王立霞，孟慶玲，喬 軍，蔡擴軍，王登峰，郭 晶，伍曄暉，才學(xué)鵬

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003；2.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷 中心，烏魯木齊 830063；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000；4.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種革蘭氏陽性兼性厭氧的人畜共患致病菌，可引起人和多種動物的李斯特菌病[1-2]。LM是一種食源性病原體，可在老年人、新生兒、孕婦和免疫功能低下的人群引起嚴(yán)重的胃腸道、全身和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜腦炎、流產(chǎn)和新生兒感染，具有較高的死亡率[3-4]。同時，LM也是一種腐生菌，在土壤和植被中廣泛分 布[5]，易污染食品及動物飼草料，給食品衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的威脅。

LM作為一種胞內(nèi)寄生的致病菌，可感染專職和非專職吞噬細胞，并在胞內(nèi)長期生存。主要通過吞噬作用或內(nèi)化作用侵入宿主細胞，內(nèi)化后，LM利用溶血素O（LLO）的活性從宿主細胞吞噬體中逃逸到宿主細胞質(zhì)中。一旦進入宿主細胞質(zhì)中，LM迅速繁殖，并利用肌動蛋白細胞骨架結(jié)合表面蛋白ActA在細胞質(zhì)中的運動感染相鄰細胞[6-8]。LM在感染宿主過程中每一步均有特定的毒力因子參與，包括入侵所需的毒力基因（inlA、inlB），逃避吞噬體所需的毒力基因（hly、plcA、plcB），細胞內(nèi)運動所需的毒力基因（actA）以及細胞間擴散所需的毒力基因（inlC），而這些毒力因子的表達均受正調(diào)節(jié)蛋白PrfA的調(diào)節(jié)[9]。LM的耐受性和致病性與多種應(yīng)激調(diào)節(jié)因子和毒力因子密切相關(guān)，而大多數(shù)環(huán)境應(yīng)激因子和毒力因子的表達除了受PrfA和Sigma B的調(diào)節(jié)之外，ncRNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）與PrfA、VirR、Sigma B等調(diào)節(jié)分子組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對LM毒力及應(yīng)激相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平進行精細調(diào)控。

研究發(fā)現(xiàn)，RibonucleaseⅢ（RnaseⅢ）是一種調(diào)控ncRNA水平的重要酶系[10]，LM的致病性與ncRNAs的調(diào)控密切相關(guān)，然而，LM RnaseⅢ對其毒力的調(diào)控作用至今尚未有報道。鑒于此，在前期構(gòu)建LM-ΔrncS基因缺失突變株的基礎(chǔ)上，本研究通過動物感染試驗、細胞侵染試驗，對強毒株LMSB5及缺失株LM-ΔrncS的毒力、細胞粘附力、侵襲力及胞內(nèi)生存增殖能力進行檢測，分析RnaseⅢ RncS在調(diào)控LM毒力中發(fā)揮的作用，為進一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子調(diào)控機制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、菌株與試驗動物L(fēng)M-SB5強毒株由石河子大學(xué)動物疾病防控兵團重點實驗室保存；LM-ΔrncS缺失株由本實驗室前期構(gòu)建保存；小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞由本實驗室保存；8周齡18～ 22 g昆明系小鼠購自石河子大學(xué)實驗動物中心；胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；胰蛋白酶購自美國HyCloneTM公司；Triton X-100購自北京Biotopped公司；6孔板及細胞培養(yǎng)瓶購自Sigma 公司。

1.2 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株小鼠半數(shù)致死量LD50的測定參考Peng等[11]的方法，分別測出LM-SB5及LM-ΔrncS對小鼠的LD0和LD100。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將培養(yǎng)好的菌液離心后收集菌體，用無菌PBS緩沖液清洗2遍后制備成懸浮液，并進行一系列的倍比稀釋。將100只8周齡昆明系小鼠隨機平均分為A、B兩組，每組分為5個亞組，每個亞組10只。A組每只小鼠分別腹腔注射0.5 mL不同稀釋梯度的LMSB5菌懸液， B組每只小鼠分別腹腔注射0.5 mL不同稀釋梯度的LM-ΔrncS菌懸液。攻毒后連續(xù)7 d觀察，記錄小鼠精神狀態(tài)及臨床癥狀，然后統(tǒng)計各組小鼠的死亡情況，計算死亡率，應(yīng)用孫氏改良寇氏法分別計算LM-SB5及LM-ΔrncS對小鼠的LD50，并計算其LD50的95%可信限。

