曹利利，董 航，郭衍冰，姜 旭,，姚新華，苑淑賢，邵洪澤，宋建臣，賈立軍

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，長春130062；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延邊 133000）

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leakosis virus，ALV）引起的禽類可傳播良性和惡性腫瘤疾病的統(tǒng)稱。自然條件下，最常見的是淋巴白血病，此外還有成紅細(xì)胞增多性白血病、成髓細(xì)胞性白血病和髓細(xì)胞瘤病等[1]。本病在世界各地均有發(fā)生，感染率高，發(fā)病率低，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。禽白血病的危害主要表現(xiàn)為感染雞群出現(xiàn)腫瘤病及慢性消耗性死亡、生長發(fā)育不良、生產(chǎn)性能下降和免疫抑制等[2]。ALV可分為A～J 10個亞型，其中可感染雞的有A～E以及J亞型，E亞型是內(nèi)源性病毒。外源性ALV具有較強的致病性，最常見的是A、B和J亞型，可造成嚴(yán)重的危害[3]。

目前，禽白血病的檢測方法有很多，在這些檢測方法中，ELISA適用于種群凈化，具有快速靈敏，可大批量檢測樣品的特點。在我國，關(guān)于ALV的ELISA研究已經(jīng)有很多。1987年，李厚達(dá)[4]首次用ELISA方法檢測ALV；2010年，仇鈺等[5]建立了檢測雞血清中抗ALV抗體的間接ELISA方法，該方法符合率比IDEXX公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒符合率更高，并且可以檢測到ALV所有亞群的抗體；2014年，劉麗娜等[6]將重組蛋白gp85作為包被抗原建立的間接ELISA檢測法，與其他禽類病原沒有交叉反應(yīng)，具有良好的重復(fù)性。

p27蛋白是病毒的衣殼蛋白，在病毒總含量中占有較多，含有較多抗原表位，是ALV的群特異性抗原團[7]。因p27易于檢測的特點，常運用ELISA方法監(jiān)測p27抗原以達(dá)到凈化雞群的目的。本研究采用真核系統(tǒng)中表達(dá)的p27蛋白為包被抗原建立了檢測ALV的間接ELISA方法并進行了初步應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 材料p27重組蛋白純化產(chǎn)物（畢赤酵母中表達(dá)），通過親和層析柱純化，由本實驗研制并保存；ALV陽性血清與陰性血清、雞傳染性法氏囊陽性血清、雞傳染性支氣管炎陽性血清、火雞皰疹病毒陽性血清、雞大腸桿菌陽性血清、沙門氏菌陽性血清均由本實驗室采集并保存。

1.2 抗原包被濃度與血清稀釋度的確定將p27重組蛋白分別以20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 25 μg/mL共8個濃度進行包被，每孔100 uL，陽性血清和陰性血清稀釋為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800的5個梯度，測OD490值，篩選出最適抗原包被濃度與血清最佳稀釋度。

1.3 酶標(biāo)抗體稀釋度的確定在最適包被濃度的條件下，加入最適稀釋度的ALV陽性血清及陰性血清，將酶標(biāo)二抗稀釋為1∶2,500、1∶5000、1∶10 000、1∶20 000共4個梯度，每孔100 μL，確定酶標(biāo)抗體的最適反應(yīng)濃度。

1.4 反應(yīng)時間的確定在以上確定的最適條件下，分別篩選出待檢血清的最適反應(yīng)時間以及二抗的最佳反應(yīng)時間，設(shè)立0.5、1、1.5、2 h的4個不同反應(yīng)時間。為了確定顯色液反應(yīng)的最佳時間，設(shè)立5、10、15、20 min的4個不同反應(yīng)時間。

1.5 臨界值的確定隨機選取沒有禽白血病感染的雞陰性血清20份，用建立的間接ELISA方法檢測。計算OD490的平均值x，標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理x+3SD置信區(qū)間為99%，計算的值大于或者等于x+3SD即判定為陽性，反之判定為陰性。

1.6 特異性試驗 用已建立的間接ELISA檢測方法，對雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、馬立克病毒（Marek"s disease virus，MDV）、新城疫病毒（Newcastle disease v i r u s，N D V）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）的禽類病毒性傳染病病毒陽性血清、禽白血病陽性和陰性血清進行測定。

