周小輝， 陳毛清， 曹詩國， 梁大煒，戴晉軍，， 徐智鵬，， 胡駿鵬，

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左545200）

酵母作為單細(xì)胞蛋白原料，應(yīng)用于飼料和動物養(yǎng)殖行業(yè)已有近半個世紀(jì)的歷史。 研究表明，將酵母直接干燥成酵母粉使用， 由于未經(jīng)破壁處理，養(yǎng)殖動物對酵母的營養(yǎng)成分利用率較低 （徐那等，2015；楊翠竹等，2006；關(guān)苑等，1992）。 將酵母的細(xì)胞壁進(jìn)行破碎處理， 使其釋放出胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，可以提高利用率（尹敬博等，2018；郭小云等，2015；賀淼等，2014）。 酵母破壁常用的方法有兩種：自溶法是利用酵母在自身水解酶類（蛋白酶、核酸酶、糖水解酶等）的作用下發(fā)生細(xì)胞壁裂解而釋放出內(nèi)容物（徐那等，2015）；外源酶法是通過控制一定的溫度和pH， 在酶的作用下將酵母細(xì)胞壁破碎并使之釋放出內(nèi)容物（崔春等，2017；梁天姣等，2015）。

隨著酵母產(chǎn)業(yè)和加工技術(shù)的發(fā)展， 飼料工業(yè)中應(yīng)用的酵母蛋白原料越來越多， 然而目前研究中多為對酵母蛋白原料的應(yīng)用評估， 而對酵母蛋白原料如何鑒別鮮有報道。 本實驗通過革蘭氏染色、酸溶蛋白質(zhì)檢測、氨基酸態(tài)氮檢測3 種方法判定酵母破壁程度， 旨在為用戶區(qū)分不同酵母蛋白原料的生理特性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 酵母粉（編號分別為Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（編號分別為A1、A2、A3）、外源酶解酵母（編號分別為E1、E2、E3）均由湖北省酵母功能重點(diǎn)實驗室提供， 制備方法如下：（1）釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiaeHansen Z2.2，CCTCC NO： M205128）經(jīng)液態(tài)純培養(yǎng)發(fā)酵獲得酵母乳；（2）酵母乳經(jīng)離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得酵母粉；（3） 將酵母乳在溫度80 ℃進(jìn)行熱擊50 s， 向上述酵母乳中加入5‰檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至4.5；降溫至50 ℃，保溫12 h 后，經(jīng)離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得自溶酵母；（4）將酵母乳在溫度80 ℃進(jìn)行熱擊50 s，調(diào)節(jié)pH 為5.0，溫度58 ℃，加入1‰木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)8 h， 升溫到85 ℃保溫5 h 滅酶，經(jīng)離心、洗滌、噴霧干燥，制備獲得外源酶解酵母。

實驗試劑：革蘭氏染色液試劑盒；三氯乙酸溶液，150 g/L； 凱氏定氮法實驗試劑 （消化片；硫酸，密度為1.8419 g/L；硼酸溶液，20 g/L；氫氧化鈉溶液，400 g/L； 滴定液，0.05 mol/L 硫酸溶液；混合指示液，1 份1 g/L 甲基紅乙醇溶液與5 份1 g/L 溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合）；氨基酸態(tài)氮測定試劑（NaOH 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，0.05 mol/L；甲醛溶液，36%）。

1.2 儀器與設(shè)備 光學(xué)顯微鏡， 江南XS212 型；凱氏定氮裝置；酸度計，直接讀數(shù)，測量范圍（0 ～14），pH 精度±0.02；電磁攪拌器；堿式滴定管。

