王琴，唐莉

(江蘇省腫瘤醫(yī)院&江蘇省腫瘤防治研究所&南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，南京 210009)

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)均為陰性的異質(zhì)性疾病，具有侵襲程度高、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點，是乳腺癌中預(yù)后較差的亞型，而尋找有效的分子診斷指標(biāo)和治療靶標(biāo)是解決這一困境的有效途徑。

DC-STAMP域包含1-反義鏈1(DC-STAMP domain containing 1-antisense 1，DCST1-AS1)是本課題組采用長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)芯片在TNBC組織中篩選獲得的上調(diào)表達(dá)的LncRNA并證實DCST1-AS1可作為TNBC有效的分子診斷指標(biāo)，且能夠通過與miR-873-5p和致癌基因MYC形成正調(diào)控環(huán)以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[1]。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)DCST1-AS1可以通過與膜聯(lián)蛋白A1(ANXA1)結(jié)合通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以增強TNBC細(xì)胞的化學(xué)耐藥性[2]。本研究擬進(jìn)一步分析DCST1-AS1通過結(jié)合果糖二磷酸醛縮酶A(fructose-bisphosphate aldolase A,ALDOA)促進(jìn)TNBC細(xì)胞侵襲的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系、主要試劑及儀器 三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和BT-549(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，LncRNA芯片(上?？党晒?，L-15培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶-EDTA(0.25%)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國Gibco公司，PrimeScript RT試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)，Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒(美國Merck Millipore公司)，RIPA裂解液(上海碧云天公司)，多克隆兔抗體anti-ALDOA(ab245469)和羊抗兔anti-IgG(ab205718)購自美國Abcam公司，ALDOA小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和陰性對照(small interfering negative control, siNC)購自上海吉瑪公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(美國Invitrogen公司)。LightCycler PCR儀(美國Roche公司)，Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，Corning?BioCoatTM腫瘤浸潤24孔板(美國Corning公司)，OneDrop超微量分光光度儀(南京五義公司)，Triple TOFTM 5600-plus液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞使用含10%FBS的L-15培養(yǎng)基，置于37 ℃、空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BT-549細(xì)胞使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3RNA提取及RT-PCR反應(yīng) 用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，單次提取RNA的細(xì)胞總數(shù)不少于106個，使用OneDrop超微量分光光度儀檢測吸光度(A260/280 nm)值，取A260/280 nm值在1.9～2.1間的樣本用于后續(xù)檢測。按照PrimeScript RT試劑盒說明書將總量為1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，由上海生工公司合成。DCST1-AS1(NR_040773.1)上游引物序列：5′-CCACTCACCAGCTTCTTC-3′；下游引物序列：5′-CTTCTGCTATGTCTCACAC-3′，退火溫度為56 ℃，擴(kuò)增片段長度為236 bp。ALDOA(NM_001127617.2)上游引物序列：5′-TGTCAGGGGCTTCAGGTTTC-3′；下游引物序列：5′-TAGTAGCAAGTTCCTGCGGC-3′，退火溫度為56 ℃，擴(kuò)增片段長度為203 bp，以GAPDH作為內(nèi)參計算相對mRNA表達(dá)[3]。使用LightCycler PCR儀及TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。PCR總反應(yīng)體積為20 μL，包括：TB GreenPremix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6.4 μL。使用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。在56 ℃時收集每個循環(huán)的熒光信號，進(jìn)行熔解曲線分析。采用儀器自帶軟件分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線中的熒光信號，并計算平均閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)。通過2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達(dá)量，公式：ΔCt實驗組=Ct實驗組待測基因-Ct實驗組GAPDH，ΔCt對照組=Ct對照組待測基因-Ct對照組GAPDH；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

1.4RNA pulldown和質(zhì)譜測定 通過體外轉(zhuǎn)錄獲得DCST1-AS1的正義鏈和反義鏈，并使用T4 RNA連接酶將單個脫硫生物素化胞苷二磷酸酯連接至RNA鏈的3′末端。將1 μg生物素化的DCST1-AS1正義鏈和反義鏈分別與50 μL重懸的鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠混合，4 ℃溫育過夜，再加入BT-549細(xì)胞的裂解液中室溫溫育1 h，同時加入RNase抑制劑。用Triple TOFTM 5600-plus液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀分析與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過Proteinpilot軟件分析結(jié)果：在可信度≥95%，至少包含1個肽段時讀取數(shù)據(jù)，同時剔除角蛋白、抗體蛋白、血清清蛋白等常見污染蛋白質(zhì)。用于轉(zhuǎn)錄的DCST1-AS1上游引物序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAAAGCCCGGGAGCGCGCAGACTTGGCTGTGCG-3′；下游引物序列：5′-TTTTTTCACACTTTACAGAGTTTGTTTAATGT-3′。用于擴(kuò)增反義DCST1-AS1的上游引物序列：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTTTTTTCACACTTTACAGAGTTTGTTTAATGT-3′；下游引物序列：5′-AAAGCCCGGGAGCGCGCAGACTTGGCTGTGCG-3′。