1.7 重復(fù)性試驗用同一批次制備的蛋白包被酶標(biāo)板，取陽性、陰性樣品各3份進行ELISA檢測，重復(fù)4次，在同樣的反應(yīng)條件下進行試驗；取4個批次生產(chǎn)的ELISA酶標(biāo)板，取陽性、陰性樣品各3份進行ELISA檢測，重復(fù)4次，在同樣的反應(yīng)條件下進行試驗。對試驗結(jié)果進行分析比較。

1.8 符合率試驗用IDEXX商品試劑盒對80份疑似禽白血病的血清進行檢測，以建立的ELISA方法做對比試驗，確定ELISA檢測方法的符合率。

1.9 臨床樣本檢測用建立的ELISA方法對2016年10月采自吉林省長春市、吉林市、通化市、四平市、松原市、延邊朝鮮族自治洲、白山市周邊地區(qū)的19個養(yǎng)雞場，共314份疑似ALV發(fā)病雞的血清樣本進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 最適抗原包被濃度與血清稀釋度的確定 測定包被的不同濃度的p27重組蛋白與不同稀釋度的血清反應(yīng)的OD490值。結(jié)果顯示（表1），當(dāng)p27蛋白包被濃度為2.5 μg/mL，血清稀釋度為1∶200時，P/N最大可達(dá)10.218 4，以此確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋度。

表1 最適抗原包被濃度與血清稀釋度的確定Table 1 Determination of optimal antigen coating concentration and serum dilution

2.1.2 最適酶標(biāo)抗體稀釋度的確定 根據(jù)2.1.1的試驗結(jié)果，選擇1∶200稀釋度的陽性和陰性血清，以4個梯度稀釋酶標(biāo)二抗進行濃度的篩選。當(dāng)稀釋度為1∶5000時，P/N值最大可達(dá)10.2177，以此確定酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度，結(jié)果見表2。

表2 最適酶標(biāo)抗體稀釋度的確定Table 2 Determination of the optimal dilution of enzymelabeled antibody

2.1.3 最佳反應(yīng)時間的確定

2.1.3.1 待檢血清最佳作用時間的確定 根據(jù)2.1.1和2.1.2的試驗結(jié)果，選擇最佳稀釋度的陽性、陰性血清以及酶標(biāo)抗體，以4個不同反應(yīng)時間進行待檢血清最佳作用時間的篩選?？芍?，當(dāng)血清作用1.5 h時，P/N值最大，以此確定待檢血清最佳作用時間，結(jié)果見表3。

表3 待檢血清最佳作用時間的確定Table 3 Determination of the optimal action time of the serum

2.1.3.2 酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時間的確定 根據(jù)2.1.1和2.1.2的試驗結(jié)果，選擇最佳稀釋度的陽性、陰性血清以及酶標(biāo)抗體，以4個不同反應(yīng)時間進行酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)時間的篩選。當(dāng)酶標(biāo)抗體作用1 h時， P/N值最大，以此確定酶標(biāo)抗體的最佳作用時間，結(jié)果見表4。

表4 酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時間的確定Table 4 Determination of the optimal reaction time of the enzyme-labeled antibody

2.1.3.3 最佳顯色時間的確定 根據(jù)2.1.1和2.1.2的試驗結(jié)果，選擇最佳稀釋度的陽性、陰性血清以及酶標(biāo)抗體，以4個不同反應(yīng)時間進行最佳顯色時間的篩選。當(dāng)顯色時間為12 min時，P/N值最大，以此確定最佳顯色時間，結(jié)果見表5。

表5 最佳顯色時間的確定Table 5 Determination of the optimal color development time

2.1.4 臨界值的確定 按照以上優(yōu)化的反應(yīng)條件，用建立的間接ELISA方法對20份陰性血清進行檢測，結(jié)果見表6。

表6 臨界值的確定Table 6 Determination of the critical value

表7 間接ELISA 方法的特異性試驗結(jié)果Table 7 Specific test results of indirect ELISA method

表8 間接ELISA 方法的批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果Table 8 Intra-assay repeated test results of indirect ELISA