1.3 實驗方法

1.3.1 光鏡顯微觀察 采用革蘭氏染色法（適當(dāng)改進(jìn)）對酵母是否破壁進(jìn)行鑒別，其作用原理為：樣品通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在酵母細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，乙醇脫色會使酵母細(xì)胞壁收縮，沒有破壁的酵母細(xì)胞因為細(xì)胞壁收縮而將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物留在酵母細(xì)胞內(nèi)，而破壁的酵母細(xì)胞則無法阻止結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被乙醇溶解后從破壁孔中洗脫下來。導(dǎo)致未破壁的酵母細(xì)胞呈復(fù)合物的紫色，而破壁酵母細(xì)胞則為無色。 具體操作如下：（1）配置0.5%樣品溶液：分別取上述酵母粉 （Y1、Y2、Y3）， 自溶酵母（A1、A2、A3），外源酶解酵母（E1、E2、E3）樣品各0.5 g（精確至0.01 g），加入到不同的潔凈三角燒瓶中，每個燒瓶內(nèi)加入100 mL 的純凈水， 使樣品充分溶解。（2）涂片：取滅過菌的載玻片于實驗臺上，用移液槍吸取10 μL 待檢樣品滴在載玻片的中央，用取液后的槍頭將液滴涂布成一均勻的薄層（直徑約1 cm的圓），涂布面不宜過大。 （3）干燥：將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。 （4）固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標(biāo)本向上，在酒精燈火焰處盡快的來回通過2 ～3 次，共2 ～3 s，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60 ℃），放置待冷后，進(jìn)行染色。（5）初染：在涂片薄膜上滴加草酸銨結(jié)晶紫1 ～2 滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1 min。 （6）水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。 （7） 媒染： 用100 ～1000 μL 移液槍吸取約300 μL 碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆蓋涂片，染色約1 min。（8）水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗， 直至洗下的水呈無色為止。（9）脫色：斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20 ～30 s，隨即水洗。 （10）干燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待各樣品標(biāo)本片干后置顯微鏡下（×40）觀察。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)含量測定 采用凱氏定氮法對各樣品的粗蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.3 酸溶性蛋白質(zhì)含量測定 酵母通過自溶或外源酶水解破壁后，細(xì)胞中的大分子蛋白質(zhì)會變成小分子蛋白質(zhì)、多肽、小肽和游離氨基酸。上述小分子的含氮物質(zhì)會通過破壁孔釋放到酵母細(xì)胞外，溶解在各類介質(zhì)中，因此通過測定溶解在各類介質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量可以評估酵母水解物破壁程度。可溶性蛋白質(zhì)指標(biāo)包括：水溶性蛋白質(zhì)、酸溶性蛋白質(zhì)和堿溶性蛋白質(zhì)。 本實驗采用酸溶性蛋白質(zhì)檢測法。 具體操作如下：分別稱取酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母樣品1.00 g（精確至0.001 g），加入到不同的50 mL 潔凈容量瓶中，然后向每個容量瓶中加入15%三氯乙酸溶液，振蕩使樣品溶解，定容。參照“GB/T 22492 附錄B”中“酸溶蛋白質(zhì)含量的測定”方法完成后續(xù)操作及檢測。

1.3.4 氨基酸態(tài)氮含量測定 飼料行業(yè)檢測可溶性氮含量的方法主要有：氨基酸態(tài)氮檢測法和游離氨基酸檢測法。前者采用化學(xué)滴定的方法檢測樣品中以游離的氨基形式存在的氮含量，后者采用高效液相色譜法（HPLC）檢測樣品中的游離氨基酸含量。 本實驗采用氨基酸態(tài)氮檢測法，按現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.235 第一法執(zhí)行。具體操作如下：分別稱取酵母粉（Y1、Y2、Y3）、自溶酵母（A1、A2、A3）、外源酶解酵母（E1、E2、E3）樣品各5.0 g（精確至0.01 g），加入到不同的50 mL 潔凈燒杯中，用純水分?jǐn)?shù)次洗滌至100 mL 容量瓶中，振蕩使樣品充分溶解，定容。 參照“GB 5009.235第一法酸度計法” 完成后續(xù)操作及檢測，每個樣品重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行預(yù)處理，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中one-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性用Duncan 氏多重比較法，以P ＜0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 光鏡顯微觀察 酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母樣品的革蘭氏染色法檢測結(jié)果顯示 （圖1～圖3）：未破壁的酵母粉、通過自溶破壁的自溶酵母、 通過外源酶催化水解破壁的外源酶解酵母的顏色存在明顯差異，酵母粉（Y1-Y3）樣品均顯示為結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的紫色； 自溶酵母 （A1-A3）均顯示部分酵母為紫色、部分酵母為無色；外源酶解酵母（E1-E3）都是無色，只有極個別酵母為紫色。光鏡顯微觀察結(jié)果表明，革蘭氏染色法檢測可以區(qū)分酵母是否破壁， 但該方法無法對酵母的破壁程度做定量分析， 需要結(jié)合理化指標(biāo)檢測結(jié)果進(jìn)一步判定。

