施芬，羅漢清

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院新洲院區(qū)&新洲區(qū)人民醫(yī)院兒科，武漢 430400)

兒童膿毒癥是造成患兒死亡的重要原因之一[1]。膿毒癥患兒早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且診斷手段有限，常因此延誤診治而導(dǎo)致不良預(yù)后。尋找新的兒童膿毒癥診斷標志物對提高膿毒癥診治水平具有極其重要的意義。外泌體是由多種類型細胞分泌的直徑為30～150 nm 的小囊泡， 其含蛋白質(zhì)、mRNA及長鏈非編碼RNA(LncRNA)等，可在細胞間轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)細胞間信息的傳遞，并參與機體感染、炎癥及氧化過程[2-3]。

研究表明，LncRNA HOXA11-AS在非小細胞肺癌和感染性疾病中的表達水平顯著增加，是潛在的炎癥標志物[4]。本研究旨在檢測膿毒癥患兒外周循環(huán)外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達水平，分析其對膿毒癥篩查的臨床價值。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2018年10月至2019年10月在新洲區(qū)人民醫(yī)院兒科診斷和接受治療的膿毒癥患兒80例作為膿毒癥組，其中男45例、女35例，年齡4個月～5歲?；純喝朐簳r符合兒童膿毒癥診斷標準[5],即具備以下2項或2項以上條件：(1)體溫>38 ℃或<36 ℃；(2)心率>90 次/min；(3)呼吸頻率>20次/min或PaCO2<32mmHg；(4)外周血WBC計數(shù)>12.0×109/L或<4.0×109/L，或未成熟粒細胞比例>10%。排除標準：(1)具有嚴重藥物過敏史者；(2)先天性免疫功能缺陷者；(3)治療配合不佳者。膿毒癥患兒于確診后行全身感染相關(guān)性器官功能衰竭(sepsis-related organ failure assessment，SOFA)評分，該評分系統(tǒng)包括呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肝臟、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腎臟共6個系統(tǒng)評估，每項評分范圍為0～4分，總分值范圍為0～24分[6]。選取同期在兒科保健中心體檢健康兒童60例作為對照組，其中男35例、女25例，年齡3個月～5歲。膿毒癥組與對照組間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2主要儀器及試劑 蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Jem-100cx Ⅱ型透射電子顯微鏡(日本日立電子公司)，Nanosight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國Malvern 公司)，721型分光光度計(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)，7500 型實時定量PCR儀(美國ABI 公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒、外泌體提取試劑盒(美國ABI 公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，蛋白質(zhì)印跡試劑盒(武漢博士德公司)，C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測試劑盒(上海依科賽生物制品公司)，羊抗兔CD9、CD63及GAPDH單克隆抗體(美國BD公司)，外泌體裂解液ExoSimple-Lysis(上海和序生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集及血常規(guī)指標檢測 膿毒癥患兒在確診后4 h內(nèi)(對照組在入院體檢時)采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集靜脈血標本5 mL， 335.4×g離心5 min,血漿置于-20 ℃保存。血常規(guī)指標由新洲區(qū)人民醫(yī)院檢驗科中心實驗室用全血細胞分析儀進行全血細胞分析，并計數(shù)WBC[參考范圍：(1～3)×103/μL]。

1.3.2CRP濃度檢測 采用夾心ELISA法，按照CRP檢測試劑盒說明書操作，使用721型分光光度計檢測吸光度(A450 nm)值，兒童CRP參考范圍：0.17～2.2 μg/mL。

1.3.3外泌體提取和鑒定 取500 μL血漿，按照外泌體分離試劑說明書操作分離外泌體。提取的外泌體經(jīng)4%多聚甲醛固定后滴加到銅網(wǎng)上，乙酸雙氧鈾負染，使用Jem-100cx Ⅱ型透射電子顯微鏡觀察并鑒定外泌體的形態(tài)。

