劉 磊，馬永彪，肖躍強(qiáng)，沈志強(qiáng),，張松林

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種免疫抑制性的急性傳染病，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之 一[1]。2006年至今，我國(guó)爆發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly PRRSV，HP-PRRSV），給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，在我國(guó)流行的毒株主要以美洲型為主，歐洲型較少[2-3]。

PRRSV為有囊膜、單股、正鏈RNA病毒，大小約為15 kb。PRRSV NSPs編碼基因包含兩大開放閱讀框ORF1a和ORF1b，其中ORF1a編碼的復(fù)制酶多聚蛋白部分PP1a，被蛋白酶水解為10個(gè)NSPs蛋白，其中Nsp7有一個(gè)保守的內(nèi)部蛋白酶酶切位點(diǎn)，在蛋白酶的作用下，會(huì)被剪切成兩個(gè)蛋白：Nsp7α和Nsp7β[4]。Nsp7α被證實(shí)在病毒RNA的合成中起到了重要作 用[5]，在PRRSV感染中能明確表達(dá)，其個(gè)別氨基酸位點(diǎn)的變化能顯著影響病毒的增殖[6]。將Nsp7α蛋白免疫小鼠后0～202 d，每隔14 d采集一次血樣，通過ELISA的方法檢測(cè)不同時(shí)期的抗體水平，結(jié)果顯示，從28 d開始抗體水平顯著增高，到202 d為止，仍能一直維持較高水平，證明該蛋白在病毒的增殖和復(fù)制過程中起著決定性的作用[7]。

本研究克隆、可溶性表達(dá)了PRRSV DY株的Nsp7α蛋白，利用該蛋白建立了PRRSV Nsp7α血清抗體ELISA檢測(cè)方法。該方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的總符合率為93.9%，為PRRSV的抗體檢測(cè)提供了新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株、菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PRRSV DY株、Marc-145細(xì)胞、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21（DE3）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；BALB/c小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；DMEM、胎牛血清、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit、Total RNA Kit Ⅱ購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；AMP、IPTG購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；His標(biāo)簽純化柱購(gòu)自GE公司；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG購(gòu)自EarthOx公司。

1.3 豬血清檢測(cè)樣品的采集和處理PRRSV檢測(cè)血清樣品采自山東各大豬場(chǎng)；標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室自行制備，并經(jīng)IDEXX公司抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)為陰性與陽性；其他陰、陽性血清，如豬偽狂犬病毒血清、豬瘟病毒血清、豬圓環(huán)病毒環(huán)血清、豬細(xì)小病毒血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 Nsp7α基因的擴(kuò)增與原核表達(dá)載體的構(gòu)建參照 PRRSV DY株基因序列（GenBank：JN864948）， 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，pNsp7α-s： 5"-GGGGGATCCTCTCTGACTGGTGCCCT-3"； pNsp7α-r：5"-GGGAGCTCCTCCAGAACTTT CGGTG-3"，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。下劃線部分為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ的酶切位點(diǎn)序列。按照RNA提取試劑盒說明書提取PRRSV DY株的RNA，并按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以PRRSV DY株cDNA為模板，pNsp7α-s、pNsp7α-r為引物，PCR擴(kuò)增Nsp7α片段，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，-20℃保存?zhèn)溆?。將質(zhì)粒pET-32a(+)以及Nsp7α擴(kuò)增片段用BamH Ⅰ、SacⅠ雙酶切，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。雙酶切鑒定后，送上海生物工程有限公司測(cè)序，將正確的重組質(zhì)粒命名為pET-Nsp7α。

1.5 重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定將重組質(zhì)粒pETNsp7α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），挑取單克隆接種于10 mL LB/Amp培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。按照1∶10體積比接種至LB/Amp培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。 12 000 r/min 離心10 min，收集并超聲波裂解菌體，分離上清和沉淀，SDS-PAGE分析鑒定重組蛋白表達(dá)情況。采用His標(biāo)簽Ni-NTA親和層析方法純化目的蛋白，具體操作過程按說明書進(jìn)行。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用PRRSV陽性豬血清進(jìn)行Western blot分析。