1.3 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株小鼠生存率的測定將30只8周齡昆明系小鼠隨機分成A、B、C 3個組，每組10只，A、B2組每只小鼠分別腹腔注射0.5 mL LM-SB5和LM-ΔrncS細菌懸液，C組每只小鼠腹腔注射0.5 mL PBS緩沖液，攻毒后連續(xù)7 d觀察、記錄小鼠精神狀態(tài)及死亡情況，并繪制其Kaplan-Meier生存曲線。

1.4 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株接種小鼠臟器載菌量及病理組織學(xué)分析參考文獻[12]的方法，將8周齡昆明系小鼠隨機分為3組，分別腹腔注射0.5 mL亞致死劑量的LM-SB5、LM-ΔrncS細菌懸浮液和PBS緩沖液，第1～5 d每組各取1只小鼠，無菌摘取肝臟、脾臟，加入1.0 mL PBS研磨勻漿，連續(xù)10倍梯度稀釋后，均勻涂布于BHI平板固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)16 h。吸取不同稀釋梯度的組織研磨液進行標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)，每個稀釋梯度設(shè)置3個重復(fù)，取平均值作為肝臟、脾臟載菌量；第5 d時分別摘取3組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟，經(jīng)4%甲醛溶液固定24 h后，制備切片，HE染色后觀察其病理組織學(xué)變化。

1.5 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株黏附、侵襲小鼠巨噬細胞RAW264.7能力檢測挑取生長較好的小鼠巨噬細胞RAW264.7加入6孔板中，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)36 h。將0.5 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的LMSB5、LM-ΔrncS菌液，按巨噬細胞：細菌=1∶100的比例分別加至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，1 h后吸出細胞培養(yǎng)液100 μL進行一系列的10倍梯度稀釋；分別吸取100 μL各梯度稀釋液均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基；PBS清洗3遍，加入2 mL含100 μg/mL慶大霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，加入2 mL 0.5%的Triton X-100裂解細胞15 min，吸取該細胞裂解液用BHI培養(yǎng)液進行系列倍比稀釋，分別吸取100 μL各梯度稀釋液均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)16 h后進行標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)。

1.6 LM-SB5及LM-ΔrncS 菌株在小鼠巨噬細胞RAW264.7內(nèi)生存增殖能力檢測按上述方法侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7，PBS清洗2遍，加入2 mL含100 μg/mL慶大霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，以殺滅細胞外細菌；1 h后，PBS清洗2遍，向各孔中分別加入2 mL含10 μg/mL慶大霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液，分別在2、4、6、8、10、12 h吸出孔中培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2遍，按1.5方法裂解細胞，菌落計數(shù)，并繪制細菌在細胞內(nèi)的生長曲線。試驗重復(fù)3次，每次3個平行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism5.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株的LD50測定結(jié)果通過預(yù)實驗，測出LM-SB5的LD0為1.08×105CFU，LD100為1.72×106CFU；LM-ΔrncS的LD0為 1.0×105CFU，LD100為1×109CFU。分別以此劑量為LD50測定的最大劑量，并進行一系列倍比稀釋，小鼠腹腔分別注射LM-SB5和LM-ΔrncS細菌懸浮液后進行觀察及LD50測定。12 h后發(fā)現(xiàn)部分小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、畏寒打顫等癥狀，第1 d后部分小鼠開始死亡；注射LD100組的小鼠在第2～3 d開始死亡，第3～4 d大部分死亡，病理解剖發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟、脾臟腫大，部分腸道出現(xiàn)充血、出血的現(xiàn)象。注射LD0組的小鼠盡管出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、嗜睡等現(xiàn)象，但在第3 d后基本恢復(fù)正常。利用孫氏改良寇氏公式計算得到LM-SB5和LM-ΔrncS對昆明系小鼠的LD50分別為105.60、106.90CFU，LM-SB5 LD50的95%可信限：105.456CFU～105.750CFU（表1），LMΔrncSLD50的95%可信限：106.412CFU～107.388CFU，LM-ΔrncS的LD50升高了1.30個對數(shù)數(shù)量級，表明rncS基因缺失對小鼠的毒力顯著下降，提示rncS基因?qū)M毒力發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

表1 LM-SB5 與LM-ΔrncS 的LD50 測定結(jié)果Table 1 LD50 measurement results of LM-SB5 and LM-ΔrncS

2.2 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株小鼠存活率的測定結(jié)果Kaplan-Meier生存曲線顯示，感染LM-SB5的小鼠平均存活時間為2.1 d，第2 d死亡率高達50%；而感染LM-ΔrncS的小鼠平均存活時間為5.8 d，第 4～7 d小鼠未出現(xiàn)死亡，存活率為70%，與強毒株LM-SB5組相比，存活時間顯著延長，而對照組小鼠未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象（圖1），提示rncS基因?qū)M的毒力具有重要的調(diào)控作用。

