王 璇，吳玙彤，潘淑惠，黃 波，高明琴，文正常

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005）

近年來，隨著我國肉羊養(yǎng)殖數(shù)量及養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，頻繁的跨區(qū)域引種及大量的活羊、肉品的市場交易和流通，因受長途運(yùn)輸應(yīng)激、不同季節(jié)和地域氣候特性、飼養(yǎng)管理方式的差異等不利因素的影響，導(dǎo)致羊傳染性胸膜肺炎（infectious pleuropneumonia of sheep and goats）的發(fā)生變得更加頻繁，其流行區(qū)域及范圍更加廣泛，已成為一種危害國內(nèi)肉羊養(yǎng)殖生產(chǎn)的主要常發(fā)條件性傳染病，嚴(yán)重影響肉羊產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)性發(fā)展[1-3]。該病潛伏期較長，當(dāng)臨床癥狀顯著時(shí)往往處于發(fā)病晚期，給治療帶來困難。由于肉羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的特殊性，目前國內(nèi)肉羊?qū)I(yè)規(guī)模化養(yǎng)殖相對滯后，大部分地區(qū)仍以農(nóng)戶小規(guī)模分散養(yǎng)殖為主，其分布主要在交通相對欠發(fā)達(dá)的邊遠(yuǎn)山區(qū)，無論從養(yǎng)殖設(shè)施條件、規(guī)范化養(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用，到早期特異性檢測診斷技術(shù)手段等，都難以滿足該病有效防控的技術(shù)條件及要求[4-6]。

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是羊傳染性胸膜肺炎的主要致病源，研究表明，RPS11是綿羊肺炎支原體的重要抗原[7-9]。RPS11是參與核糖體構(gòu)成的重要亞單位，核糖體蛋白質(zhì)（ribosomalprotein，RP）在進(jìn)化過程中高度保守，在哺乳動物中其氨基酸序列均相同，在原核細(xì)菌、真菌和酵母中也極其相似。RP是一種RNA結(jié)合蛋白，與核糖體RNA共同參與蛋白質(zhì)的合成。其功能是組裝、穩(wěn)定rRNA，協(xié)助rRNA完成譯碼功能。根據(jù)來源的大小亞基RP分別被命名為RPL和RPS。RPS11能刺激機(jī)體產(chǎn)生相對較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。本研究根據(jù)羊傳染性胸膜肺炎支原體分離株（GM01株）全基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增RPS11基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-RPS11，表達(dá)、純化重組蛋白RPS11，并對其免疫原性進(jìn)行鑒定；同時(shí)，以重組蛋白RPS11為包被抗原建立間接ELISA檢測方法，為羊傳染性胸膜肺炎的早期診斷、監(jiān)測、免疫抗體效價(jià)檢測及綜合防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要材料羊傳染性胸膜肺炎支原體分離株（GM01株）、高免血清由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存和制備；羊口蹄疫、布魯氏桿菌陽性血清購自青島立見生物公司；陰性山羊血清購自廣州蕊特生物科技有限公司；山羊傳染性胸膜肺炎間接血凝檢測試劑購自蘭州獸醫(yī)研究所；BamHI、XhoI購自NEB公司；Pfu DNA polymerase購自ThermoFisher公司；T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；載體pET28a（+）、大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購于大連寶生物；辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗羊IgG（Rbanti-Goat IgG/HRP）購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；鄰苯二胺（OPD）購于BBI公司；YEAST EXTRACT、TRYPTONE購自O(shè)XOID公司；IPTG、硫酸卡拉素購自Amresco公司；Tris購自Solarbio公司；還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽）購自Merck公司；考馬斯亮藍(lán)G250購自上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；精氨酸購自北京中科科奧生物科技有限公司；NaCl、EDTA·2Na、KH2PO4、Na2HPO4、NiSO4、磷酸等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登記的羊肺炎支原體16S rRNA中的保守序列（GenBank登錄號：JFAD01000011），應(yīng)用DNAStar軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物M1：5"-TGGAGCGACACAGAGTGC AC-3"，下游引物M2：5"-GCTGTGCTAGTGACTTT T G C C-3"，擴(kuò)增全長基因。再對該段基因的抗原表位集中區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，RPS11-F：5"-GGATCCATGGCAACTAATACTCGT-3"；RPS11-R：5"-CTCGAGCCTTTTTTCCTGACG-3"（下劃線處分別為BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)），引物均由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增按照細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒說明提取GM01株的基因組DNA。以提取的DNA為模板，PCR反應(yīng)體系50 μL：ddH2O 25 μL，2×PCR mix 20 μL，基因組DNA模板4 μL，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72℃延伸10 min。膠回收目的條帶，連至克隆載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET28a和重組克隆質(zhì)粒，回收目的基因，使用T4 DNA Ligase于16℃水浴鍋孵育0.5～1 h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于LB固體平板，37℃過夜培養(yǎng)。待平板長出菌落，隨機(jī)挑取若干個單個菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。菌液測序及驗(yàn)證送由測序公司完成。