1.6 抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定將純化后的Nsp7α蛋白用包被液梯度稀釋為2 μg/mL、1.5 μg/mL、1.0 μg/mL、0.75 μg/mL，每孔加入100 uL封閉過夜；PRRSV豬陽性血清和陰性血清梯度稀釋為5個(gè)稀釋度1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160，每孔加入100 μL，37℃ 孵育30 min進(jìn)行ELISA方陣試驗(yàn)。計(jì)算陽性血清孔與陰性血清孔的平均OD450P/N比值，比值最大的孔所對(duì)應(yīng)的抗原包被濃度和陰陽性對(duì)照的稀釋度為最佳條件，以此確定最終蛋白包被濃度和血清稀釋度。

1.7 封閉液的篩選分別用5%BSA、10%牛血清、5%牛血清、8%羊血清、10%脫脂奶粉5種封閉液，4℃封閉過夜，分別用陰、陽性血清檢測(cè)其OD450值，以P/N值最大的為最佳封閉液。

1.8 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)與TMB底物作用時(shí)間的確定按已確定條件進(jìn)行ELISA，酶標(biāo)二抗的稀釋度分別為1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10000；底物的顯色時(shí)間分別為5 min 、10 min、15 min 、20 min ；以P/N值最大的反應(yīng)時(shí)間為酶標(biāo)二抗最佳稀釋度和底物最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.9 陰陽性臨界值的確定選取55份已知未感染PRRSV的陰性血清樣本，以及1份已知感染PRRSV的陽性血清樣本，以上述優(yōu)化的ELISA檢測(cè)條件檢測(cè)，確定ELISA結(jié)果判定的臨界值。判定方法選用Cut-Off值法，將OD450值轉(zhuǎn)換成S/P值，計(jì)算出55份陰性血清的S/P平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。本文規(guī)定S/P（樣本）≤x+2SD時(shí)為陰性S/P，S/P（樣本）≥x+3SD時(shí)為陽性。當(dāng)S/P（樣本）值在二者之間為疑似，需要重新檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果S/P（樣本）＜x+2SD時(shí)為陰性]，反之則為陽性。S/P=[OD450(樣本）-OD450（陰性對(duì)照）]/[OD450(陽性對(duì)照）-OD450（陰性對(duì)照）]。

1.10 Nsp7α間接ELISA的特異性試驗(yàn)分別將偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、陽性血清1∶40稀釋，用上述建立的Nsp7α抗體ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，確定方法的特異性。

1.11 與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒符合率試驗(yàn)用IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清樣品115份，其中陽性血清53份，陰性血清62份，測(cè)試Nsp7α ELISA與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒符合率。

1.12 Nsp7α間接ELISA的重復(fù)性試驗(yàn)選取10份PRRSV抗體水平不同的血清，在相同的試驗(yàn)條件下，每份血清樣本平行做8個(gè)重復(fù)，用上述建立的Nsp7α抗體ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定以PRRSV DY 株cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得大小為450 bp的Nsp7α片段，將該片段克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)，用BamH Ⅰ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切片段大小與預(yù)測(cè)一致（圖1），且測(cè)序結(jié)果正確，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將鑒定正確的重組載體命名為pET-Nsp7α。

圖1 重組質(zhì)粒pET-Nsp7α 酶切鑒定Fig.1 Identification of pET-Nsp7α restriction endonucleases

2.2 Nsp7α重組蛋白的表達(dá)純化和鑒定在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h。菌體經(jīng)超聲破碎，分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白約為32 kDa，與預(yù)期大小一致，且在上清中表達(dá)（圖2）。用His標(biāo)簽Ni-NTA親和層析方法純化目的蛋白（圖3）。Western blot結(jié)果顯示，純化的蛋白能與PRRSV陽性血清反應(yīng)，證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性（圖4）。

圖2 pET-Nsp7α 的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果Fig. 2 The induced expression of the expressed pETNsp7α

圖3 Nsp7α 重組蛋白的純化結(jié)果的重組Fig.3 The induced purification of the expressed recombinant proteins Nsp7α

