范峻豪，趙洪哲，王 昊，張 靜，王鳳雪，溫永俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬黃病毒科、瘟病毒屬，為單股正鏈RNA病毒[1]，是引起牛呼吸道疾病、腸炎和免疫功能障礙的重要病原體。BVDV可以穿過(guò)胎盤并感染胎兒，導(dǎo)致母畜流產(chǎn)、胎兒先天畸形或持續(xù)感染（persistent infection，PI）牛的出生[2]。易感母畜在妊娠早期感染非致細(xì)胞病變的BVDV，并在妊娠早期變成病毒血癥，胎兒在其免疫系統(tǒng)成熟之前感染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生持續(xù)感染[3]。PI牛的BVDV抗體呈陰性，維持終身病毒血癥，并不斷將病毒傳播到環(huán)境中，成為病毒的主要儲(chǔ)存庫(kù)，PI牛是易感牛的主要傳播來(lái)源[4]。

5"-UTR（5"非翻譯區(qū)）在BVDV各毒株間高度保守，根據(jù)5"-UTR的差異將其分為BVDV-Ⅰ型和BVDV-Ⅱ型兩種基因型[5]，因此也常根據(jù)該區(qū)域?qū)VDV進(jìn)行鑒定。根據(jù)是否致細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），將BVDV分為致細(xì)胞病變型（CP型）和非致細(xì)胞病變型（NCP型）兩種生物型。而B(niǎo)VDV的持續(xù)感染主要由NCP型造成[6]，有研究表明細(xì)胞病變的程度不能決定病毒毒力，反而NCP型毒力更強(qiáng)，當(dāng)PI牛在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中被CP型BVDV超感染將會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的黏膜病[7]，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害。而牛血清在生物制品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，如果血清中有NCP型BVDV感染，科研人員培養(yǎng)的細(xì)胞甚至研發(fā)的疫苗都存在污染的可能，對(duì)生物制品行業(yè)有很大的安全隱患。

本研究對(duì)2017年從屠宰場(chǎng)采集的32份牛肺臟樣品進(jìn)行分離鑒定，分離到兩株可能為NCP型的BVDV-Ⅱ型毒株，命名為BVDV-HT1704、BVDVHT1723株。本研究對(duì)了解BVDV的流行情況、地理分布提供依據(jù)，并為疫苗的研發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和樣品來(lái)源BVDV-296陽(yáng)性毒株、MDBK細(xì)胞為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存，牛肺臟樣品采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市某屠宰場(chǎng)。

1.2 主要試劑2×Easy Taq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus、DNA Marker、dNTP、RRI、Random Primer、pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM、青鏈霉素混合液購(gòu)自Gibico公司；胎牛血清、馬血清購(gòu)自Hyclone公司；抗BVDV單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制；其他常規(guī)試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 樣品處理將采集的牛肺臟樣品剪碎置于研缽中，倒入液氮將組織研磨成粉末，加入5倍體積含1%工作濃度雙抗的DMEM培養(yǎng)基，充分研磨制成勻漿液，反復(fù)凍融3次，使病毒粒子完全釋放。4℃條件下，5 000 r/min離心10 min，吸取上清備用。

1.4 肺臟組織中BVDV基因組RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄參照RNAiso Plus試劑說(shuō)明提取肺臟組織中BVDV基因組的總RNA，并用12 μLDEPC水溶解后，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備其cDNA，以cDNA為模版擴(kuò)增BVDV的5"-UTR。反轉(zhuǎn)錄體系（25 μL）：總RNA 11 μL，Random Primer 2.0 μL混勻，70℃孵育10 min，冰浴5 min；再加入5× M-MLV buffer 5.0 μL、10 mmol/L dNTPs 5.0 μL、M-MLV 1.0 μL、RRI 1.0 μL，充分混勻后離心，置于42℃溫浴90 min，-20℃保存。

1.5 肺臟組織中BVDV的RT-PCR檢測(cè)利用本實(shí)驗(yàn)室建立的擴(kuò)增BVDV 5"-UTR的1對(duì)特異性鑒定引物，上游引物-F：5"-TAGCCATGCCCTTAGTAGGA C-3"；下游引物-R：5"-CTCCATGTGCCATGTACA GCA-3"，引物由吉林庫(kù)美生物公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，Rnase-Free ddH2O 9.5 μL，上、下游引物 （10 μmol/L）1.0 μL，cDNA模板 1.0 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性7 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸 10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。同時(shí)，將目的片段克隆至pMD19-T載體中，陽(yáng)性質(zhì)粒送由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.6 肺臟組織中BVDV培養(yǎng)及傳代復(fù)蘇MDBK細(xì)胞，用含8%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用于病毒接種。將研磨的組織上清經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，接種于單層處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的MDBK細(xì)胞，37℃感做2 h，補(bǔ)加含有2%馬血清、1%雙抗的細(xì)胞維持液，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變。盲傳5代后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性樣品繼續(xù)傳代，盲傳至10代后再進(jìn)行RTPCR檢測(cè)。

