張 濤, 毛 偉, 王棟芳, 蔣玉林, 楊丹蓉, 尹 丹, 楊 虎, 歐陽(yáng)熊妍, 譚茜茜

重慶市血液中心 輸血研究所，重慶 400015

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中HBsAg是采供血機(jī)構(gòu)用于篩查血液安全的法定檢測(cè)方式之一。近年來(lái)隨著病毒核酸檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)在HBsAg陰性的人群中檢出HBV DNA，這種除“窗口期”外的HBsAg(-)/HBV DNA(+)的感染定義為隱匿性乙型肝炎病毒感染( occult hepatitis B virus infection，OBI) ，主要表現(xiàn)為低病毒載量水平的感染[1]。在OBI的發(fā)病機(jī)制中，宿主免疫應(yīng)答是一個(gè)不可忽略的因素，其N(xiāo)K細(xì)胞在機(jī)體免疫監(jiān)視和抗病毒感染等方面起著重要作用。殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)是NK細(xì)胞表面的重要受體，是具有高度多態(tài)性的多基因家族，通過(guò)傳導(dǎo)激活性或抑制性信號(hào)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性和機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究擬分析無(wú)償獻(xiàn)血人群中OBI獻(xiàn)血者的KIR基因多態(tài)性特征，探討OBI感染和KIR基因多態(tài)性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2016年6月-2019年6月重慶市血液中心采集的18～55歲的無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，選擇血清學(xué)篩查HBsAg陰性而病毒核酸檢測(cè)技術(shù)[TIGRIS全自動(dòng)血液核酸檢測(cè)儀(美國(guó)諾華公司)，運(yùn)用Pro- cleix Ultrio assay(Chiron Gene-Probe，Emeryville，San Diego，CA，USA)方法進(jìn)行三聯(lián)熒光病毒核酸檢測(cè)]篩查HBV DNA陽(yáng)性，同時(shí)經(jīng)隨訪排除“窗口期”的獻(xiàn)血者作為研究對(duì)象(OBI組)。收集所有研究對(duì)象的外周血標(biāo)本5～8 ml，-80 ℃冷凍保存。本研究通過(guò)重慶市血液中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀(9700型，美國(guó)ABI)；流式熒光檢測(cè)儀Luminex?200(美國(guó)Luminex)；血液基因組柱式小量提取試劑盒(批號(hào)30327，康為世紀(jì))；KIR基因分型試劑LIFE CODES KIR-SSO TYPING KIT(批號(hào)：3006648，美國(guó)IMMUCOR)。

1.3 DNA提取 采用柱提法從凍存(-80℃)的全血標(biāo)本中提取DNA。DNA純度在1.60～2.00，調(diào)整DNA濃度為10～50 ng/μl，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 KIR基因分型 首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序：95 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)； 72℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃ 結(jié)束。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交、洗滌、上機(jī)檢測(cè)。本方案可檢測(cè)出KIR 2DS4在第5外顯子上有22bp缺失的變異體(KIR 2DS4*del，也稱(chēng)為KIR 1D)。

2 結(jié)果

2.1 KIR基因分布情況 OBI組105例患者的平均年齡為(38.5±1.8)歲，其中男65例(61.9%)，女40例(38.1%)，均為漢族，KIR基因分布見(jiàn)表1。105例OBI獻(xiàn)血者均含有的KIR基因有2DL4、3DL2、3DL3和假基因3DP1；F>70%的KIR基因有2DL1、2DL3、3DL1、2DS4和假基因2DP1，其中KIR 2DS4 第5外顯子存在缺失的F為26.3%,F<30%的基因有2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1。

表1 105例OBI獻(xiàn)血者KIR基因分布

2.2 OBI獻(xiàn)血者與不同地區(qū)健康人群的KIR基因分布比較 OBI獻(xiàn)血者與不同地區(qū)健康人群的KIR基因分布比較見(jiàn)表2，OBI獻(xiàn)血人群分別與重慶漢族、河北漢族、江蘇漢族和拉薩藏族比較，KIR 2DL3基因表型頻率均降低(χ2分別為9.598、12.236、13.719、10.974，P值均<0.05)(表2)；OBI獻(xiàn)血人群2DL2、2DL5、2DS2、2DS3與烏市維族比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為16.215、6.981、19.498、11.819，P值均<0.05)；OBI獻(xiàn)血人群2DL2、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4與高加索人比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為22.477、3.877、34.937、6.909、4.271，P值均<0.05)；OBI獻(xiàn)血人群與重慶漢族相比，KIR 2DS4*del頻率升高(χ2=12.911，P<0.05)。

