翁奉武，郭麗穎，李秋偉，李 力，趙立聰，孫小雪，尹美君，賈建偉

1 天津中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院，天津 301617；2 天津市第二人民醫(yī)院 中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合Ⅰ科，天津 300192

HBV感染是全球性的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，HBV感染慢性化是發(fā)展為肝硬化和肝癌的主要危險(xiǎn)因素[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界約有2.57億人存在慢性HBV感染[2]，其中我國(guó)約有9300萬(wàn)HBV感染者[3]。慢性HBV感染的臨床表現(xiàn)主要為肝炎-肝硬化-肝癌3個(gè)階段，不同階段的臨床特征各異。免疫功能是貫穿慢性HBV感染病程發(fā)展的一項(xiàng)重要因素。外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的變化及功能特征可以有效反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，慢性HBV感染者常伴隨淋巴細(xì)胞亞群功能失衡及紊亂，淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的特異性和強(qiáng)度顯著降低、功能耗竭，從而不能有效地識(shí)別和清除HBV，進(jìn)而加重肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[4-5]。本文將探討慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、乙型肝炎肝硬化相關(guān)原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的表達(dá)情況，從而揭示慢性HBV感染疾病進(jìn)展過(guò)程中外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢(shì)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月-2019年4月在天津市第二人民醫(yī)院住院的慢性HBV感染患者，分為慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組，所有患者ALT<2倍正常值上限(ULN)，TBil<1.5×ULN，高敏HBV DNA<20 IU/ml，肝功能Child-Pugh評(píng)分為A級(jí)，均已接受核苷(酸)類似物抗病毒治療，治療時(shí)間>6個(gè)月。選擇同期健康體檢者作為對(duì)照組。本研究經(jīng)由天津市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：201818)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性HBV感染所致的慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者，其中慢性乙型肝炎、肝硬化診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[6]；肝癌診斷參考中《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性HBV感染者；(2)合并其他病毒(HAV、HCV、HIV等)感染者；(3)合并其他(脂肪性、酒精性、藥物性、自身免疫性等)慢性肝病患者；(4)繼發(fā)性肝癌或其他腫瘤患者；(5)合并嚴(yán)重感染、肝性腦病、消化道出血等并發(fā)癥患者；(6)妊娠及哺乳期婦女。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7180)檢測(cè)ALT、TBil水平。

1.3.2 高敏HBV DNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀(Roche COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan)和配套試劑盒檢測(cè)HBV DNA載量。

1.3.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群精準(zhǔn)計(jì)數(shù)檢測(cè) 采集乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周血50 μl于絕對(duì)計(jì)數(shù)管(BD Trucount管)中，加入相應(yīng)的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+CD56+20 μl熒光標(biāo)記流式抗體(BD Multitest試劑)，混勻，室溫避光放置20 min。再加入450 μl溶血素(BD FACS溶解液)，混勻，室溫避光放置20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)(BD FACSCanto流式細(xì)胞儀)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間方差不齊采用Welch方差分析，兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，多組間及進(jìn)一步兩兩比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2秩相關(guān)分析法。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入慢性HBV感染患者132例，其中男88例，女44例，年齡23～79歲，平均年齡(52.30±12.05)歲；慢性乙型肝炎組47例，肝硬化組44例，肝癌組41例。健康體檢者42例，其中男20例，女22例，年齡21～79歲，平均年齡(51.48±15.83)歲。4組性別、年齡、ALT、TBil水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)，具有可比性。

表1 4組性別、年齡和肝功能指標(biāo)比較

2.2 4組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)情況 慢性HBV感染患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞在對(duì)照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與對(duì)照組和慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。與對(duì)照組相比，肝癌組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 4組外周血T淋巴細(xì)胞亞群精準(zhǔn)計(jì)數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.3 4組外周血B淋巴細(xì)胞表達(dá)情況 慢性HBV感染患者外周血CD19+B淋巴細(xì)胞在對(duì)照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與對(duì)照組和慢性乙型肝炎組相比，肝硬化組和肝癌組CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

表3 4組外周血B淋巴細(xì)胞精準(zhǔn)計(jì)數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.4 4組外周血NK細(xì)胞表達(dá)情況 慢性HBV感染患者外周血CD16+CD56+NK細(xì)胞在對(duì)照組、慢性乙型肝炎組、肝硬化組和肝癌組中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與對(duì)照組相比，肝硬化組和肝癌組CD16+CD56+NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；與慢性乙型肝炎組比較，肝癌組CD16+CD56+NK細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 4組外周血NK細(xì)胞精準(zhǔn)計(jì)數(shù)比較