1.5 重組蛋白RPS11的原核表達(dá)、鑒定與純化

1.5.1 感受態(tài)轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選 從超低溫冰箱中取出Rosetta感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化；加入pET28a-RPS11質(zhì)粒5 μg，輕輕吹吸充分混勻，冰浴30 min；水浴42℃熱激90 s，冰上放置1～2 min；加入800 μL預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基，37℃ 5×g搖菌培養(yǎng)50 min；7 000×g離心4 min，去部分上清，取 150 μL體積菌液混勻后涂至卡那抗性平板上；倒置，37℃培養(yǎng)12～16 h可出現(xiàn)單菌落。

1.5.2 重組蛋白RPS11小量表達(dá)與鑒定 挑選含pET28a-RPS11重組質(zhì)粒的單菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后-20℃保種；分別挑選含pET28a-RPS11重組質(zhì)粒的單菌落至3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600約0.6；取部分菌液作為對照組，余下菌液加入終濃度1 mmol/L IPTG，37℃震蕩培養(yǎng)3 h；分別取兩組菌液0.15 mL、12 000×g離心2 min，菌體沉淀以40 μL、1×loading buffer重懸裂解，SDS-PAGE檢測。

1.5.3 RPS11蛋白大量表達(dá)及破菌檢測 取保存于-20℃的菌種100 μL接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；取100 mL菌液接種于2000 mL LB液體培養(yǎng)基37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到30℃；加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.1 mmol/L、30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)8 h；13 000 ×g離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預(yù)冷NTA-0緩沖液中，冰浴30 min；超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、時(shí)間25～30 min，4℃條件下50 000×g離心 50 min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測，剩余上清及沉淀置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 RPS11包涵體蛋白純化 沉淀以50 mL NTA-0緩沖液重懸，加入DTT至終濃度1 mmol/L；超聲促進(jìn)雜蛋白溶解（參數(shù)設(shè)置：功率200 W、工作3 s、暫停3 s、時(shí)間10 min），20 000×g4℃離心10 min，棄上清；重復(fù)以上步驟至上清透明。沉淀以PBS重懸、超聲（參數(shù)設(shè)置：功率200 W、工作3 s、暫停3s、時(shí)間5 min），50 000×g4℃離心10 min，去上清；3 mL 6 mol/L鹽酸胍重懸包涵體，加DTT至終濃度5 mmol/L、10×g37℃震蕩3 h至包涵體全部溶解，4℃條件下200×g離心10 min，收集上清。

