師志海，徐照學，蘭亞莉，王文佳

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 制藥工程學院，鄭州 450046；3.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，鄭州 450002）

牛諾如病毒（Bovine norovirus，BNoV）是杯狀病毒科、諾如病毒屬的單股正鏈RNA病毒，能夠引起犢牛腹瀉，各年齡段犢牛均易感。該病毒首次在英國腹瀉犢牛的糞便中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后歐洲、美洲及亞洲各地也相繼檢測出該病毒[2-4]。我國于2017年首次檢測出該病毒[5]，且目前在我國只檢測出基因型1的BNoV。BNoV在我國的流行病學調(diào)查及分子遺傳演化目前尚無報道。牛感染BNoV后會出現(xiàn)腹瀉、厭食、吸收不良、精神不振的臨床癥狀，腹瀉常持續(xù)3～4 d，3周齡的犢牛比新生犢牛發(fā)病嚴重。目前還沒有合適的細胞類型用于培養(yǎng)BNoV，健康牛的腸道也可攜帶BNoV，因此，BNoV對犢牛腹瀉的致病機制也尚不清楚[6]。

牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKoV），又名Aichivirus B，是無囊膜的RNA病毒，小RNA病毒家族的成員之一。目前國際上公認的嵴病毒有人愛知病毒（Aichi virus，AiV）和牛嵴病毒，豬嵴病毒（Porcine kobuvirus，PKoV）屬于候選病毒[7]。BKoV于2003年首次在健康牛的血清和糞便中被發(fā) 現(xiàn)[8]，2008年在腹瀉牛的糞便樣品中檢測到BKoV[9]。由于健康牛和腹瀉牛的糞便中都可檢測出BKoV[7,10]，所以BKoV是否能夠直接引起新生犢牛腹瀉，尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 病料牛諾如病毒（B N o V）、牛嵴病毒（BKoV）、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCoV）、牛星狀病毒（Bovine astrovirus，BAstV）、牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛紐布病毒（Bovine nebovirus，BNeV）陽性病料均由本實驗室收集、鑒定和保存。127份糞便樣本采集于河南地區(qū)的牛場4月齡以下腹瀉犢牛的糞便。

1.2 主要試劑MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaq、DNA Marker 2000、pMD 18-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)均購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit購自OMEGA公司。

1.3 臨床樣品處理及病毒核酸提取127份臨床樣品，用PBS 按1∶10（w∶v）混懸，漩渦震蕩30 s，4℃條件下8000 r/min離心5 min，收集上清，-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肰iral RNA/DNA Extraction Kit提取總RNA，利用反轉錄試劑盒制備cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設計及合成根據(jù)GenBank上發(fā)表的BNoV病毒基因的保守序列，利用Prime Premier 5.0軟件對病毒基因的保守區(qū)域設計1對引物，預計擴增片段為542 bp；BKoV的引物參考參考文獻[11]，預計擴增片段為216 bp。引物由華大基因生物科技有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 本研究引物Table 1 The information of primers used in this study

1.5 雙重PCR擴增雙重PCR的最佳反應體系PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.25 μL（10 pmol/μL），BNoV和BKoV的混合cDNA模板1 μL，ddH2O補足20 μL；擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。單一PCR的反應體系：PremixTaq10 μL，上、下游引物各0.5 μL，單一cDNA模板1 μL，ddH2O補足20 μL；擴增程序同雙重PCR反應。

1.6 特異性試驗采用本研究建立的雙重PCR方法對BKoV、BNoV、BCoV、BRV、BAstV、BVDV、BNeV進行檢測，同時設置陰性對照，驗證建立的PCR方法的特異性。

1.7 敏感性試驗用上述引物分別對BKoV和BNoV的陽性樣品進行單一PCR擴增，回收產(chǎn)物，分別與pMD18-T載體連接，構建陽性模板質(zhì)粒，并測序驗證擴增序列的準確性。用超微量核酸蛋白分析儀測定質(zhì)粒濃度，計算模板質(zhì)粒拷貝數(shù)，10倍稀釋后進行雙重PCR測定，同時設定陰性對照。

1.8 重復性試驗以構建的陽性質(zhì)粒為模板，用本研究建立的雙重PCR方法每隔一周重復檢測1次，連續(xù)檢測3次，確定檢測結果的可靠性和重復性。

1.9 應用性試驗利用本研究所建立的BNoV和BKoV單一及雙重PCR檢測方法對河南不同地區(qū)的127份糞便樣本進行檢測，比較檢測結果的一致性，并將擴增產(chǎn)物進行測序分析，評估該方法的實用性。

2 結果

2.1 雙重PCR擴增結果分別以BNoV和BKoV單一cDNA和混合cDNA為模板，用建立的雙重PCR同時擴增，以ddH2O做陰性對照。結果顯示，單一PCR分別擴增出約216 bp和542 bp的單一特異性條帶，雙重PCR可擴增出216 bp和542 bp特異性條帶，均與預期目的條帶大小一致（圖1）。

圖1 BNoV、BKoV 的雙重和單一PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 The duplex and single PCR products of BNoV, BKoV

