黃霞，陳斌，黃超，韓志強，陳志紅，許文榮，朱偉

(1. 江蘇大學醫(yī)學院&江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212013；2. 泰州人民醫(yī)院檢驗科，江蘇泰州225300；3. 江蘇大學附屬醫(yī)院骨科部，江蘇鎮(zhèn)江212001；4. 江蘇大學附屬人民醫(yī)院普通外科部，江蘇鎮(zhèn)江212002)

腫瘤微環(huán)境中胃癌間充質干細胞(gastric cancer mesenchymal stem cells, GCMSCs)作為基質細胞影響胃癌的發(fā)展[1-2]。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，與健康人骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)相比，GCMSCs分泌炎性因子明顯升高。MSCs通過旁分泌機制促進胃癌的遷移[4]，且GCMSCs促進腫瘤進展的作用較BMMSCs明顯增強，但其具體作用機制尚不明確[1]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)作為磷酸戊糖途徑的關鍵酶，不僅為細胞生長提供原料，還可激活細胞信號，促進細胞因子的產生[5]。腫瘤細胞的轉移受多種細胞信號調節(jié)，包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等細胞信號[6]。研究發(fā)現(xiàn)，G6PD在GCMSCs中的表達水平較BMMSCs顯著升高，但其高表達是否影響胃癌細胞轉移目前尚不清楚[7]。因此，本研究探究了G6PD在GCMSCs中的表達及其在胃癌轉移中的作用，明確胃癌細胞來源的外泌體(exosome)調節(jié)GCMSCs G6PD表達的機制，旨在為胃癌轉移診斷及預后判斷提供輔助指標。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 20例胃癌組織石蠟切片收集于2018年1月至2019年4月泰州市人民醫(yī)院就診的胃癌患者。其中，男14例，女6例，年齡59～84歲，中位年齡70歲。入選標準[8]：經影像學檢查(CT、鋇劑造影等)、組織學檢查(胃鏡等)最終診斷為胃癌。排除標準：合并其他系統(tǒng)腫瘤；嚴重肝腎功能不全；嚴重感染及血液系統(tǒng)疾病。胃癌分期及病理組織學分型按照美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)2018版診斷標準[9]。其中，印戒細胞癌1例，神經內分泌癌1例，腺癌18例。收集患者病歷及病理資料。9例新鮮胃癌組織收集于2018年5月至2019年10月江蘇大學附屬醫(yī)院就診的胃腺癌患者。其中，男8例，女1例，年齡56～72歲，中位年齡64歲。入選標準、排除標準、胃癌分期及病理組織學分型診斷標準同上。健康人骨髓標本收集于2018年5月至2019年6月江蘇大學附屬醫(yī)院就診的骨科外傷患者。其中，男3例，女2例，年齡26～52歲，中位年齡40歲。

1.2細胞系、主要儀器和試劑 SGC-7901、HGC-27購自于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。G6PD siRNA (50 nmol/L)和陰性對照(50 nmol/L)購自廣州銳博生物公司。Ficoll試劑(北京達科為生物技術公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基(以色列 Biolhd公司)，Lipofectamine?2000 (美國賽默飛科技公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)，CCK-8試劑盒、活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物公司)，鼠抗人G6PD單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體、鼠抗人丙酮酸激酶M2(PKM2)單克隆抗體(美國圣克魯斯生物公司)，兔抗人己糖激酶2(HK2)單克隆抗體(美國CST公司)，兔抗人乳酸脫氫酶(LDH)抗體(沈陽萬類生物公司)，兔抗人α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(美國Bioword公司)，HRP標記羊抗鼠(兔)IgG二抗(北京康為世紀公司)。Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(美國Bio-Rad公司)，LAS4000 Mini化學發(fā)光曝光系統(tǒng)(德國GE公司)，BX41熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，800TS酶聯(lián)儀(美國BioTec公司)，CB171(A)半自動生化分析儀(上海合意檢驗設備公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 胃癌細胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。新鮮胃癌組織切成約1 mm3小塊，接種于細胞培養(yǎng)皿，加入10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞融合度達80%時，收集細胞并傳代培養(yǎng)。健康人骨髓經PBS稀釋后，按照Ficoll試劑說明書操作分離單個核細胞，加入至含10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁并形成融合層時，收集細胞并傳代培養(yǎng)。BMMSCs和GCMSCs細胞融合度達80%時，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次并加入新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集細胞條件培養(yǎng)基，800×g離心10 min獲得條件培養(yǎng)基(BMMSC-CM、GCMSC-CM)。條件培養(yǎng)基與RPMI 1640培養(yǎng)基以1∶1比例混合后作用于胃癌細胞。

