難以被蛋白酶解，而對大豆蛋白適當(dāng)?shù)丶訜嶙冃蕴幚?，有利于蛋白質(zhì)分子剛性區(qū)間結(jié)構(gòu)解折疊，位于柔性區(qū)間的酶解作用位點增多，更易于獲取高抗氧化性、功能性蛋白肽。研究指出在分子水平上，蛋白質(zhì)形成泡沫穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)柔性密切相關(guān)[39-41]。

3 總結(jié)語

通過對蛋白質(zhì)柔性區(qū)間的預(yù)測，來確定大豆蛋白柔性區(qū)間，表征大豆蛋白界面結(jié)構(gòu)柔性特征。通過結(jié)構(gòu)柔性區(qū)間定位可明確蛋白質(zhì)分子的運動軌跡，更進一步探究界面吸附大豆蛋白結(jié)構(gòu)重排規(guī)律，明確大豆蛋白在界面吸附舒張過程中區(qū)間結(jié)構(gòu)的剛/柔性轉(zhuǎn)變規(guī)律，對大豆蛋白分子柔性加工及界面功能性應(yīng)用，具有重要的現(xiàn)實意義。