喬永峰，郭容利，宋增財，劉婭梅，許夢微，鄭亞婷，陳賽賽，王志勝，張傳健，侯繼波，范紅結(jié)，王繼春

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；4.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；5.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京 210014）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引發(fā)的一種急性傳染病，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一[1-2]，成年豬常為隱性感染，有時也出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀等，妊娠母豬常發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎；公豬出現(xiàn)繁殖障礙；新生仔豬表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)癥狀，伴隨大量死亡[1]。自2011年以來，我國許多豬場爆發(fā)了新的豬偽狂犬病疫情[3-6]，造成了巨大的經(jīng)濟損失，研究表明新的流行毒株毒力更高，傳染力更強[7]，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展帶來了新的挑戰(zhàn)。

PRV屬于皰疹病毒科、甲型皰疹病毒亞科，基因組為雙鏈線狀DNA，可以在感染動物體內(nèi)形成持續(xù)感染，并終身攜帶病毒[4]。非必需衣殼蛋白與PRV毒力相關(guān)，主要為gE、gI、gC糖蛋白[8]，因此，通常缺失gE、gG等非必需基因，可使PRV毒力減弱而成為基因工程疫苗株[9]。隨著豬偽狂犬病基因缺失疫苗配合相應(yīng)的抗體鑒別診斷試劑盒的廣泛使用，使得可以在臨床上區(qū)分疫苗免疫動物和野毒感染動物。歐美許多國家應(yīng)用gE基因缺失活疫苗，并配合gE抗體ELISA鑒別診斷方法成功的凈化了豬偽狂犬病。但Bartha-K61弱毒疫苗或其他基因缺失滅活苗，對當(dāng)前我國流行毒株不能提供完全地保 護[10-12]，因此研制新型豬偽狂犬病疫苗是控制我國變異株流行的關(guān)鍵。本研究分離獲得一株P(guān)RV變異株（PRV AH02LA株）[7]，以該毒株為母本，采取基因工程技術(shù)缺失了部分gE基因獲得LA-A株，接種BHK-21細(xì)胞，經(jīng)純懸浮培養(yǎng)，甲醛滅活后制成油乳劑疫苗。并檢測了該滅活疫苗的有效保存期、不同劑量的免疫效力，以及1次免疫和2次免疫對PRV陰性仔豬的免疫效力，為新型疫苗的研制提供了重要試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑豬偽狂犬病病毒gE基因缺失滅活疫苗（LA-A株，批號201403-1）由本實驗室制備；偽狂犬病病毒AH02LA株（批號20121225）由本實驗室分離、鑒定，病毒含量為107.0TCID50/ mL；BHK-21細(xì)胞購自ATCC；新生牛血清、胰酶和DMEM購自Gibco公司；gB和gE抗體檢測試劑盒購自美國愛德士（IDEXX）公司；試驗用4～5周齡PRV陰性健康仔豬購自江蘇省句容市養(yǎng)殖戶，種豬與仔豬均未進(jìn)行豬偽狂犬疫苗免疫，血清中g(shù)B、gE抗體均為陰性。

1.2 疫苗制備將PRV LA-A株種毒接種于新鮮制備的BHK-21細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h后收獲，取樣做病毒含量檢測。將收獲的抗原稀釋至107.50TCID50/0.1 mL，以終濃度0.15%加入甲醛溶液，于37℃滅活24 h，經(jīng)滅活檢驗合格后，以水相：油相=1∶3的比例制成油包水型疫苗。依據(jù)現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》進(jìn)行性狀和無菌檢查，檢查合格后備用。

1.3 免疫效力試驗選取4～5周齡，PRV抗體陰性健康仔豬55頭，隨機分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11組，每組5頭。A、B、C、D組分別以1.0、2.0、3.0和4.0 mL/頭肌肉注射，E組不免疫作為對照組。首免間隔28 d后對A、B、C、D、E組試驗豬均按106.5TCID50、2.0 mL/頭進(jìn)行滴鼻接種PRV AH02LA株，攻毒后觀察14 d。F、G、H、I組分別以0.5、1.0、1.5和2.0 mL/頭肌肉注射，并在28 d后進(jìn)行加強免疫，J組不免疫作為對照組。加強免疫21 d后對F、G、H、I和J組試驗豬均按106.50TCID50、2.0 mL/頭進(jìn)行滴鼻接種PRV AH02LA株，攻毒后觀察14 d。K組做空白對照組，全程不進(jìn)行免疫與攻毒（表1）。