1.3.2胃癌細胞來源外泌體分離 取SGC-7901或HGC-27細胞系，加入至含10%去除外泌體的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，收集培養(yǎng)48 h后的細胞上清，2 000×g離心20 min去除細胞碎片,細胞上清液經10 000×g離心30 min，上清液轉移至millipore濾器后1 500×g離心1 h，上清液經0.22 μm無菌濾器過濾后轉移至EP管內，加入外泌體提取試劑，4 ℃靜置過夜，1 500×g離心30 min，沉淀用適量PBS溶解。

1.3.3G6PD活性檢測 取1×106個BMMSCs或GCMSCs細胞加入100 μL細胞非變性裂解液并超聲碎裂，1 000×g離心5 min獲取蛋白質裂解液。分別加入(6-磷酸葡萄糖酸鹽、NADP+)溶液和(葡萄糖6-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸鹽和NADP+)溶液作為獲取 6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGD)活性反應體系及G6PD+6PGD總活性反應體系。底物濃度為:葡萄糖6-磷酸(0.2 mmol/L)、6-磷酸葡萄糖酸鹽(0.2 mmol/L)和NADP+(0.1 mmol/L)。所有樣品在緩沖液(50 mmol/L Tris, 1 mmol/L MgCl2, pH 8.1)內反應6 min。使用分光光度計檢測在波長為340 nm處吸光度(A)值。實驗重復3次。G6PD活性公式=(G6PD+6PGDA340 nm-6PGDA340 nm)/ 6。

1.3.4western blot 取BMMSCs、GCMSCs或siG6PD GCMSCs，每1×106個細胞加入100 μL RIPA裂解液，震蕩15～30 s，冰上溫育 4～5 min，重復5次，12 000×g離心10 min收集細胞總蛋白質?？偟鞍踪|經12 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(積層膠采用60 V電壓，分離膠采用100 V電壓)。電泳結束后在350 mA恒流條件下作用1.5 h，將凝膠上蛋白質轉移至硝酸纖維素(PVDF)膜上。PVDF膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入鼠抗人G6PD單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、鼠抗人P53單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人 HK2抗體(1∶1 000稀釋)、鼠抗人PKM2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)及兔抗人LDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃溫育過夜。PVDF膜經TBST洗滌，加入HRP標記羊抗鼠(兔)抗體(1∶3 000稀釋)，37 ℃溫育1 h。PVDF膜經TBST洗滌后使用ECL試劑盒和化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白質表達量。實驗重復3次。使用Image J對條帶進行灰度掃描。蛋白質相對表達量=目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3.5活性氧檢測 按照活性氧檢測試劑盒說明書對BMMSCs和GCMSCs內活性氧進行檢測。使用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，使用熒光顯微鏡在488 nm波長處觀察熒光。以釋放綠色熒光的細胞為表達活性氧陽性細胞。實驗重復3次。

1.3.6臺盼藍染色法檢測 取1×105個GCMSCs或siG6PD GCMSCs，經2%胎牛血清培養(yǎng)基或含200 μmol/L H2O2培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，經2.5 g/L胰蛋白酶消化，120×g離心5 min。細胞沉淀經PBS稀釋后制備細胞懸液，并與0.4%臺盼藍染液以9∶1的比例混合。BX41熒光顯微鏡下觀察細胞染色(細胞染成藍色為死亡細胞)。細胞活力計算公式：活細胞率=活細胞數(shù)/(死細胞數(shù)+活細胞數(shù))×100%。實驗重復3次。

1.3.7siRNA細胞轉染 根據(jù)Lipofectamine?2000說明書對GCMSCs進行siRNA轉染。步驟：取對數(shù)生長期GCMSCs以1×105個/孔的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞融合度達50%～60%時進行細胞轉染。在250 μL無血清α-MEM培養(yǎng)基中加入5 μL G6PD siRNA儲存液或陰性對照siRNA。250 μL無血清α-MEM培養(yǎng)基中加入5 μL Lipofectamine?2000儲存液，室溫靜置5 min。將稀釋的siRNA和轉染試劑混合，室溫靜置20 min。用PBS洗滌細胞，每孔加入1.5 mL無血清α-MEM培養(yǎng)基和相應的siRNA和轉染試劑混合液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)6 h。更換為常規(guī)培養(yǎng)基，取轉染48 h后細胞用于后續(xù)試驗。使用western blot對轉染的有效性進行驗證。