1.5RNA免疫沉淀試驗測定 按照Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒說明書操作進(jìn)行RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)，用以測定TNBC細(xì)胞中能與ALDOA蛋白結(jié)合的DCST1-AS1。用于免疫沉淀的ALDOA抗體加入量為每反應(yīng)管5 μg，以IgG作為陰性對照。按照上述實時熒光定量PCR步驟擴(kuò)增anti-ALDOA和IgG沉淀中的DCST1-AS1和GAPDH，并以IgG沉淀組中的DCST1-AS1作為陰性對照。通過2-ΔΔCt法計算anti-ALDOA沉淀組中DCST1-AS1的相對表達(dá)量。

1.6western blot 使用本課題組前期工作[1]中制備的用慢病毒作為載體的穩(wěn)定干擾DCST1-AS1的BT-549-sh細(xì)胞及其陰性對照BT-549-NC，穩(wěn)定過表達(dá)DCST1-AS1的MDA-231-exp細(xì)胞及其陰性對照MDA-231-NC。將細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%、單孔細(xì)胞總數(shù)不少于106個時，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌并用RIPA緩沖液裂解。使用標(biāo)準(zhǔn)Bradford試劑盒測定細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)水平，用10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白質(zhì)，使用Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀調(diào)節(jié)穩(wěn)定電流為200 mA，轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用TBST充分洗滌。隨后用含5%BSA的TBST封閉，室溫?fù)u床振蕩溫育2 h。再次用TBST充分洗滌后，加入多克隆兔抗體anti-ALDOA(1∶1 000稀釋)與膜在4 ℃搖床溫育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體anti-IgG(1∶2 000稀釋)與膜在室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2 h。用GAPDH作為蛋白質(zhì)表達(dá)的內(nèi)參照。使用SYNGENE G：BOX chemiXR5系統(tǒng)(英國Syngene公司)采集圖像，并使用Gel-Pro32軟件讀取并計算ALDOA和GAPDH的蛋白質(zhì)灰度值。

1.7細(xì)胞侵襲能力測定 預(yù)包被基質(zhì)膠的Corning?BioCoatTM腫瘤浸潤24孔細(xì)胞培養(yǎng)板[該小室由Transwell膜濾器(孔徑為8 μm)插入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中組成],用不含血清的培養(yǎng)基將待測細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2.5×105mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入小室上室中，并將500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加入小室下室中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育10 h。使用棉簽擦去小室膜上層的基質(zhì)膠和未穿過膜的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定膜下層細(xì)胞后用結(jié)晶紫染色，通過倒置顯微鏡觀察比較穿過基質(zhì)膠與膜小孔的細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有實驗數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次。配對t檢驗用于RT-PCR中實驗組與對照組差異的比較。單尾ANOVA用于TCGA乳腺癌陣列中腫瘤組織與正常組織的基因表達(dá)差異的比較。Pearson相關(guān)性系數(shù)用于分析DCST1-AS1與靶蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DCST1-AS1的靶蛋白分析 通過RNA pulldown測定，共計有25種蛋白質(zhì)能特異性與DCST1-AS1正義鏈結(jié)合。將這25種蛋白質(zhì)與本課題組前期檢測的三陰性乳腺癌組織LncRNA芯片數(shù)據(jù)中顯著上調(diào)表達(dá)的2 092種基因[1]進(jìn)行整合(Gene Expression Omnibus GSE115275)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸三糖異構(gòu)酶1(triosephosphate Isomerase 1, TPI1)、ALDOA和角蛋白(corneodesmosin, CDSN)同時存在于這2項檢測中(圖1)。TPI1、ALDOA、CDSN蛋白分子中與DCST1-AS1結(jié)合的序列分別為SNVSDAVAQSTR、ALANSLACQGK和SNVSDAVAQSTR。

圖1 韋恩圖分析乳腺癌組織芯片檢測結(jié)果和pulldown蛋白的質(zhì)譜檢測結(jié)果

2.2DCST1-AS1與ALDOA表達(dá)的相關(guān)性分析 通過GEPIA2分析癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)中的乳腺癌陣列結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDOA在乳腺癌中顯著上調(diào)表達(dá)，TPI1、CDSN在乳腺癌組織和正常組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),DCST1-AS1與ALDOA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.19，P<0.01)，而與TPI1(r=0.013，P=0.65)、CDSN(r=0.045，P=0.12)的表達(dá)量均無相關(guān)性。

注：T，腫瘤組織(紅色)；N，正常組織(灰色)；TPM，每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本；**，P<0.01。