按照統(tǒng)計學(xué)方法，求得20份陰性血清樣品的平均值x為0.1235，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為0.0248，根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原理x+3SD置信區(qū)間為99%。計算出ELISA陰性的臨界值是x+3SD=0.1979，因此待測樣品的OD490值≥0.1979為陽性；反之，則判斷為陰性。

2.2 特異性試驗以優(yōu)化后的間接ELISA檢測方法分別對禽類病毒性傳染病陽性血清和禽白血病陽性、陰性血清進行測定。結(jié)果顯示，除禽白血病陽性血清為陽性外，其他檢測結(jié)果為陰性，說明建立的檢測方法特異性良好，結(jié)果見表7。

2.3 重復(fù)性試驗以優(yōu)化后的間接ELISA檢測方法分別對批內(nèi)、批間（4個）各3份樣品重復(fù)4次進行檢測。結(jié)果顯示，重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于8%，說明建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表8、9。

2.4 符合率試驗為了進一步確定建立的ELISA檢測方法與市售商品試劑盒之間的符合率，分別以上述兩種方法對80份血清樣本進行檢測。結(jié)果顯示，符合率達(dá)96.92%，且建立的方法更為敏感。結(jié)果見表10。

表9 間接ELISA 方法的批間重復(fù)試驗結(jié)果Table 9 Inter-assay repeat test results of indirect ELISA

表10 間接ELISA 方法的符合率試驗結(jié)果Table 10 Conformance test results of indirect ELISA method

2.5 初步應(yīng)用以建立的間接ELISA檢測方法分別對吉林省內(nèi)6個市及1個自治洲周邊地區(qū)的314份疑似ALV的雞血清進行檢測。結(jié)果表明，陽性樣品總數(shù)為236份，陽性率為75.15%，其中四平市感染率最高。結(jié)果見表11。

3 討論

我國地域廣大，飼養(yǎng)的雞群品種多、養(yǎng)殖方式也都有所不同。要減少或杜絕禽白血病對雞場造成的損失，需要繼續(xù)開展凈化工作，從根本上對禽白血病進行有效防控。加強日常飼養(yǎng)管理，減少種雞群的感染率和建立無白血病的種雞群是控制本病的最有效方法[8]。家禽疫病診斷及檢測技術(shù)的主要發(fā)展趨勢是以高通量、快速、高特異性為主要方向，檢測方法仍然以RT-PCR技術(shù)、單克隆抗體、ELISA、核酸探針技術(shù)為主[9]。ELISA檢測方法因其具有敏感、簡便、快捷、適用于樣品數(shù)大檢測等特點，在眾多方法中脫穎而出，被廣泛應(yīng)用在種群凈化 中[10]。本研究中作為包被的蛋白可以降低生產(chǎn)成本，建立的ELISA方法具有良好的特異性與重復(fù)性，敏感性與商品化試劑盒相比更高。

毛婭卿等[11]構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-p27，在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白，純化后免疫家兔制備抗血清，ELISA抗體效價達(dá)1∶25 600。本研究以酵母分泌表達(dá)的p27蛋白作為包被蛋白，畢赤酵母表達(dá)是真核表達(dá)系統(tǒng)，既可在胞內(nèi)表達(dá)，又能進行分泌表達(dá)。有研究表明，相比于原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)里表達(dá)的蛋白與抗體結(jié)合效果更強[12-13]。

表11 間接ELISA 檢測臨床血清樣本檢測Table 11 Detection of clinical serum samples by indirect ELISA

p27蛋白是群特異性蛋白，具有高度保守性，針對p27蛋白建立禽白血病的檢測方法，可以有效減少因病毒突變而漏檢的現(xiàn)象[14]。而以酵母分泌表達(dá)的p27重組蛋白既保證了與天然p27蛋白相似的結(jié)構(gòu)和功能，還可以大量高密度發(fā)酵，降低制備成本。本研究以此蛋白為包被抗原建立ELISA檢測方法，對于動態(tài)監(jiān)測禽白血病流行病學(xué)情況，科學(xué)合理開展凈化工作意義重大，也為禽白血病基礎(chǔ)研究以及防治奠定了基礎(chǔ)。