2.2 粗蛋白質(zhì)、酸溶性蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮含量由表1 可知， 相同菌種和發(fā)酵工藝制備的酵母粉、自溶酵母、外源酶解酵母的粗蛋白質(zhì)含量無顯著差異（P ＞0.05）；外源酶解酵母的酸溶蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮含量均顯著高于自溶酵母和酵母粉（P ＜0.05）；自溶酵母的酸溶蛋白質(zhì)、氨基酸態(tài)氮含量顯著高于酵母粉（P ＜0.05）。 本實驗結(jié)果表明， 自溶法和外源酶解法有助于酵母破壁，酸溶蛋白質(zhì)和氨基酸態(tài)氮可以評估酵母破壁后理化指標(biāo)的變化。

表1 不同樣品的粗蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性氮含量%

3 討論

酵母細(xì)胞中富含蛋白質(zhì)、 核酸、B 族維生素、酵母細(xì)胞壁多糖及其他生理活性物質(zhì)， 這些有效成分主要存在于酵母細(xì)胞內(nèi)或者是酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。 許樂樂等（2015）通過光學(xué)顯微鏡對活性干酵母和啤酒酵母粉的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了觀察， 指出活酵母和死的啤酒酵母粉在細(xì)胞飽滿度和光澤度上有明顯區(qū)別； 其借鑒改良后的革蘭氏染色法觀察酵母水解物、啤酒酵母粉和活性干酵母，發(fā)現(xiàn)酵母的不同組織呈現(xiàn)出不同的顏色， 可用于區(qū)別酵母水解物與酵母細(xì)胞壁， 但不能將酵母是否破壁進(jìn)行明顯的區(qū)分。 本實驗通過將革蘭氏染色法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)后， 可以明顯區(qū)別未破壁的酵母粉和已破壁的外源酶解酵母， 但不能判斷自溶酵母的破壁程度。

姚曉紅等（2007） 對酵母自溶條件的研究表明， 自溶破壁可以使酵母釋放出游離氨基酸和可溶性蛋白； 而采用添加不同的外源酶對酵母破壁的研究表明， 相比于自溶破壁可以獲得更高的游離氨基酸、氨基酸態(tài)氮和可溶性蛋白質(zhì)含量（崔春等，2017；羅龍娟等，2014；許維娜等，2013）。 徐耀文等（2013）通過外源酶將酵母破壁得到呈味核苷酸，郭莎莎（2012）通過酶解酵母細(xì)胞得到生物活性肽， 酶解破壁使酵母可以得到更多的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)。本研究結(jié)果也表明，通過添加外源酶進(jìn)行酵母細(xì)胞破壁的方式優(yōu)于自溶破壁。

酵母自溶或外源酶解破壁會使樣品中游離氨基酸、氨基酸態(tài)氮、可溶性蛋白、酸溶性蛋白含量等升高（蘇星等，2019；徐那等，2015）。從本實驗結(jié)果“酸溶蛋白質(zhì)/粗蛋白質(zhì)”指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn)，外源酶解酵母的酸溶蛋白質(zhì)含量接近粗蛋白質(zhì)的含量，說明添加外源酶催化水解的方式能夠使酵母細(xì)胞破壁酶解更充分，獲得更多的肽和游離氨基酸（按照“GB/T 22492”附錄B 定義，酸溶蛋白含量為樣品中小分子的肽和游離氨基酸的總和）。近來的動物應(yīng)用研究也表明， 酵母自溶或酶解后得到的肽是對動物非常重要的營養(yǎng)成分（蔡大亮等，2017；袁明鳳等，2016；楊凡等，2016；賀淼等，2013）。

4 結(jié)論

采用革蘭氏染色法可以明顯區(qū)分酵母是否破壁， 通過檢測酸溶蛋白質(zhì)含量和氨基酸態(tài)氮含量可以評估酵母產(chǎn)品的破壁程度，可作為飼料行業(yè)對破壁酵母類產(chǎn)品進(jìn)行品控的評判依據(jù)。