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05。

2.5 不同疾病狀態(tài)與外周血淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，4組疾病進(jìn)展與外周血CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、CD16+CD56+NK細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.414、-0.503、-0.269、-0.435、-0.402，P值均<0.01)。其中CD4-+T淋巴細(xì)胞與疾病進(jìn)展的相關(guān)性最大(r=-0.503)。

3 討論

HBV感染過(guò)程中，免疫功能健全者有機(jī)會(huì)憑借自身機(jī)體免疫反應(yīng)將病毒清除而痊愈，而絕大多數(shù)患者為母嬰或父嬰垂直傳播而來(lái)，可能存在一定的免疫缺陷，不能完全清除病毒，病情將持續(xù)緩慢進(jìn)展。先天免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病毒感染的一線防御機(jī)制，受感染的肝細(xì)胞和肝內(nèi)固有免疫細(xì)胞識(shí)別病毒，誘導(dǎo)直接抗病毒機(jī)制，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8]。宿主的免疫反應(yīng)不足被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性HBV感染的關(guān)鍵因素[9]，因此免疫功能在慢性HBV感染的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，主要包括T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD19+)和NK細(xì)胞(CD16+CD56+)。其中NK細(xì)胞執(zhí)行先天性免疫反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞執(zhí)行適應(yīng)性免疫反應(yīng)。先天性免疫控制對(duì)病毒感染的最初反應(yīng)，而特定的細(xì)胞免疫和體液免疫則消除病原體和防止再感染[10]。T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫，具有抵抗病毒和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。CD3+T淋巴細(xì)胞代表總成熟T淋巴細(xì)胞，反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)；CD4+T淋巴細(xì)胞是輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)，介導(dǎo)遲發(fā)性超敏反應(yīng)，協(xié)助B淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞行使免疫應(yīng)答功能，是免疫應(yīng)答中清除病毒的重要細(xì)胞；CD8+T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Tc)，在免疫反應(yīng)中直接與靶細(xì)胞結(jié)合釋放顆粒酶和穿孔素而殺傷靶細(xì)胞，是引起病毒感染后肝細(xì)胞損傷的主要細(xì)胞[11]。正常情況下，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞互相拮抗保持平衡，HBV感染后，Tc迅速增殖分化，當(dāng)比例失衡，免疫功能則發(fā)生紊亂[12-14]。B淋巴細(xì)胞是主導(dǎo)機(jī)體體液免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生高親和力病毒特異性抗體，以中和病毒[15]。NK細(xì)胞主導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞無(wú)需預(yù)先致敏的細(xì)胞毒性作用，是機(jī)體在免疫應(yīng)答中抗腫瘤、抗病毒感染以及免疫監(jiān)控的重要因素，在機(jī)體清除HBV的過(guò)程中起到了不可或缺的作用[16]。

本研究檢測(cè)了132例慢性HBV感染者以及42例健康者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肝硬化組和肝癌組CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組和慢性乙型肝炎組相比明顯減少，且隨著慢性HBV感染的加重，即從慢性乙型肝炎-肝硬化-肝癌的過(guò)程中，CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，提示T淋巴細(xì)胞亞群和疾病的進(jìn)展有著密切關(guān)系；肝硬化組和肝癌組CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少提示在慢性HBV感染過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能降低，導(dǎo)致HBV不易被清除，進(jìn)一步導(dǎo)致感染的加重。肝癌組CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，提示肝癌患者抗腫瘤效應(yīng)明顯較低。劉恩惠等[17]通過(guò)對(duì)慢性HBV感染者不同病理狀態(tài)外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥程度≥G2組CD8+T淋巴細(xì)胞水平低于

綜上所述，慢性HBV感染患者機(jī)體免疫功能降低，介導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞數(shù)量減少，無(wú)法有效清除體內(nèi)病毒，造成肝細(xì)胞持續(xù)損傷，從而使病情進(jìn)一步發(fā)展。本研究基于外周血T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞在慢性HBV感染發(fā)生進(jìn)展和預(yù)后中的重要作用，認(rèn)識(shí)到提升外周血淋巴細(xì)胞亞群的狀態(tài)對(duì)于預(yù)防和治療慢性HBV感染具有重要意義。