2.3 OBI獻(xiàn)血者與不同病種人群的KIR基因分布比較

OBI獻(xiàn)血人群與長(zhǎng)期慢性HBV感染組相比，2DS2、2DS3頻率降低(χ2分別為13.005、8.289，P值均<0.05)，但2DS4、3DL1頻率升高(χ2分別10.032、3.865，P值均<0.05)；OBI獻(xiàn)血人群與強(qiáng)直性脊柱炎組相比，2DL3、2DS3基因表型頻率降低(χ2分別為7.851、16.504，P值均<0.05)；OBI獻(xiàn)血人群與男男同性戀(MSM)HIV-AIDS 組相比，2DS4、3DL1基因頻率升高(χ2分別為15.491、4.475，P值均<0.05)。OBI獻(xiàn)血人群與散發(fā)性急性戊型肝炎組相比，2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DS4、3DL2、3DL3、2DP1差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為4.448、30.934、17.942、15.638、4.227、13.802、32.667、35.653、36.566，P值均<0.05)(表3)。

表2 OBI獻(xiàn)血者與不同地區(qū)健康人群的KIR基因表型頻率的比較(%)

注： 與OBI獻(xiàn)血者比較，1)P<0.05。

表3 OBI獻(xiàn)血者與不同病種人群KIR基因表型頻率的比較(%)

注： 與OBI獻(xiàn)血者比較，1)P<0.05。

2.4 OBI獻(xiàn)血者與不同病種人群、不同地區(qū)健康人群的KIR 基因型比較 目前發(fā)現(xiàn)人類(lèi)KIR主要有A和B兩種單倍型，其基因數(shù)量和種類(lèi)均不同。單倍型A除了KIR 2DS4之外均是抑制性KIR基因，包括2DL1、2DL3、3DL1、3DL2。單倍型B包含2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1等不同組合的基因。KIR基因是以單體型的形式遺傳，在特定人群中，這些單體型組合形成特定基因型，包括AA、BX(AB和BB)。具體可通過(guò)國(guó)際等位基因網(wǎng)站http://www.allelefrequencies.net/kir6001a.asp輸入各個(gè)KIR基因檢測(cè)的結(jié)果，由系統(tǒng)自動(dòng)判別每一例KIR的基因型。

105例OBI獻(xiàn)血者中共發(fā)現(xiàn)21種KIR基因型，均可指定ID號(hào)。其中基因型AA1最為常見(jiàn)(49.5%)，其次為BX2(18.1%)，有12種基因型在該人群中僅出現(xiàn)1次(表4)。單倍體 A 在 OBI獻(xiàn)血者和強(qiáng)直性脊柱炎、不同地區(qū)健康對(duì)照組所占的比例與單倍體B比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

3 討論

KIR是一類(lèi)表達(dá)于NK細(xì)胞和某些T淋巴細(xì)胞表面的重要受體，通過(guò)識(shí)別和結(jié)合HLA-Ⅰ類(lèi)分子，傳遞活化或抑制信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能和殺傷活性，在抗病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[14]。KIR分子具有高度多態(tài)性，遺傳基礎(chǔ)源于KIR基因多態(tài)性，表現(xiàn)在不同的單體型中，KIR基因數(shù)量和種類(lèi)均可能不同，是繼HLA之后發(fā)現(xiàn)的具有高度多態(tài)性的免疫調(diào)節(jié)基因家族。有研究[15]報(bào)道，KIR基因多態(tài)性將影響到其與配體結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性，有可能影響HBV感染后的機(jī)體免疫反應(yīng)及其臨床預(yù)后。