2.3DCST1-AS1與ALDOA結(jié)合并影響其表達(dá) RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組(100%)相比，ALDOAmRNA的相對表達(dá)量在DCST1-AS1缺失時下調(diào)至58.8%(t=15.6,P<0.05)，而在DCST1-AS1過表達(dá)時上調(diào)至368.8%(t=35.6,P<0.05)；TPImRNA在DCST1-AS1缺失時下調(diào)至98.0%(t=1.10,P=0.33)，而在DCST1-AS1過表達(dá)時上調(diào)至119.1%(t=2.46,P=0.07)；CDSNmRNA在DCST1-AS1缺失時上調(diào)至112.2%(t=2.21,P=0.10)，而在DCST1-AS1過表達(dá)時上調(diào)至132.1%(t=2.23,P=0.09)(圖3A)。western blot檢測結(jié)果表明,ALDOA在蛋白質(zhì)水平的變化趨勢與mRNA水平相同(圖3B)。進(jìn)一步用剩余的拉下蛋白液進(jìn)行western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)只有DCST1-AS1正義鏈拉下的蛋白液中檢測到ALDOA(圖3C)。RIP結(jié)合RT-PCR實驗表明，在ALDOA蛋白的RNA沉淀物中檢出的DCST1-AS1表達(dá)量是陰性對照組的455.7倍(t=51.5,P<0.05)。

注：A，RT-PCR檢測DCST1-AS1缺失和過表達(dá)時TPI1、ALDOA和CDSN mRNA的變化，*，P<0.05；B，western blot檢測DCST1-AS1敲減和過表達(dá)時ALDOA蛋白質(zhì)水平的變化；C，western blot檢測DCST1-AS1的正義鏈和反義鏈拉下蛋白液中的ALDOA。

2.4DCST1-AS1結(jié)合ALDOA促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲 RT-PCR結(jié)果表明，ALDOA siRNA能有效干擾MDA-MB-231細(xì)胞中的ALDOAmRNA，將ALDOA mRNA下調(diào)至對照組的10.8%(t=29.8,P<0.05)，而DCST1-AS1表達(dá)并未受到明顯影響(t=1.91,P=0.13)(圖4A)。Transwell侵襲試驗表明，干擾ALDOA的表達(dá)抑制了MDA-231-exp細(xì)胞的侵襲(圖4B)。

注：A，RT-PCR檢測ALDOA siRNA的干擾效率，*，P<0.05；B，Transwell侵襲試驗檢測ALDOA對DCST1-AS1侵襲能力的影響(×200)。

3 討論

LncRNA的失調(diào)是在各種癌癥中觀察到的特征標(biāo)志之一[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DCST1-AS1在TNBC中上調(diào)表達(dá)且與癌組織的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.024)及病理組織學(xué)(P=0.026)分級相關(guān)；DCST1-AS1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性[1-2]。除了乳腺癌，DCST1-AS1作為促癌因子發(fā)揮作用也在其他類型的癌癥中得到了證實。有學(xué)者指出，DCST1-AS1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)并通過影響Notch1蛋白促進(jìn)癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。DCST1-AS1參與調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和自噬[6]。DCST1-AS1可以通過競爭內(nèi)源性miR-605-3p調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[7]。在本研究中，筆者提出DCST1-AS1能夠與ALDOA直接結(jié)合，通過調(diào)控ALDOA的表達(dá)以促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲。

ALDOA是關(guān)鍵的糖酵解酶，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種類型的癌癥中呈高表達(dá)，被認(rèn)為是獨立的癌癥臨床預(yù)后標(biāo)志物[8]。ALDOA在促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移方面的功能得到了廣泛的研究；有學(xué)者證實ALDOA能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而促進(jìn)宮頸癌惡性進(jìn)程[9]；ALDOA的過表達(dá)增加了肺癌細(xì)胞系在體外的遷移和侵襲以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移性肺癌灶的形成[10]。以抑制ALDOA功能為目的全身治療可以顯著增加轉(zhuǎn)移性乳腺癌異種移植模型的總體存活率，因此，有學(xué)者提出ALDOA可作為癌癥潛在治療靶點[11]。通過分析TCGA中的乳腺癌陣列，我們發(fā)現(xiàn)DCST1-AS1和ALDOA的表達(dá)呈正相關(guān)，干擾ALDOA的表達(dá)能抑制DCST1-AS1的促侵襲能力，表明ALDOA協(xié)同DCST1-AS1在TNBC細(xì)胞的侵襲過程中發(fā)揮作用。本研究證實了DCST1-AS1可結(jié)合ALDOA，具有促癌功能，后續(xù)的工作將圍繞DCST1-AS1與ALDOA蛋白結(jié)合的具體序列，DCST1-AS1上調(diào)ALDOA的表達(dá)的具體機(jī)制等問題展開。

癌癥相關(guān)LncRNAs的鑒定和功能分析成為全面了解癌癥生物學(xué)和隨后的診斷和治療的重要步驟[12]。本課題組前期研究已經(jīng)證實DCST1-AS1上調(diào)表達(dá)在TNBC診斷、增殖、侵襲、耐藥中的作用，本研究進(jìn)一步證實DCST1-AS1通過結(jié)合ALDOA促進(jìn)乳腺癌的侵襲。圍繞DCST1-AS1的研究將有助于我們拓寬對TNBC進(jìn)程中關(guān)鍵分子之間調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，并從LncRNA角度為臨床的分子診斷和治療提供了新的思路。