1.3.4western blot 取上述外泌體提取物，加入外泌體裂解液ExoSimple-Lysis,并以12 000×g離心25 min，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。以每孔30 μg總蛋白質(zhì)量上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h，在蛋白質(zhì)電泳儀上行常規(guī)濕法，電轉(zhuǎn)膜至纖維素膜，PBST漂洗3次后加入羊抗兔CD9、CD63及GAPDH單克隆抗體(1∶200稀釋)4 ℃溫育過夜，50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，PBST漂洗3次后，加入羊抗兔IgG二抗(1∶500稀釋)于37 ℃溫育4 h，PBST漂洗3次，ECL液顯影，自動化一體機曝光，采用Quantity One 1-D分析軟件對蛋白質(zhì)印跡條帶進行定量，以GAPDH為內(nèi)參照，分析條帶灰度值。目的蛋白質(zhì)相對表達量=目的蛋白質(zhì)灰度測定值/GAPDH條帶灰度值，實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測外泌體LncRNA HOXA11-AS表達 采用Trizol試劑提取上述血清外泌體中的總RNA，并使用721型分光光度計測量提取RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0的樣本。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置4 ℃保存。以U6為內(nèi)參照，按熒光定量PCR試劑盒說明書操作在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。PCR引物由上海吉瑪生物科技公司設(shè)計及合成。引物序列參照文獻[7]： LncRNA HOXA11-AS上游引物序列：5′-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3′，下游引物序列：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，退火溫度 50 ℃，產(chǎn)物片段大小253 bp；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 PCR擴增體系為25 μL，包括ddH2O 15.2 μL，10×Taq buffer 2.5 μL，dNTP Mix(2 mmol/L) 2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL) 0.3 μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，共38次循環(huán)。采用SteponeTM軟件進行熔解曲線分析，采用2-ΔΔCt法計算兩組患者外泌體中LncRNA HOXA11-AS的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1血清外泌體鑒定 外泌體在電鏡下為圓形脂質(zhì)雙層膜囊狀顆粒，大小為80～100 nm，見圖1A；western blot結(jié)果證實，外泌體表面標志蛋白TSG101、CD9、CD63呈高表達, 見圖1B。

注：A,外泌體透射電鏡結(jié)果；B,western blot檢測外泌體標志蛋白的表達。

2.22組LncRNA HOXA11-AS的表達、WBC計數(shù)及CRP濃度的比較 膿毒癥患兒循環(huán)外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達水平顯著高于對照組(1.54±0.89 vs 0.53±0.17,t=15.23,P<0.001)； 此外，膿毒癥組WBC計數(shù)[(14.53±1.44)×103/μL vs (8.53±1.04)×103/μL，t=9.43,P=0.021 ]和CRP濃度[(140.50±14.89) μg/mL vs (70.50±14.07)μg/mL，t=10.23,P=0.002 ]均顯著高于對照組。

2.3SOFA評分與外泌體LncRNA HOXA11-AS及WBC和CRP的關(guān)系 膿毒癥組患者外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達水平與SOFA評分[(8.35±4.39)分]呈正相關(guān)(r=0.589，P<0.001); 膿毒癥組循環(huán)中WBC計數(shù)和SOFA評分無顯著相關(guān)性(r=0.338，P=0.543)，但CRP濃度和SOFA評分呈正相關(guān)(r=0.432，P<0.01)。

2.4膿毒癥患兒外泌體LncRNA HOXA11-AS與外周血WBC計數(shù)和CRP濃度的關(guān)系 膿毒癥組患兒外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達水平分別與WBC及CRP濃度呈正相關(guān)(r分別為0.561、0.614，P均<0.001)。

2.5膿毒癥患兒各指標篩查效能的比較結(jié)果 以兒童膿毒癥診斷標準為金標準，將膿毒癥組和對照組患兒LncRNA HOXA11-AS的相對表達量、WBC計數(shù)及CRP濃度納入ROC曲線分析，評估LncRNA HOXA11-AS篩查兒童膿毒癥的效能。結(jié)果表明，外周循環(huán)中CRP濃度篩查膿毒癥的ROC曲線下面積(area undercurve，AUCROC)為0.748(95%CI:0.639～0.817)，當cut-off值為131.52時，敏感性為62.0%，特異性為71.3%；WBC計數(shù)篩查膿毒癥的AUCROC為0.601(95%CI:0.513～0.669)，當cut-off值11.67時，敏感性為64.5%，特異性為67.9%；外泌體LncRNA HOXA11-AS篩查膿毒癥的AUCROC為0.947(95%CI:0.898～0.981)，當cut-off值1.23時，敏感性為90.9%，特異性為93.9%。見圖2。