表1 免疫效力試驗分組情況Table 1 The summary of immunization schedule and dosage in different groups

1.4 PRV抗體檢測分別在首免前1 d，首免后7、14、21、28 d，二免后7、14、21 d和攻毒后14 d對試驗豬進(jìn)行前腔靜脈采血，分離血清后置-20℃保存。對試驗前仔豬進(jìn)行PRV gB抗體檢測，攻毒前后的仔豬血清進(jìn)行PRV gE抗體檢測，并對血清PRV中和抗體進(jìn)行檢測，取初次免疫及加強免疫后所有血清樣品，經(jīng)56℃滅活30 min后，按固定血清稀釋病毒法檢測，計算中和指數(shù)。使用毒株為PRV AH02LA株。

1.5 臨床癥狀觀察攻毒后連續(xù)14 d每日觀察，同時產(chǎn)生以下兩項則判為發(fā)病：一、觀察期內(nèi)發(fā)生死亡，或出現(xiàn)體溫升高至41℃以上的時間不少于3 d；二、觀察期內(nèi)出現(xiàn)精神萎靡不振和食欲廢絕等全身癥狀，或出現(xiàn)腹式呼吸、流粘性鼻涕等呼吸系統(tǒng)癥狀，或出現(xiàn)肌肉僵硬、發(fā)抖、頭頸歪斜、眼神呆滯和運動失調(diào)等神經(jīng)癥狀；若不發(fā)生死亡且不出現(xiàn)后者癥狀則判為保護。

1.6 疫苗保存期檢驗取實驗室制備豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）201403-1批次，置2～8℃保存（100瓶），分別于第6、9、12、18和21個月取樣進(jìn)行如下檢測：

1.6.1 外觀 眼觀疫苗的狀態(tài)。

這是《戰(zhàn)斗宣言》中的一句唱詞，在西媒報道中引起廣泛爭議的正是配唱部分中“殺殺殺”的翻譯。在作為研究對象的九篇西媒報道中，有三篇以“kill,kill,kill”或“waiting for order to kill”作為大字標(biāo)題（Boeen 2016;Conner 2016;The Guardian 2016），占據(jù)相當(dāng)大的版面，給讀者以強烈的視覺沖擊，讓人感覺觸目驚心，仿佛解放軍是一支本性嗜殺的軍隊，正在以殺戮作為賣點去招募新兵。新聞報道的負(fù)面性價值也因此得以實現(xiàn)。

1.6.2 劑型 取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，觀察疫苗擴散情況。

1.6.3 穩(wěn)定性 取疫苗10 mL，1409×g離心15 min，記錄管底析出的水相情況。

1.6.4 黏度 旋轉(zhuǎn)式黏度計測定法。

1.6.5 無菌檢驗 依據(jù)現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗。取疫苗樣品接種T.G小管、G.A斜面各2支，每支0.2 mL，1支置37℃恒溫箱培養(yǎng)，1支置25℃恒溫箱培養(yǎng)；另取0.2 mL，接種1支G.P小管，均置25℃恒溫箱培養(yǎng)7 d，應(yīng)無菌生長；或者取混合后的血清1.0 mL，接種50 mLT.G培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱培養(yǎng)，3 d后吸取培養(yǎng)物，接種TG小管2支，每支0.2 mL，1支置37℃恒溫箱培養(yǎng)，1支置25℃恒溫箱培養(yǎng)，另取0.2 mL，接種1支TSB小管，均置25℃恒溫箱培養(yǎng)7 d，應(yīng)無菌生長。

1.6.6 甲醛含量測定 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.5 mL，分別加醋酸-醋酸銨緩沖液10.0 mL， 乙酰丙酮試液10.0 mL，置60℃恒溫水浴15 min，冷水冷卻5 min，放置20 min后，在410 nm的波長處測定吸收度，甲醛溶液（40%）含量%（g/mL）=0.25×（供試品溶液的吸光度/對照品溶液的吸收度）%，經(jīng)此公式計算，即得。

1.6.7 安全檢驗 每批疫苗選用28～35日齡的PRV陰性仔豬5頭，肌肉注射疫苗4 mL/頭，每日觀察精神狀態(tài)、采食、飲水、糞便等，并每日定時測定體溫。連續(xù)觀察14 d。

