鄧 躍，譚菲菲，王 娟，常亞飛，陳喜波，王同燕，李向東，田克恭

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州410005；2.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng)471003；3.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽(yáng)471000）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱為“豬藍(lán)耳病”，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬傳染性疾病。該病毒為單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目（Nidovirales）、動(dòng)脈炎病毒科（Arteriviridae）、動(dòng)脈炎病毒屬（Arterivirus）[1]。PRRSV可以引起母豬繁殖障礙，主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，該病毒也會(huì)引發(fā)仔豬和生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)遲緩和呼吸系統(tǒng)疾病[2-3]。該病最早于1987被美國(guó)報(bào)道，隨后許多國(guó)家也相繼報(bào)道了該病。PRRSV主要包括以VR2332毒株為代表的美洲型和以Lelystand virus（LV）為代表的歐洲型2種基因型[4-5]。PRRSV存在很大的遺傳差異性，2006年5月，我國(guó)江西省爆發(fā)高致病性PRRS（HPPRRS），與經(jīng)典的PRRSV相比，該致病病毒的NSP2區(qū)域存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失[6]；2008年，美國(guó)報(bào)道了一株在Nsp2基因上存在131個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失的PRRSV新毒株，命名為NADC30[7]；2013年，周峰等[8]在對(duì)河南省PRRSV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)了與美國(guó)NADC30同源性較高的毒株，由于這類毒株與NADC30遺傳關(guān)系較近，國(guó)內(nèi)現(xiàn)將該類病毒統(tǒng)稱為類NADC30毒株（NADC30-Like）。至今，我國(guó)北京市、天津市、河北省、河南省、山東省、吉林省、江蘇省、浙江省、福建省、四川省、湖北省、廣東省等地，均有類NADC30毒株檢出，且陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。

2015年，Zhao等[9]報(bào)道了一株NADC30與HPPRRSV重組病毒株，命名為JL580，該毒株被證實(shí)具有較強(qiáng)的致病性。2016年，Sun等[10]報(bào)道的HNjz15為類NADC30毒株，毒力中等。目前商品化的疫苗主要是針對(duì)經(jīng)典PRRSV和HP-PRRSV兩類，Bai等[11]建立了類NADC30 PRRSV在豬體的致病模型，并評(píng)價(jià)了我國(guó)5種PRRSV商品化疫苗，證明現(xiàn)有疫苗不能對(duì)類NADC30 PRRSV毒株提供完全保護(hù)力，因此，類NADC30毒株的分離工作意義重大。本研究旨在用PAM細(xì)胞分離類NADC30 PRRSV毒株，為研究其重組機(jī)制、致病情況及預(yù)防疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料與細(xì)胞編號(hào)171347-1的病料采自河南省洛陽(yáng)市某豬場(chǎng)一頭疑似感染PRRSV母豬流產(chǎn)胎兒的肺組織；編號(hào)180411-12的病料采自河南省鶴壁市某豬場(chǎng)一頭疑似感染PRRSV母豬流產(chǎn)胎兒的肺組織。PAM細(xì)胞為國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備凍存。

1.2 試驗(yàn)試劑2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生化技(北京)有限公司；dNTP Mix、M-MLV Reverse Trabscriptase、Ribonuclease Inhibitor購(gòu)自Promega公司；Viral Nucleic Acid Extraction Kit購(gòu)自Geneaid公司；RPMI-1640培養(yǎng)基干粉購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；鼠源PRRSV單克隆抗體購(gòu)自VMRD公司；FITC羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Nuaire公司；Veriti 9902梯度PCR儀購(gòu)自ABI公司；核酸電泳儀購(gòu)自美國(guó)Hoefer公司；JY04S-3B凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；倒置顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)根據(jù)PRRSV美洲型毒株VR-2332（GenBank登錄號(hào)：AY150564），設(shè)計(jì)引物P-F/P-R用于鑒定樣品是否為PRRSV陽(yáng)性，上游引物P-F：5"-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3"；下游引物P-R：5"- GTCGCCCTAATTGAATAGGTG AC-3"。參考PRRSV NADC30株（GenBank登錄號(hào)：JN654459）針對(duì)NSP2高變區(qū)設(shè)計(jì)引物N-F/N-R用于對(duì)樣品進(jìn)行分型，上游引物N-F：5"-CTTTGATTGGGATGTTGTGCT-3"；N-R下游引物：5"-CAATGATGGCTTGAGCTGAGT-3"。以上引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5 PRRSV鑒定分型PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s （鑒定）/70 s（分型），共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min；25℃保存[12]。用P-F/P-R引物對(duì)病料進(jìn)行鑒定，若擴(kuò)增出436 bp的特異性片段，即可初步判斷為PRRSV陽(yáng)性；用N-F/N-R引物對(duì)病料進(jìn)行分型，若擴(kuò)增出681 bp的特異性片段，可以判斷該毒株為類NADC30 PRRSV毒株；若擴(kuò)增出984 bp的特異性片段，可以判斷該毒株為HP-PRRSV毒株；若擴(kuò)增出1074 bp的特異性片段，可以判斷該毒株為經(jīng)典PRRSV毒株[13]。