圖1 腹腔注射LM-SB5 和LM-ΔrncS 后小鼠的生存曲線Fig.1 Survival curves of mice infected by intraperitoneal injection of LM-SB5 and LM-ΔrncS

2.3 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株接種小鼠臟器載菌量的測定結(jié)果感染后第1 d，LM-SB5與LM-ΔrncS接種組小鼠肝臟和脾臟的載菌量差異不顯著（p＞0.05）；第2 d，脾臟的載菌量差異不顯著（p＞0.05），肝臟的載菌量差異顯著（p＜0.05）；第3～5 d，二者差異均顯著（p＜0.05），且第4 d差異極顯著（p＜0.01），LM-SB5接種組肝臟和脾臟的載菌量均顯著高于注射LM-ΔrncS組（p＜0.05）（圖2），提示rncS基因?qū)M在宿主體內(nèi)的生存增殖中具有調(diào)控作用。

2.4 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株接種小鼠臟器病理組織學(xué)分析經(jīng)HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，與正常對照組（圖3A）相比，LM-SB5接種組（圖3B）和LM-ΔrncS接種組（圖3C）肝臟、脾臟、腎臟均出現(xiàn)了不同程度的病理變化。LM-SB5組小鼠部分肝臟細胞壞死，肝小葉中有炎性細胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)網(wǎng)狀絲狀結(jié)構(gòu)；脾臟的網(wǎng)狀纖維中出現(xiàn)透明變性和纖維蛋白滲出物，淋巴組織壞死，脾小結(jié)體積增大，細胞間結(jié)構(gòu)疏松，間質(zhì)增寬；腎臟有明顯的顆粒樣變性，小靜脈出血，出現(xiàn)炎性細胞，結(jié)締組織增生，間質(zhì)擴大，腎小管上皮細胞核溶解，間質(zhì)充血。LM-ΔrncS組肝組織結(jié)構(gòu)較清晰，肝小葉出現(xiàn)炎性細胞浸潤；脾臟部分壞死，脾小結(jié)體積增大，但結(jié)構(gòu)較完整；腎小球腫脹，結(jié)締組織增生，間質(zhì)增寬，表明rncS基因缺失降低了LM對小鼠組織器官的病理損傷能力。

2.5 LM-SB5及LM-ΔrncS菌株侵染小鼠巨噬細胞RAW264.7能力的測定細胞侵染試驗結(jié)果顯示，LM-SB5及LM-ΔrncS對巨噬細胞RAW264.7的粘附率分別為39.908%、26.774%（圖4A），侵襲率分別為3.086%和0.961%（圖4B）；與LM-SB5相比，LM-ΔrncS對RAW264.7細胞的粘附率和侵襲率均顯著降低（P＜0.01），提示rncS基因在LM侵襲、粘附RAW264.7細胞過程中發(fā)揮了調(diào)控作用；在侵染后不同時間段內(nèi)對細胞內(nèi)細菌量進行平板計數(shù)，發(fā)現(xiàn)LM-SB5及LM-ΔrncS的數(shù)量均隨時間的變化呈先下降再上升的趨勢。在各個時間點，LM-ΔrncS的數(shù)量均低于LM-SB5（圖5）。2～4 h時，LM-SB5及LM-ΔrncS的數(shù)量均迅速下降至最低值，且LMΔrncS下降趨勢更明顯（P＜0.01）；4～6 h時，二者均迅速上升，差異顯著（P＜0.05），但在8～12 h時，差異不顯著（P＞0.05），基本保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，rncS基因缺失降低了LM-SB5在RAW264.7細胞內(nèi)的生存增殖能力，證實RnaseⅢ RncS對LM在RAW264.7細胞內(nèi)的早期生存過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

圖3 小鼠肝臟、脾臟、腎臟病理組織學(xué)檢查（HE×400）Fig.3 Histopathological examination of mice liver, spleen and kidney(HE×400)

圖4 LM-SB5 及LM-ΔrncS 菌株對巨噬細胞RAW264.7 的侵染結(jié)果Fig.4 Infection results of LM-SB5 and LM-ΔrncS on macrophage RAW264.7