1.6.8 效力檢驗 選用28～35日齡的健康PRV陰性仔豬10頭，隨機分為2組，每組5頭，其中一組為免疫組，另一組為對照組。免疫組頸部肌肉注射疫苗2.0 ml/頭，首免后2.0 ml/頭第28 d加強免疫1次；對照組不接種。2免后第21 d采集血清檢測PRV抗體中和指數(shù)，并與攻毒對照組滴鼻PRV強毒AH02LA株 2.0 ml/頭（含106.50TCID50），隔離飼養(yǎng)，攻毒后連續(xù)14 d觀察試驗豬體溫和臨床癥狀，攻毒后14 d進(jìn)行剖檢，觀察肺臟組織病變。

2 結(jié)果

2.1 免疫效力試驗首次免疫和2次免疫后，所有豬精神、飲食均正常，未見異常反應(yīng)，且攻毒前對所有仔豬血清進(jìn)行PRV gE抗體檢測，結(jié)果顯示均為陰性；攻毒后PRV gE抗體檢測全部陽性。接種 1.0 mL組28 d后血清PRV抗體中和指數(shù)在316～1000；接種2.0 mL組中和指數(shù)為1738～7079；接種3.0 mL組中和指數(shù)為10 000～31 623，相比2.0 mL組有顯著升高；而接種4.0 mL組中和指數(shù)為10 000～43 652，與3.0 mL組無較大差別。兩次免疫組中，免疫劑量為0.5 mL時，中和指數(shù)為1738～10 000；免疫劑量為 1.0 mL時，中和指數(shù)為10 000～43 652，較0.5 mL組明顯升高；免疫劑量為1.5 mL時，中和指數(shù)為 43 652～100 000；免疫劑量為2.0 mL時，中和指數(shù)為43 652～131 826?？瞻讓φ战M血清抗體中和指數(shù)全部低于20（圖1、圖2）。

A、B、C、D、E組于首次免疫后28 d進(jìn)行攻毒，攻毒后第3 d開始有臨床癥狀，且A組有2頭仔豬發(fā)病后死亡，3頭只發(fā)病不死亡；B組有1頭仔豬死亡；C組有4頭仔豬發(fā)病，1頭正常；D組有3頭仔豬發(fā)病，2頭正常；E組仔豬全部發(fā)病，其中有3頭死亡。F、G、H、I、J組于加強免疫21 d后進(jìn)行攻毒，攻毒后F組3頭仔豬發(fā)病，2頭仔豬正常；G組1頭仔豬有臨床癥狀，其余4頭表現(xiàn)正常；H、I組所有仔豬無臨床癥狀，表現(xiàn)正常；I組全部有臨床癥狀，且在第3 d死亡1頭，第4 d死亡2頭（表2）。

圖1 1 次免疫組免疫后28 d 中和指數(shù)Fig.1 Neutralization index in pigs with 1 vaccination (groups A, B, C and D) between day 1 and day 28 after immunization

圖2 2 次免疫組接種后49 d 中和指數(shù)Fig.2 Neutralization index in pigs with 2 vaccinations (groups F, G, H and I) between day 1 and day 49 after immunization

2.2 疫苗保存期

2.2.1 性狀檢查 豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）在2～8℃保存6、9、12、18和21個月后，性狀外觀均為乳白色乳劑，劑型為油包水型；取10.0 mL疫苗，以1 409×g離心15 min，管底析出的水相均≤0.2 mL；粘度均在30～39 cP范圍內(nèi)（表3）。

2.2.2 無菌檢驗 豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）在2～8℃保存6、9、12、18和21個月均無細(xì)菌或霉菌污染（表4）。

2.2.3 安全性檢驗 豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）在2～8℃保存6、9、12、18和21個月，接種后無過敏反應(yīng)，14 d內(nèi)試驗豬全部健活，每日精神狀態(tài)良好，飲食、排糞、體溫均正常，無不良反應(yīng)。

2.2.4 甲醛含量測定 豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）在2～8℃保存6、9、12、18和21個月，甲醛含量測定結(jié)果分別為0.023%、0.023%、0.024%、0.022%和0.023%，均符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.5 效力檢驗 豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）在2～8℃保存6、9、12、18和21個月，免疫仔豬加強免疫后21 d PRV抗體中和指數(shù)均不小于10 000，對照組均小于20（表5）；攻毒后，免疫組攻毒保護率均為5/5或4/5，攻毒對照組5/5發(fā)病并至少3/5死亡（表6）。攻毒發(fā)病豬剖檢肺臟出血、淤血明顯，免疫保護豬肺臟無明顯病變。