OBI是HBV感染中的一種特殊類(lèi)型，因其血清中病毒載量低而不易被發(fā)現(xiàn)，成為臨床和流行病學(xué)的一大難題[16]。近年來(lái)，采供血系統(tǒng)為提升血液安全逐漸采用核酸篩查技術(shù)進(jìn)行經(jīng)血傳播疾病的排除。本研究中，不能直接檢測(cè)獻(xiàn)血者肝臟組織中的HBV DNA，因而將血清學(xué)檢測(cè) HBsAg陰性而核酸檢測(cè)技術(shù)篩查HBV DNA陽(yáng)性的獻(xiàn)血者定義為OBI獻(xiàn)血者。本研究首次關(guān)注了無(wú)償獻(xiàn)血人群中OBI獻(xiàn)血者的KIR基因多態(tài)性特征，在105例OBI獻(xiàn)血者中檢出了KIR目前已知的16種基因，包括 KIR 2DL1-5、2DS1-5、3DL1-3、3DS1、2DP1、3DP1，以及KIR 2DS4 等位基因第5外顯子存在 22 bp 缺失而產(chǎn)生無(wú)激活效應(yīng)的變異體 KIR 2DS4*del。可以看出，OBI獻(xiàn)血者中抑制性KIR基因的檢出頻率普遍高于激活性KIR基因，這與健康人群中的特征一致。通過(guò)比較各個(gè)KIR基因在OBI獻(xiàn)血者與重慶漢族、河北漢族、江蘇漢族和我國(guó)健康人群中的頻率可以看出，KIR 2DL3在OBI獻(xiàn)血者中的分布頻率均低于上述人群，而與烏市維族和高加索健康人群一致。烏市維族和高加索健康人群均是HBV感染的低流行地區(qū)，這提示KIR 2DL3可能是HBV感染的保護(hù)性基因。 Gao等[17]研究發(fā)現(xiàn)KIR 2DL3-HLA-C1具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，di Bona等[18]發(fā)現(xiàn)KIR 2DL3與其配體結(jié)合有助于HBV的自發(fā)清除，Zwolinska等[19]的研究顯示只有KIR 2DL2基因而沒(méi)有KIR 2DL3基因會(huì)讓HIV易感率増加4倍以上，這些結(jié)果與本研究結(jié)論相似。但KIR 2DL3保護(hù)機(jī)體免受病毒感染的具體作用機(jī)制尚未明確，推測(cè)可能與KIR 2DL3與相應(yīng)配體結(jié)合后分泌更多的干擾素有關(guān)[20]。此外，有文獻(xiàn)[8]表明，KIR 2DS2、2DS3是HBV易感基因，能誘導(dǎo)持續(xù)較弱的炎癥反應(yīng)。而KIR 2DS1、3DS1、2DL5可能是保護(hù)基因，可以促進(jìn)HBV的清除。其他研究[21]也表明，KIR 2DS3基因頻率在梅毒、慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者中升高。本研究將OBI獻(xiàn)血者與文獻(xiàn)報(bào)道的HBV感染組作比較，KIR 2DS2、2DS3基因頻率降低，而KIR 2DS4、3DL1頻率升高，提示OBI獻(xiàn)血者低病毒載量可能與NK細(xì)胞KIR活化和抑制信號(hào)的平衡關(guān)系有關(guān)，也與KIR-配體間相互作用、種族、地域、病毒特征等有關(guān)，而不單純?nèi)Q于KIR基因多態(tài)性。

表4 OBI獻(xiàn)血者與不同病種人群、不同地區(qū)健康人群的KIR基因型頻率的比較(%)

KIR 2DS4是攜帶頻率在90%以上的唯一活化性基因，也是單倍型A唯一的激活性KIR基因，提示這一基因在NK細(xì)胞的功能調(diào)控和疾病相關(guān)性中可能發(fā)揮重要作用。KIR 2DS4在第5外顯子缺失22 bp ，產(chǎn)生變異體KIR 1D編碼可溶性分子，編碼蛋白無(wú)法錨定在細(xì)胞膜上導(dǎo)致激活信號(hào)不能傳遞，因此KIR 1D可屏蔽KIR 2DS4或NK細(xì)胞上其他受體的配體或作為清除可溶性HLA的誘導(dǎo)物，干擾NK細(xì)胞功能[22]。 Zhuang等[23]研究結(jié)果顯示，中國(guó)漢族梅毒患者KIR1D 純合子的基因頻率較正常對(duì)照組顯著增高(16.9% vs 6.6%，χ2=4.596，P<0.05)，提示KIR 1D 純合子可能與中國(guó)漢族人群的梅毒易感性相關(guān)。在OBI獻(xiàn)血者中同樣觀察到攜帶有KIR 2DS4*del基因的頻率較重慶漢族健康人群升高(45.7 %vs 26.9%，χ2=12.911，P<0.05)，顯示出同梅毒人群中的易感性特征。但在普通的HBV感染人群中，Pan等[24]報(bào)道了101例慢性HBV感染患者中有26例攜帶有KIR 1D，明顯低于OBI獻(xiàn)血者的頻率(45.7% vs 25.7%，χ2=8.921，P<0.05)。因此，KIR 2DS4*del可能是HBV感染的一個(gè)易感基因，但也可能是OBI獻(xiàn)血者低病毒載量的一個(gè)有利因素，可能與病毒特征、配體特異性等相關(guān)，下一步本研究團(tuán)隊(duì)將就此展開(kāi)研究。

KIR的基因型由2條單倍體構(gòu)成，本研究發(fā)現(xiàn)單倍體A在OBI組、強(qiáng)直性脊柱炎和健康對(duì)照組所占的比例均高于單倍體B，但這兩種單倍體在兩組之間不存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明單倍體型分布情況在OBI中的致病作用關(guān)系不大。HLA-Ⅰ類(lèi)基因是KIR的配體，兩者間的相互作用以及HLA和KIR作為人體多態(tài)性最豐富的基因系統(tǒng)，造成了某些特定基因人群可能無(wú)法清除低水平的HBV從而產(chǎn)生OBI。因此，探明KIR與HLA-Ⅰ類(lèi)基因組合在OBI感染過(guò)程中的易感性和保護(hù)性作用，進(jìn)一步多地區(qū)、大樣本及深層的免疫學(xué)研究，闡明NK細(xì)胞調(diào)節(jié)HBV感染的機(jī)制是非常必要的。