1.3.8細胞遷移試驗 取生長狀態(tài)良好的HGC-27或SGC-7901細胞與BMMSC-CM、GCMSC-CM、siG6PD GCMSC-CM共培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。細胞經2.5 g/L胰蛋白酶消化，120×g離心5 min，收集細胞沉淀。加入200 μL無血清培養(yǎng)基(含6×104個HGC-27或SGC-7901細胞)于Transwell小室的上室。小室下室加入600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基。小室置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8 h。用棉簽擦拭移除未遷移的細胞。BMMSCs、GCMSCs和siG6PD GCMSCs經2.5 g/L胰蛋白酶處理，120×g離心5 min，收集細胞沉淀。將200 μL無血清培養(yǎng)基(含8×104個BMMSCs或GCMSCs或siG6PD GCMSCs細胞)加入至Transwell小室的上室，小室下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。小室置于37 ℃、5% CO2條件下溫育10 h。用棉簽擦拭移除未遷移的細胞。用4%多聚甲醛固定已遷移的細胞，結晶紫染色10 min。在光學顯微鏡下計數(shù)每個小室隨機3個視野，實驗重復3次。

1.3.9細胞增殖試驗 取生長狀態(tài)良好的BMMSCs、GCMSCs和siG6PD GCMSCs，以2×103/孔的細胞密度接種于96孔板。細胞置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。檢測前吸除原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10%增強型CCK-8溶液的培養(yǎng)基。細胞置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)溫育1.5 h。使用酶聯(lián)儀在450 nm測定吸光度(A)值。根據(jù)不同組A450 nm值分析細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.3.10免疫組織化學染色 取胃癌組織石蠟切片，脫蠟。3% H2O2溫育5 ～10 min。PBS洗滌5 min，共3次。切片浸沒在枸櫞酸鹽抗原修復液中抗原熱修復30 min，5% BSA溶液封閉30 min，甩干。滴加鼠抗人G6PD 單克隆抗體(1∶100稀釋)或兔抗人α-SMA抗體(1∶200稀釋)，4 ℃溫育過夜。PBS洗滌5 min，重復3次。滴加生物素標記的鼠/兔抗人IgG，37 ℃溫育30 min。PBS洗滌5 min，共3次。加入鏈霉親和素-生物素復合物(strept avidin-biotin complex, SABC)試劑，37 ℃溫育30 min。PBS洗滌5 min，共3次。滴加3,3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine，DAB)染液在顯微鏡下顯色，自來水沖洗1 min，蘇木素染色3 min。在光學顯微鏡下觀察并拍照。細胞被染成黃色或棕色為陽性細胞。

1.4統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 6軟件及SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件包。不同組采用單因素方差分析或t檢驗。采用四格表資料的Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1western blot檢測糖酵解關鍵酶和磷酸戊糖途徑關鍵酶在GCMSCs及BMMSCs中的表達 western blot結果表明，GCMSCs中G6PD表達明顯高于BMMSCs，而GCMSCs中HK2、PKM2和LDH的表達水平與BMMSCs相比差異均無統(tǒng)計學意義(圖1A、1B， G6PD：t=7.497,P<0.01)。酶活性檢測結果發(fā)現(xiàn)，GCMSCs 內G6PD的活性明顯高于BMMSCs(BMMSCs vs GCMSCs：0.030±0.001 vs 0.046±0.001，t=11.75，P<0.001)?；钚匝跆结槞z測發(fā)現(xiàn)GCMSCs細胞內的活性氧水平低于BMMSCs(圖1C)。

注：A，western blot檢測BMMSCs和GCMSCs內 G6PD、HK2、PKM2、LDH蛋白的表達；B，G6PD、HK2、PKM2、LDH在BMMSCs和GCMSCs表達水平的柱狀圖；C，活性氧探針檢測BMMSCs和GCMSCs內活性氧(×200)； **，P<0.01。

2.2細胞遷移試驗檢測胃癌細胞的遷移 細胞遷移試驗結果表明，抑制G6PD在GCMSCs的表達后，其促進HGC-27和SGC-7901細胞遷移能力降低(圖2A、2B，HGC-27：F=33.53,P<0.05；SGC-7901：F=37.10,P<0.05)。

2.3western blot檢測BMMSCs和經胃癌細胞exosome培養(yǎng)BMMSCs 中G6PD表達 western blot鑒定exosome結果證實其表達exosome特異蛋白CD9及CD63。胃癌細胞exosome培養(yǎng)BMMSCs 7 d后，經SGC-7901 exosome (圖3A、3B，t分別為15.97、17.22，P均<0.01)和HGC-27exosome(圖3C、3D，t分別為4.86、4.704，P均<0.01)處理后的BMMSCs P53蛋白的表達相對于未處理BMMSCs均明顯降低，而G6PD蛋白的表達水平相對升高。

注：A，HGC-27經BMMSC-CM、GCMSC-CM或siG6PD GCMSC-CM處理48 h后細胞的遷移；B，SGC-7901經BMMSC-CM、GCMSC-CM或siG6PD GCMSC-CM處理48 h后細胞的遷移；*，P<0.05；**，P<0.01。