2.3 Nsp7α重組蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立方陣試驗(yàn)表明，Nsp7α重組蛋白最佳包被濃度為1.0 μg/mL，最佳抗體稀釋度為1∶40；經(jīng)過對(duì)5%BSA、10%牛血清、5%牛血清、8%羊血清、10%脫脂奶粉5種封閉液進(jìn)行測(cè)試，確定10%牛血清為最佳封閉液；稀釋度分別為1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10 000酶標(biāo)二抗進(jìn)行測(cè)試，最終確定酶標(biāo)二抗的最佳工作稀釋度為1∶4000；加入底物后顯色時(shí)間分別5、10、15、20 min，確定最佳顯色時(shí)間為37℃反應(yīng)15 min；選取55份IDEXX試劑盒檢測(cè)為陰性的血清樣本以及1份陽性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)確定臨界值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：若S/P的比值＞0.32，則判定為抗體陽性；若S/P的比值＜0.26，則判定為抗體陰性；若0.26≤S/P的比值≤0.32，則判為可疑，需重新檢測(cè)；若結(jié)果相同，則判為陽性。

2.4 Nsp7α ELISA的特異性試驗(yàn)用上述建立的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)，分別將偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒和豬細(xì)小病毒陽性血清按照1∶40稀釋，S/P值均小于0.26（表1），說明建立的ELISA方法特異性良好。

2.5 與商用試劑盒的符合率試驗(yàn)對(duì)115份臨床樣品分別用建立的方法與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，其中陽性血清53份，陰性血清62份。結(jié)果表明，陽性符合率為94.34%（50/53），陰性符合率為93.54%（58/62），總符合率為93.91%（108/115）（表2）。

圖4 Nsp7α 重組蛋白的Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of Nsp7α recombinanted protein

表1 Nsp7α ELISA 的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Specificity test results of Nsp7α ELISA

表2 Nsp7α ELISA 與IDEXX ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的比較Table 2 Comparison of test results of Nsp7α ELISA and IDEXX ELISA kit

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用本文所建立的Nsp7α抗體ELISA檢測(cè)方法對(duì)10份不同PRRSV抗體水平的血清進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，其變異系數(shù)均小于5%（表3），說明本文建立的Nsp7α抗體ELISA檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Reproducibility test results

3 討論

自上世紀(jì)80年代首次發(fā)現(xiàn)PRRSV至今，已經(jīng)建立起多種針對(duì)PRRSV的診斷方法，主要有針對(duì)抗體檢測(cè)的ELISA試驗(yàn)以及針對(duì)抗原檢測(cè)的PCR、熒光定量PCR等。目前廣泛使用的ELISA試劑盒，所包被的抗原主要以N蛋白為主，N蛋白具有良好的免疫原性，且血清抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[8]。利用非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)，目前仍處于起步階段，而Nsp7α的相關(guān)報(bào)導(dǎo)也較少。

Nsp7α在每個(gè)基因型中相對(duì)保守，但在基因型之間同源性不高[9]。氨基酸序列比較表明，Nsp7α在Ⅰ型PRRSV中具有96.7%～97.4%的氨基酸同源性，在Ⅱ型PRRSV中具有84.9%～100%的氨基酸同源性，但Ⅰ型和Ⅱ型基因型之間只有約45%的同源 性[10]，因此Nsp7α可以用于鑒別診斷PRRSV的Ⅰ型和Ⅱ型。Nsp7α在病毒的復(fù)制初期進(jìn)行表達(dá)，并參與病毒的復(fù)制過程，且抗體免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間很 長(zhǎng)[11]。

本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功純化獲得可溶性的Nsp7α重組蛋白及其多克隆抗體，可應(yīng)用于免疫熒光試驗(yàn)，并具有較高的特異性及敏感性。以Nsp7α重組蛋白為抗原，建立了Nsp7α-ELISA抗體檢測(cè)方法，并與IDEXX ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)比，總符合率為93.91%，證明Nsp7α具有較高的準(zhǔn)確性及敏感性，以此作為抗原來檢測(cè)PRRSV是可行的。