1.6 病料處理在病變組織與正常組織交界處取下約3 g組織樣品研磨，于-80℃凍融3次，4℃、10 000×g離心10 min，于超凈工作臺(tái)中用0.22 μm的濾器過(guò)濾上清，并分裝至1.5 mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 豬PAM細(xì)胞制備選取豬圓環(huán)病毒抗原陰性，PRRSV抗原、抗體陰性的30～40日齡健康仔豬，采取豬腋下動(dòng)脈叢盡快放血致死，剖開(kāi)胸腔，連同心臟取出完整的肺臟，用無(wú)菌生理鹽水充分漂洗肺臟表面，清除血塊、污物，浸泡于滅菌生理鹽水中。于超凈臺(tái)中，將肺臟放于滅菌搪瓷盤，剪去喉頭，紗布條包裹氣管口后用止血鉗固定。用10 mL彎頭吸管從氣管往肺臟注入RPMI-1640培養(yǎng)基約150～ 200 mL，輕輕拍打肺臟表面，1～2 min后回收灌洗液。將灌洗液從氣管口倒入無(wú)菌的100目鋼篩，經(jīng)漏斗濾入500 mL藍(lán)蓋瓶中，同上方法重復(fù)灌洗3～4次，回收灌洗液。將全部灌洗液混勻后分裝于50 mL離心管中（40 mL/管），100×g離心5 min，用吸管輕輕吸取上清，留5 mL左右液體。輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞沉淀懸起，用彎頭吸管輕柔吹散細(xì)胞，每管補(bǔ)加RPMI-1640培養(yǎng)基至40 mL，100×g離心5 min，用吸管輕輕吸棄所有上清。每管加入含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基5 mL，輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞沉淀懸起，用彎頭吸管輕柔吹散細(xì)胞，將所有細(xì)胞混合為1管，混勻后取樣，20～50倍稀釋后計(jì)數(shù)。剩余細(xì)胞100×g離心5 min，吸管吸棄所有上清。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按1.5×107cells/mL量，將預(yù)先配好的凍存液逐滴加入細(xì)胞沉淀中，輕輕晃動(dòng)離心管使細(xì)胞沉淀懸起，用吸管輕柔吹打混勻后，1 mL/管分裝于凍存管中，標(biāo)記細(xì)胞名稱、豬只日齡、制備日期，封口膜封口后置細(xì)胞凍存盒中，-80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存。

1.8 病毒分離與傳代接種1 mL病料上清液于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PAM細(xì)胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，期間每隔15～20 min輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使吸附均勻，之后棄去接種液，并用PBS清洗細(xì)胞一次。補(bǔ)加5 mL含4%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，逐天觀察直至細(xì)胞出現(xiàn)脫落、破碎等病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）達(dá)80%，即可收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，并于-80℃保存?zhèn)溆?。病料接種細(xì)胞后無(wú)論有無(wú)細(xì)胞病變，均需進(jìn)行傳代。將P1代的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融1次后取500 μL接種至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PAM細(xì)胞，并取200 μL細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，采用相同的方法連續(xù)傳代3次。

1.9 間接免疫熒光試驗(yàn)將PAM細(xì)胞每孔500 μL接種于24孔板中，接種密度為1×106個(gè)/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，將P3代收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物50倍稀釋后，取200 μL接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PAM細(xì)胞，對(duì)照組接入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱種吸附1 h，期間每隔15～20 min輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，使吸附均勻，之后棄去接種液，并用PBS清洗細(xì)胞1次；補(bǔ)加500 μL含4%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基全部棄去，每孔加入500 μL的PBS（pH7.2）清洗3次；再用提前預(yù)冷的80%丙酮于4℃固定30 min后，棄去丙酮，PBS（pH7.2）清洗3次；每孔加入200 μL的PRRSV單抗（1∶500稀釋），37℃孵育1 h，棄去上清， PBS（pH7.2）清洗3次；每孔加入200 μL的FITC羊抗鼠IgG二抗（1∶1000稀釋，避光操作），37℃孵育1 h，PBS（pH7.2）清洗3次后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR鑒定分型結(jié)果P-F/P-R引物對(duì)樣品的RT-PCR鑒定結(jié)果顯示，兩份病料均含有PRRSV（圖1），N-F/N-R引物RT-PCR分型結(jié)果顯示，兩份病料含有的PRRSV為NADC30 PRRSV（圖2）。

2.2 病毒分離結(jié)果將病料上清接種PAM細(xì)胞后連續(xù)傳代3次。結(jié)果顯示，在每次傳代過(guò)程中，對(duì)照組PAM細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其余2組PAM細(xì)胞分別接種171347-1和180411-12病料上清，72 h后，均出現(xiàn)明顯CPE（圖3）。