表2 攻毒前后的仔豬臨床癥狀結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Comparison of protection efficacy in different vaccination groups

表3 2～8℃不同保存時間性狀檢驗結(jié)果Table 3 Characteristics of PRV LA-A vaccines after different preservation periods at 2～8℃

表4 2～8℃保存不同時間無菌檢驗結(jié)果Table 4 Sterility test results of PRV LA-A vaccines after different preservation periods at 2～8℃

表5 不同批次、不同保存時間疫苗免疫豬中和抗體檢測結(jié)果Table 5 Neutralization index of vaccines after different preservation periods at 2～8℃

表6 不同批次、不同保存時間攻毒保護結(jié)果Table 6 Protection efficacy of PRV LA-A vaccines after different preservation periods at 2～8℃

3 討論

PRV可感染多種動物，包括家畜、寵物和野生動物等，但感染PRV發(fā)病后僅有豬可以存活，其他反芻動物、嚙齒動物、食肉動物等易感動物幾乎100%死亡[1,13]。健康豬可通過與病豬、帶毒豬接觸而感染，感染豬可通過鼻分泌物、唾液、乳汁等向外界排毒，給豬偽狂犬病的控制帶來了困難。2011年后，我國多個省份爆發(fā)了由豬偽狂犬病毒變異株引起的新的豬偽狂犬病疫情[5,14]。與2011年前病毒基因相比，PRV流行毒株的保護性抗原gB、gC和gD均發(fā)生了片段缺失或插入等明顯的基因突變[15-17]。 Ye等[18]首次將偽狂犬病病毒分為2種基因型，中國現(xiàn)流行的毒株如HeN1株為基因Ⅱ型，而其他毒株如Bartha株為基因Ⅰ型。這一結(jié)論很好的解釋了Bartha-61疫苗對目前中國流行株不能產(chǎn)生良好保護的原因，也同時說明需要一種針對基因Ⅱ型的疫苗。

本研究從發(fā)病豬場的流產(chǎn)仔豬腦組織中成功分離到一株偽狂犬病毒變異株，命名為PRV AH02LA株。該分離株在BHK-21細(xì)胞上有很強的增殖能力，最高滴度可達(dá)109.0TCID50/ mL[7]，其gD基因和gI基因與PRV經(jīng)典株（Bartha、Kaplan和Becker等[16]） 同源性低，與2011年后分離的TJ、ZJ01變異株同源性高（99.5%～100%）。為控制PRV變異株的流行，同時為鑒別自然感染與疫苗免疫，本實驗室利用基因工程技術(shù)將其gE基因敲除后制成油佐劑滅活苗，命名為豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）。

本研究對豬偽狂犬病病毒基因缺失滅活疫苗（LA-A株）進(jìn)行了1次免疫和2次免疫的保護效力試驗，以及最小免疫劑量的測定，并對其在2～8℃條件下的保存期進(jìn)行了6、9、12、18和21個月的檢測。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，仔豬血清中PRV抗體中和指數(shù)隨免疫劑量增大而增加，攻毒后的臨床癥狀也隨之減弱。1次免疫組中，4.0 mL劑量免疫組保護率最高僅達(dá)40%；2次免疫組中，1.0 mL劑量免疫組保護率可達(dá)80%，1.5 mL和2.0 mL劑量免疫組保護率亦均可達(dá)100%。同時，本研究確定了該疫苗制品的最小免疫劑量，以1.0 mL對4～5周齡健康陰性仔豬進(jìn)行初次免疫，并在28 d后進(jìn)行加強免疫可以達(dá)到良好的免疫保護效果，且在2～8℃條件下可穩(wěn)定保存21個月。該疫苗的研制對控制PRV變異株的流行有重要作用。

要對PRV變異株的流行達(dá)到有效控制，對豬場進(jìn)行偽狂犬病的凈化，僅僅對易感動物進(jìn)行疫苗免疫是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。首先，應(yīng)清除傳染源和切斷傳播途徑，加強飼養(yǎng)管理；其次，選擇全進(jìn)全出的飼養(yǎng)模式，做好生物安全，及時淘汰陽性豬群等；疫苗免疫是最后一道防線。以上才是實現(xiàn)偽狂犬病凈化的正確方向。