1.7 BVDV分離株免疫熒光檢測(cè)將盲傳10代的病毒接種于96孔板培養(yǎng)的單層MDBK細(xì)胞，接種3 d后使用4%多聚甲醛固定1 h，孵育FITC標(biāo)記的單克隆抗體（MAb）進(jìn)行直接免疫熒光試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)BVDV-296毒株陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.8 BVDV分離株5"-UTR遺傳進(jìn)化分析利用分子生物學(xué)軟件對(duì)分離株5"-UTR序列進(jìn)行分析，利用MEGA7.0軟件按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用1000 bootstrap進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果確定分離株的基因型。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Amplification of 5"-UTR fragment in BVDV

2 結(jié)果

2.1 肺臟組織中的BVDV RT-PCR鑒定結(jié)果將牛肺臟樣品RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到一條約為288 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1A）。對(duì)盲傳5代及10代的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果與肺臟樣品RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果一致（圖1B、C）。將擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，兩株分離株為BVDV，命名為BVDV-HT1704、BVDVHT1723株。

2.2 肺臟組織中的BVDV分離培養(yǎng)將RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的肺臟樣品接種于MDBK細(xì)胞后，每天觀察細(xì)胞病變，接種至第4 d未出現(xiàn)細(xì)胞病變，僅有部分細(xì)胞脫落、死亡，而貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)正常。陰性對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)正常，陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、細(xì)胞融合、呈拉網(wǎng)狀并形成空泡。表明分離到的病毒株可能為不導(dǎo)致細(xì)胞病變的NCP型BVDV病毒株。

2.3 分離株BVDV直接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果BVDV的RNA復(fù)制在細(xì)胞胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行，熒光顯微鏡下可在接種BVDV-296株和BVDV分離株的MDBK細(xì)胞胞漿中觀察到特異性熒光，而未接種病毒的正常細(xì)胞無(wú)熒光（圖2），表明能從肺臟組織中分離到BVDV。

2.4 BVDV5"-UTR遺傳進(jìn)化分析結(jié)果應(yīng)用BVDVHT1704、BVDV-HT1723株的5"-UTR序列與BVDV參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，所選毒株均為參考毒株和近年流行毒株。分析結(jié)果顯示，兩株分離株與美國(guó)分離的USMARC-60779和USMARC-60767兩株病毒進(jìn)化關(guān)系較為密切，同處于一獨(dú)立分支（圖3），表明分離株為BVDVⅡa型。其與USMARC-60767毒株的Bootstrap值為51%，表明兩分離株可能分屬于單一的分支，對(duì)該分離株的分析還有待于進(jìn)一步研究。

圖2 BVDV 分離株的直接免疫熒光鑒定Fig.2 Identification of BVDV isolates cultured in MDBK cells by DFA

3 討論

BVDV對(duì)任何年齡牛均易感，可造成嚴(yán)重的呼吸道系統(tǒng)疾病、生殖系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)紊亂及免疫抑制等。感染牛以發(fā)熱、腹瀉、黏膜潰瘍?yōu)橹饕R床癥狀，患病母牛出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎及胎兒畸形 等[8]。牛病毒性腹瀉病雖危害嚴(yán)重，但仍沒(méi)有引起人們對(duì)此病的足夠重視。近些年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)大型牛場(chǎng)的BVDV感染呈上升趨勢(shì)，有些牛場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率甚至在90%以上，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。我國(guó)尚未從分子水平上對(duì)BVDV分離株的基因型進(jìn)行明確定義，并且國(guó)內(nèi)BVDV-Ⅱ型流行現(xiàn)狀以及分離株特性不明確[10]，嚴(yán)重影響對(duì)該病的防控。

NCP型BVDV感染懷孕早期母畜，病毒可穿過(guò)胎盤引起胎兒感染，造成死胎、流產(chǎn)、免疫力低。感染母畜產(chǎn)下的正常胎兒將成為持續(xù)感染牛，是牛群中BVDV的主要傳染源。本研究從無(wú)臨床癥狀牛體內(nèi)采取無(wú)病理變化的肺臟組織，意在對(duì)BVDV非致細(xì)胞病變型的持續(xù)感染情況進(jìn)行調(diào)查。本研究首次從正常組織樣品中分離到BVDV-Ⅱa型NCP型毒株，說(shuō)明BVDV的持續(xù)感染情況在牧場(chǎng)中存在，如不針對(duì)持續(xù)感染牛進(jìn)行篩查，BVDV的流行情況將呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因此，應(yīng)該對(duì)該病的防控加以重視。根據(jù)近年來(lái)的流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，BVDV-Ⅰ型為我國(guó)主要流行毒株，而Ⅱ型毒株流行較少。進(jìn)化樹(shù)分析表明，分離株與美國(guó)分離株進(jìn)化關(guān)系較密切，與中國(guó)分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能是由于從國(guó)外引進(jìn)牛數(shù)量的增加促進(jìn)了BVDV在我國(guó)的傳播。BVDV診斷試劑及疫苗的研發(fā)是防控該病的主要手段，對(duì)持續(xù)感染牛的檢疫是防控該病的中心環(huán)節(jié)，撲殺持續(xù)感染牛、接種防疫疫苗并結(jié)合流行病學(xué)的檢測(cè)等措施的實(shí)施，定能將該病的發(fā)生限制在可接受的范圍內(nèi)，降低疾病發(fā)生帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

圖3 BVDV 分離株5"-UTR 基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on BVDV 5"-UTR