對(duì)盲傳3代收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物用P-F/P-R引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，均為PRRSV陽(yáng)性（圖4）；用N-F/ N-R引物RT-PCR分型，結(jié)果顯示，均為NADC30-like PRRSV陽(yáng)性（圖5）。

圖1 PRRSV 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification result of PRRSV

圖2 PRRSV 分型結(jié)果Fig.2 Classification result of PRRSV

圖3 P3 PAM 細(xì)胞病變Fig.3 Cytopathy of P3 PAM

圖4 P1、P2、P3 PRRSV 鑒定結(jié)果Fig.4 Identification results of P1, P2 and P3 PRRSV

2.3 間接免疫熒光結(jié)果將傳代3次后的細(xì)胞培養(yǎng)物接種PAM細(xì)胞，用PRRSV單抗和FITC羊抗鼠IgG二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示，接種P3細(xì)胞培養(yǎng)物的PAM細(xì)胞出現(xiàn)黃綠色特異性熒光，而對(duì)照組PAM 細(xì)胞未觀察到熒光（圖6）。

3 討論

PRRSV具有嚴(yán)格的宿主范圍，在豬體內(nèi)，人們最早發(fā)現(xiàn)其能在PAM細(xì)胞中生長(zhǎng)[14]，后來(lái)實(shí)驗(yàn)證明病毒感染公豬之后還能在公豬的睪丸細(xì)胞和精母細(xì)胞中生長(zhǎng)。在豬體外，PRRSV能夠在非洲綠猴腎傳代細(xì)胞CL2621、MA104及其克隆株MARC-145細(xì)胞中增殖[15]。通常，MARC-145細(xì)胞優(yōu)先用于PRRSV的分離和鑒定，但并非所有PRRSV毒株都可以在MARC-145細(xì)胞上增殖。研究表明，大多數(shù)歐洲毒株P(guān)RRSV主要在PAM上分離和培養(yǎng)，而對(duì)于PRRSV美洲型毒株，HP-PRRSV能在感染MARC-145細(xì)胞后快速產(chǎn)生CPE。

圖5 P1、P2、P3 PRRSV 分型結(jié)果Fig.5 Classification results of P1, P2 and P3 PRRSV

圖6 PRRSV 間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.6 IFA results of PRRSV

PAM細(xì)胞是PRRSV重要的靶細(xì)胞，PRRSV在PAM上增殖快，CPE出現(xiàn)較早（1～4 d），主要表現(xiàn)為細(xì)胞崩解、脫落；但是在CL2621及MARC-145上CPE出現(xiàn)較慢，主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、聚集、最后崩解脫落。雖然PRRSV對(duì)PAM細(xì)胞具有較高的親嗜性，但是由于PAM細(xì)胞制備成本較高且技術(shù)復(fù)雜，并且日齡及個(gè)體差異都會(huì)影響所制備細(xì)胞對(duì)PRRSV的敏感性。大多數(shù)PRRSV都對(duì)MARC-145細(xì)胞具有較高的敏感性，且病變明顯，成本適宜，因此MARC-145細(xì)胞在PRRSV流行毒株的分離鑒定及致病性等方面有更為廣泛的應(yīng)用。

自2013年起，我國(guó)分離到的類NADC30 PRRSV毒株，部分毒株能在MARC-145上增殖，而部分無(wú)CPE。張紅亮[16]等對(duì)17株類NADC30進(jìn)行全基因進(jìn)化分析并對(duì)毒株進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，17株毒株中通過(guò)感染MARC-145細(xì)胞進(jìn)行分離，僅有2株存在明顯的CPE。張玉嬌等[17]在PRRSV感染PAM細(xì)胞后膜蛋白表達(dá)差異的研究中發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)弱毒株在感染PAM細(xì)胞效率上存在差異，且細(xì)胞膜上的載脂蛋白C-Ⅱ（Apolipoprotein C-II）和Clusterin能夠促進(jìn)PRRSV的復(fù)制，在MARC-145細(xì)胞上也得到了相似的結(jié)果。Yang等[18]也在研究中指出，細(xì)胞膜和病毒包膜的脂筏結(jié)構(gòu)域?qū)RRSV的有效感染至關(guān)重要，脂筏結(jié)構(gòu)域富含膽固醇和鞘磷酸酯，而Apolipoprotein C-II對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的運(yùn)輸十分關(guān)鍵。高飛等[19]的研究表明，PRRSV的5"非翻譯區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)病毒的復(fù)制等生物合成過(guò)程至關(guān)重要。由此可見(jiàn)，類NADC30毒株在MARC-145和PAM細(xì)胞上的嗜性可能與類NADC30毒株本身的脂筏結(jié)構(gòu)域以及靶細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)效率相關(guān)。本研究通過(guò)PAM細(xì)胞對(duì)2株類NADC30毒株進(jìn)行分離并感染PAM后，均觀察到CPE；通過(guò)RT-PCR以及IFA對(duì)分離到的毒株進(jìn)行鑒定檢測(cè)，結(jié)果顯示，2株分離毒株為類NADC30 PRRSV毒株。