圖2 外泌體LncRNA HOXA11-AS、CRP及WBC計數(shù)篩查膿毒癥的ROC曲線

3 討論

機體不受控制的炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂是膿毒癥進展的主要原因之一。WBC計數(shù)和CRP濃度常用于診斷或評估膿毒癥預(yù)后，但其特異性低，診斷效能不佳。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA及LncRNA參與調(diào)控炎癥及免疫過程，可用于膿毒癥診斷及預(yù)后評估[8]。

外泌體是由多種類型細胞分泌的小囊泡，可通過釋放包含于其內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA等小分子干預(yù)細胞生理過程。本研究提取各研究對象外周循環(huán)中的外泌體，并證實其表達外泌體標志物CD9和CD63蛋白,表明在健康兒童和膿毒癥患兒中均存在高濃度的外泌體[9]。研究表明，外泌體與膿毒癥發(fā)病關(guān)系密切。例如，內(nèi)皮祖細胞分泌的外泌體富含miR-126分子，并可抑制高遷移率族蛋白1和血管黏附分子1表達，改善微血管內(nèi)皮功能及膿毒癥預(yù)后[10]。外泌體 SOCS-1 可作為膿毒癥的標志物；而血小板衍生的外泌體等也可作為膿毒癥多器官損傷的介質(zhì)[11]。

LncRNA HOXA11-AS 基因定位于7p15.2染色體上，其在非小細胞肺癌(NSCLC)和腎臟炎癥[12]中表達上調(diào)。LncRNA HOXA11-AS 可抑制miR-200b表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，進而促進NSCLC侵襲。有學(xué)者[4]證實， LncRNA HOXA11-AS在NSCLC和感染性疾病中的表達水平顯著增加，可作為炎癥標志物。據(jù)此，本研究檢測了膿毒癥患兒及健康兒童血清外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康兒童相比，膿毒癥患兒循環(huán)外泌體中LncRNA HOXA11-AS的表達上調(diào)。然而，LncRNA HOXA11-AS 表達增加的機制目前尚不清楚，有文獻報道，其可能與在感染和應(yīng)激狀態(tài)下免疫系統(tǒng)激活、炎癥和NF-κB級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[13]。

SOFA 評分在臨床上常用于評估膿毒癥病情程度及預(yù)后，可客觀反映膿毒癥患者器官功能障礙程度。吳云朵等[14]證實，SOFA評分是判斷膿毒癥患兒預(yù)后的可靠指標。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥組外周血中WBC計數(shù)和CRP濃度高于對照組，且循環(huán)中LncRNA HOXA11-AS的表達水平和CRP濃度均與SOFA評分呈正相關(guān)，這與明穎等[15]報道的研究結(jié)果相一致。外泌體LncRNA HOXA11-AS的表達水平與WBC計數(shù)和CRP濃度呈正相關(guān)，提示LncRNA HOXA11-AS 水平與CRP濃度可評估膿毒癥患兒病情嚴重程度。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，WBC計數(shù)與SOFA評分無相關(guān)性，提示與膿毒癥患兒病情嚴重程度缺乏相關(guān)性。

本研究進一步通過ROC曲線分析結(jié)果顯示，膿毒癥患兒外周循環(huán)外泌體中LncRNA HOXA11-AS篩查膿毒癥的ROC曲線下面積﹑敏感性及特異性均明顯高于WBC和CRP，提示外周循環(huán)外泌體中LncRNA HOXA11-AS 對膿毒癥的篩查價值更優(yōu)。此外，本研究雖證實外泌體中LncRNA HOXA11-AS與SOFA評分呈正相關(guān)，但其是否可用于判斷膿毒癥的嚴重程度，尚需要擴大樣本量進一步研究。