注： A，western blot檢測BMMSCs經SGC-7901 exosome作用后 P53和G6PD的表達；B，G6PD、P53在對照組和SGC-7901 exosome組相對表達水平的柱狀圖；C，western blot檢測BMMSCs經HGC-27 exosome作用后 P53和G6PD的表達；D，G6PD、P53在對照組和HGC-27 exosome組相對表達水平的柱狀圖；**，P<0.01。

2.4細胞增殖和遷移試驗檢測BMMSCs、GCMSCs及siG6PD GCMSCs的增殖和遷移 使用siRNA抑制GCMSCs內G6PD的表達(圖4A)，結果表明，干擾組G6PD的表達水平明顯低于陰性對照組(NC vs siG6PD：0.283±0.012 vs 0.135±0.007，t=10.48，P<0.001)。臺盼藍染色結果證實，抑制GCMSCs內G6PD的表達可降低其在低胎牛血清環(huán)境中的生存(NC vs siG6PD：0.793±0.020 vs 0.457±0.022，t=11.29，P<0.001)。抑制GCMSCs內G6PD的表達可降低其在200 μmol/L H2O2環(huán)境中的生存(NC vs siG6PD：0.763±0.047 vs 0.527±0.050，t=3.444，P<0.05)。細胞增殖試驗結果表明，GCMSCs增殖能力高于BMMSCs，抑制G6PD在GCMSCs內的表達可降低其增殖能力(圖4B，P均<0.01)。細胞遷移試驗結果表明，GCMSCs遷移能力明顯高于BMMSCs。抑制G6PD在GCMSCs內的表達可降低其遷移能力(圖4C，F(xiàn)=89.90，P均<0.01)。

注：A，western blot檢測G6PD在GCMSCs和siG6PD GCMSCs內表達；B，細胞增殖試驗檢測BMMSCs、GCMSCs和siG6PD GCMSCs細胞的增殖能力；C，細胞遷移試驗檢測BMMSCs、GCMSCs和siG6PD GCMSCs細胞的遷移(×200)；**，P<0.01。

2.5免疫組織化學檢測胃癌患者癌組織中G6PD的表達及與臨床病理參數(shù)分析 采用免疫組織化學檢測胃癌患者癌組織中G6PD表達，結果表明，基質細胞中G6PD表達水平較高患者的腫瘤直徑較大，淋巴結轉移增多，細胞分化程度降低(圖5和表1)。

圖5 免疫組織化學檢測胃癌組織G6PD和α-SMA的表達(×400)

表1 胃癌患者臨床病理參數(shù)與癌組織基質細胞G6PD的表達分析

3 討論

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),GCMSCs相對于BMMSCs在細胞生長、細胞因子產生和促進腫瘤生長作用等方面存在較大的差異[3]。G6PD是戊糖磷酸途徑的限速酶。研究表明，G6PD水平升高可促進多種腫瘤的進展。G6PD在腫瘤細胞內的表達促進腫瘤細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤細胞的凋亡[10]。然而，G6PD在腫瘤基質細胞中的表達對腫瘤進展的影響目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)G6PD在GCMSCs中的表達水平和活性明顯高于BMMSCs，并證實胃癌細胞來源的exosome是調節(jié)BMMSCs內G6PD表達的重要因素。G6PD在GCMSCs內的表達不僅促進了GCMSCs的增殖和遷移，而且有利于細胞在缺血缺氧的腫瘤微環(huán)境中存活。G6PD在腫瘤細胞內表達通過激活細胞信號或降低基質金屬蛋白酶的表達，促進腫瘤細胞的遷移[11]。本研究的結果表明，G6PD在GCMSCs內的表達促進胃癌細胞的遷移，其關鍵因素可能是調節(jié)GCMSCs細胞因子或exosome的產生，還可能是調節(jié)了GCMSCs代謝產物的產生，其具體機制有待進一步探究。

腫瘤細胞中G6PD表達對腫瘤進展的影響已被廣泛研究，但腫瘤基質細胞中G6PD的表達在腫瘤診斷中的應用價值尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)，磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和G6PD檢測被認為是循環(huán)腫瘤細胞最佳的糖代謝標志物，且證實循環(huán)腫瘤細胞PGK1和G6PD的表達與腫瘤轉移相關[12]。本研究證實G6PD的表達是MSCs促進胃癌細胞遷移的調節(jié)因素。筆者進一步對胃癌基質細胞G6PD表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)進行分析，結果發(fā)現(xiàn)胃癌基質細胞高表達G6PD的患者發(fā)生胃癌淋巴結轉移的概率更高。胃癌基質細胞G6PD檢測可能成為胃癌轉移的診斷標志物，但其臨床應用還需經大樣本論證。