1.5.5 RPS11包涵體蛋白復(fù)性 以2倍體積的3 mol/L鹽酸胍稀釋蛋白溶液，4℃條件下逐滴加入到200 mL復(fù)性液（pH8.0）中，轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至最大，攪拌24 h，降低轉(zhuǎn)速攪拌24 h；取蛋白溶液于透析袋中，以PEG 20 000濃縮體積至50～100 mL，4℃條件下PBS緩沖液中透析過夜，以PEG20 000濃縮體積至2～4 mL，4℃條件下PBS緩沖液透析過夜；取蛋白溶液進(jìn)行SDSPAGE檢測。

1.5.6 復(fù)性蛋白純化 復(fù)性蛋白溶液用0.22 μm過濾器過濾備用； 按Ni-NTA柱料準(zhǔn)備流程準(zhǔn)備Ni-NTA柱；以1 mL/min的流速上樣上清蛋白溶液；以 0.1 mol/L EDTA溶液洗柱至流出液不含蛋白；分別以20、60、200和50 mmol/L咪唑洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測液不變色；以3倍柱體積去離子水洗滌柱料，以20%乙醇封柱；對收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 間接ELISA檢測方法的建立

1.6.1 抗原包被濃度及陽性血清稀釋度的篩選 采用棋盤法，將純化后的RPS11蛋白用0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液（包被液）分別稀釋至4.0、2.0、1.0、0.51 μg/mL，取酶聯(lián)反應(yīng)板，4℃包被過夜，用200 μL PBST溶液洗滌3次，加入200 μL/孔0.05%脫脂奶的PBST溶液37℃封閉1 h，洗滌3次。每孔分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，加入100 μL稀釋的陰性、陽性血清，37℃孵育45 min；洗滌3次，按100 μL/孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)兔抗羊IgG，37℃作用30 min，洗滌5次；50 μL/孔加入顯色液10 min；按50 μL/孔加入2 mol /L H2SO4終止液終止顯色，于酶標(biāo)儀OD450檢測。根據(jù)OD450值計(jì)算相應(yīng)的P/N值，選擇陽性血清OD450接近于1.0，陰性血清對應(yīng)孔OD450值接近于0.2，且其P/N值對應(yīng)的最大值作為最佳反應(yīng)條件，以確定抗原最佳包被濃度及陽性血清稀釋度。

1.6.2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 以選定的抗原包被濃度和陽性血清稀釋度，將酶標(biāo)兔抗羊IgG分別按將1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、 1∶10 000稀釋，比較各組OD450測定值，以P/N最大值為酶標(biāo)二抗最佳工作濃度。

1.6.3 待檢血清作用時(shí)間的選擇 加入待檢陽性血清，分別在37℃條件下孵育30、45、60、75、90、120 min后進(jìn)行檢測，比較各組OD450測定值以P/N最大值為最佳作用時(shí)間。

1.6.4 酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 加入酶標(biāo)二抗，分別在37 ℃條件下孵育30、45、60、75、90、120 min后進(jìn)行檢測，選定P/N最大值為二抗最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.6.5 TMB底物反應(yīng)時(shí)間的選擇 在選定條件下，加入TMB顯色溶液37℃條件下分別孵育5、10、15、20、25 min，加入50 μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，以P/N最大值為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.6.6 臨界值的確定及判定方法 用選定的最佳反應(yīng)條件下建立的間接ELISA檢測方法測定36份羊陰性血清OD450值，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（s）；當(dāng)OD450值≥即判定為陽性，OD450值即判定為陰性，值即判定為可疑。

1.6.7 特異性交叉檢測試驗(yàn) 分別選擇羊口蹄疫、布魯氏菌陽性血清，應(yīng)用建立的間接ELISA檢測方法進(jìn)行交叉檢測，每份血清重復(fù)檢測6孔，比較其特異性。