3 討論

小RNA（sRNA）是調(diào)控細菌基因表達的重要元件之一，可參與許多細菌的應(yīng)激耐受和毒力調(diào)控，目前被認(rèn)為是細菌致病的重要調(diào)控因子[13]。一些sRNA可以與蛋白質(zhì)直接結(jié)合，調(diào)節(jié)它們的活性，或直接通過堿基配對其靶mRNA發(fā)揮調(diào)控作用。sRNA和靶RNA之間的堿基配對可阻斷翻譯、RNA翻譯活化或RNase對復(fù)合物的特異性切割[14]。利用上述機制，sRNA可以抑制腸道沙門氏菌[15]和單核細胞增生李斯特菌[16]的轉(zhuǎn)座，調(diào)節(jié)大腸桿菌中某些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的合成[17]，并影響細菌的一些代謝和毒力因子的表達[18]。

LM是一種廣泛存在于環(huán)境中的革蘭氏陽性胞內(nèi)寄生致病菌，具有在專職吞噬細胞和許多非吞噬細胞內(nèi)侵入、存活和增殖的能力，其產(chǎn)生受sRNA介導(dǎo)的時空調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)，在感染期間，LM可產(chǎn)生許多的毒力因子，這些毒力因子除了受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控之外，ncRNAs對其毒力基因表達的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平也發(fā)揮著重要的調(diào)控作 用[19]。目前，LM EGD-e中報道了304個非編碼RNA元件，包括154個sRNA、104個反義和46個順式編碼RNA[20]。研究表明，LM中的sRNA在毒力調(diào)控中發(fā)揮重要作用[16]，Chaudhuri等[21]研究發(fā)現(xiàn)，sRNA LhrA通過與LM的毒力因子幾丁質(zhì)酶chiA mRNA堿基互補配對，阻止核糖體的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控chiA的表達來提高LM的毒力；Sievers等[22]證實sRNA LhrC通過與LM表面蛋白lapB基因mRNA互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控LapB的表達。

圖5 LM-SB5 及LM-ΔrncS 菌株不同時間點在RAW264.7胞內(nèi)的細菌數(shù)Fig.5 Numbers of LM-SB5 and LM-ΔrncS in the RAW264.7 cells after infection at various time

核糖核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）是一種能夠切割具有雙鏈結(jié)構(gòu)RNA的核酸內(nèi)切酶，廣泛存在于真核生物、細菌、真菌中，是一種高度保守的水解酶。它不僅在rRNA和tRNA成熟中起重要作用，而且在維持mRNA穩(wěn)定性方面也發(fā)揮重要的作用[19]。RNaseⅢ家族的酶在起初真核生物非編碼RNA調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用[23]，近年來研究發(fā)現(xiàn)RNaseⅢ在細菌sRNA調(diào)節(jié)中也有類似的作用。2007年，Darfeuille等[24]報道，在大腸桿菌中，RNaseⅢ主要在IstR-1 sRNA結(jié)合后切割tisAB mRNA；此外，在sRNA與其mRNA靶標(biāo)的5"-UTR堿基配對后，體內(nèi)RyhB sRNA衰變依賴于RNaseⅢ[25]。2011年，Abidat等[26]發(fā)現(xiàn)RNaseⅢ是其毒力所必需的，可直接作用于毒力相關(guān)基因，同時也可以結(jié)合小非編碼反義RNA分子與mRNA靶標(biāo)復(fù)合物[27]，進而調(diào)控毒力基因的表達。2013年，Haddad等[28]發(fā)現(xiàn)RNaseⅢ在空腸彎曲桿菌感染期間也發(fā)揮著重要作用。2015年，Bonnin等[30]在研究金黃色葡萄球菌時證實，RNaseⅢ通過降解sRNA/mRNA雙鏈體調(diào)節(jié)參與細胞粘附和逃避免疫因子的表達。2016年，Wu等[29]在布魯氏菌中發(fā)現(xiàn)，RNaseIII可以有效地結(jié)合和切割小RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并推測其可能參與布魯氏菌的毒力調(diào)節(jié)。LM具有跨越宿主屏障，逃避免疫防御，侵入宿主細胞和操縱細胞機制的獨特能力，已成為研究宿主-病原體相互作用的模型[20,31]，因此開展RNaseⅢ介導(dǎo)的sRNA表達調(diào)控研究，對揭示LM在宿主細胞內(nèi)的生存與致病機制具有重要意義。本研究通過動物感染試驗、細胞侵染試驗，發(fā)現(xiàn)LM-ΔrncS對LM毒力、巨噬細胞粘附、侵襲能力及其在肝臟、脾臟巨噬細胞內(nèi)生存增殖能力均顯著降低，表明rncS基因?qū)M毒力發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，為進一步揭示RnaseⅢ RNcS參與LM ncRNA調(diào)控毒力的分子機制奠定了基礎(chǔ)。