2.2 特異性試驗分別以BNoV和 BKoV的單一cDNA和混合cDNA為模板，BCoV、BAstV、BRV、BVDV、BNeV的cDNA為模板，用建立的方法進行雙重PCR擴增。結果顯示，僅BKoV和BNoV能擴出特異性條帶，且與目的片段大小一致，其他病毒均未擴增出條帶（圖2）。

圖2 雙重PCR 的特異性試驗Fig.2 Specificity of the duplex PCR for BKoV and BNoV

2.3 敏感性試驗以BNoV和 BKoV的混合質(zhì)粒10倍稀釋后作為模板，進行雙重PCR擴增。結果顯示，BKoV最低檢測限為2.23×106copies/μL，BNoV最低檢測量為5.39×105copies/μL（圖3）。

圖3 雙重PCR 的敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of duplex PCR

2.4 應用性檢測用建立的雙重和單一PCR檢測方法對河南地區(qū)127份犢牛腹瀉糞便樣品進行檢測。結果顯示，雙重PCR方法可以從糞便中特異性地檢測出BKoV和 BNoV。將單一和雙重PCR的檢測結果進行比較（表2），127份糞便樣品中，檢出BNoV陽性樣品8份，陽性率為6.30%；BKoV陽性樣品6份，陽性率為4.72%；共感染BKoV和 BNoV的陽性樣品2份，陽性率為1.57%；單一和雙重PCR的檢測結果一致，符合率為100%。

2.5 重復性試驗利用建立的雙重PCR方法，以BNoV和BKoV的混合質(zhì)粒為模板，每隔1周重復檢測1次，連續(xù)檢測3次，結果一致。表明該雙重PCR方法具有較好的重復性。

表2 臨床樣品的檢測結果Table 2 The detection of clinical samples

3 討論

被BNoV和BKoV感染的犢牛，臨床上均會表現(xiàn)出腹瀉癥狀，剖檢時腸道病變較為相似，且兩者有時會出現(xiàn)混合感染，故僅靠臨床診斷容易造成誤診，妨礙疾病的防控和治療。傳統(tǒng)的病毒診斷方法有電鏡觀察、病毒分離鑒定、血清學實驗、抗原抗體ELISA檢測等，耗時耗力，對儀器設備要求高，實驗周期長，經(jīng)濟成本高；且BNoV目前尚無合適的細胞培養(yǎng)方法，BKoV也僅在Hela細胞上成功增殖且引起病變[8]。因此，傳統(tǒng)的診斷方法無法滿足臨床上樣品數(shù)量大、快速靈敏的檢測要求。PCR技術因其靈敏、快速、準確的優(yōu)點，是目前診斷病毒疾病最常用的方法，也是目前診斷BNoV和BKoV感染應用最廣泛的方法[6,12]。犢牛腹瀉會有幾種病毒混合感染的現(xiàn)象出現(xiàn)，僅依靠單一PCR，容易造成漏診，相較于單一PCR技術，多重PCR技術可在同一次擴增反應中檢測多種病原，大大節(jié)省檢測時間和成本，所以多重PCR技術非常適合于臨床樣品的檢測，對于疾病的確診及流行病學調(diào)查起到重要作用[13]。Sandro等[14]建立了能夠同時檢測諾如病毒基因群GⅠ、GⅡ、GⅢ的三重PCR檢測方法，該方法能夠在臨床及環(huán)境樣品中同時檢測出人諾如病毒和BNoV，同時該方法也是首次建立的檢測BNoV的PCR方法。本研究建立的BNoV和BKoV雙重PCR檢測方法，未檢測出其他能夠引起犢牛腹瀉的病毒性病原，特異性較好，且對BNoV和BKoV的最低檢測限分別為5.39×105copies/μL和2.23×106copies/μL，敏感性較高；應用該方法對河南地區(qū)127份糞便樣品檢測，與單一PCR結果相比，該方法的陽性檢出符合率為100%，表明所建立的雙重PCR檢測方法可用于臨床樣品的檢測。

應用本研究建立的雙重PCR檢測方法對河南部分地區(qū)127份奶牛及肉牛犢牛腹瀉糞便樣本進行檢測，其中BNoV陽性樣品8份（6.30%），BKoV陽性樣品6份（4.72%），兩者共感染的陽性樣品2份（1.57%）。目前，世界范圍內(nèi)引起犢牛腹瀉的病原主要有細菌、病毒、寄生蟲等，單一病原感染或混合病原共感染引起犢牛腹瀉的研究已成為科學家的研究熱點[15-18]。2017年，BNoV在我國首次被檢測 出[5]，其在我國的流行病學調(diào)查及與其他病原共感染情況目前國內(nèi)尚無報道。而BKoV在我國僅在新疆、內(nèi)蒙古、黑龍江和北京被檢測出，本研究首次報道了河南地區(qū)犢牛腹瀉樣品中BNoV和BKoV共感染的情況。

本研究建立的BNoV和BKoV雙重PCR檢測方法，能從糞便樣品中成功檢測出BNoV和BKoV，特異性好，可應用于BNoV和BKoV的流行病學調(diào)查，也為BNoV和BKoV的早期快速診斷奠定基礎。