1.6.8 臨床樣本檢測 應(yīng)用建立的間接ELISA檢測方法對從4個生產(chǎn)羊場采集的共180份臨床非免疫血清樣本進(jìn)行檢測，并與羊傳染性胸膜間接血凝檢測試驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)算符合率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果以GM01株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶構(gòu)建至克隆載體。結(jié)果顯示，在402 bp處出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預(yù)期大小相符合（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定重組克隆質(zhì)粒以及pET28a經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，膠回收酶切產(chǎn)物，并鏈接構(gòu)建pET28a-RPS11重組表達(dá)質(zhì)粒。雙酶切鑒定為陽性（圖2），測序結(jié)果正確，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 RPS11 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of RPS11 gene

圖2 pET28a-RPS11 質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-RPS11 by restriction enzymes digestion

2.3 重組RPS11蛋白的原核表達(dá)、鑒定與純化pET28a-RPS11表達(dá)蛋白經(jīng)過超聲波破碎、離心后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，RPS11重組蛋白主要以包涵體的形式存在；包涵體蛋白經(jīng)復(fù)性及Ni-NTA純化處理后，獲得了大小為19 kDa的RPS11重組蛋白3 mg，純度＞85 %（圖3）。

2.4 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化從方陣試驗(yàn)結(jié)果可以看出，pET28a-RPS11重組蛋白抗原濃度為 1.0 μg/mL，血清的稀釋度為1∶400時(shí)，陽性血清的OD450值在1.0左右，且陰性血清的OD450較低，P/N值最高（表1）。因此確定抗原最佳包被濃度為 1.0 μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶400。按上述條件繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)條件篩選，根據(jù)P/N值的大小明確了血清最佳作用時(shí)間為45 min，酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶4000，酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min，底物顯色為10 min。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物分析圖Fig.3 The analysis of expression product

表1 重組蛋白抗原最適包被濃度與血清稀釋度的確定Table 1 The optimization of coating concentration with RPS11 protein and serum concentration

2.5 臨界值的確定在抗原包被濃度為1.0 μg/ mL，血清稀釋度為1∶400條件下，對36份陰性血清進(jìn)行檢測（表2）。計(jì)算其平均值標(biāo)準(zhǔn)差s=0.047。故當(dāng)OD450值≥0.386判定為陽性，OD450值≤0.339即判定為陰性，0.339＜OD450值＜0.386即判定為可疑。

表2 36 份陰性血清檢測結(jié)果Table 2 Detection results of 36 negative sera

2.6 特異性交叉檢測應(yīng)用建立的間接LISA檢測方法對羊口蹄疫、布魯氏菌陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，表明無交叉特異性反應(yīng)。

2.7 臨床樣本檢測應(yīng)用建立的間接ELISA檢測方法和間接血凝檢測方法分別對180份生產(chǎn)場臨床血清樣本進(jìn)行檢測（表3）。結(jié)果表明，間接ELISA檢測陽性率為35.00%，陰性率為65.00%；間接血凝檢測陽性率為29.44%，陰性率為70.56%；兩者間陽性符合率為94.34%，陰性符合率為89.76%，總符合率達(dá)91.11 %。

表3 180 份臨床血清間接ELISA 與HI 試驗(yàn)檢測結(jié)果Table 3 Detection results of indirect ELISA and HI test of 180 clinical goat sera

3 討論

3.1 本研究通過貴州羊傳染性胸膜肺炎支原體分離的GM01株全基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因RPS11，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-RPS11，成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)RPS11重組蛋白并鑒定及純化。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RPS11重組蛋白分子量正確，約為19 kDa，純度為85%，具有良好的抗原性及特異性。

3.2 本研究基于原核表達(dá)的RPS11重組蛋白作為包被抗原建立的羊傳染性胸膜肺炎間接ELISA檢測方法，具有較好的檢測敏感性和特異性；與羊傳染性胸膜間接血凝檢測方法相比，兩者符合率達(dá)91.11%，與其他學(xué)者建立的間接ELISA檢測符合率[10-13]的結(jié)果相符。該方法適用于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展血清學(xué)檢測診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也為診斷試劑盒的研發(fā)奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。