孫明杰，崔 斌，陳 雷，王麗榮，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑省級重點(diǎn)實驗室，泰安 271000）

臨床上對于動物真菌性皮膚病的治療藥物多采用激素、抗生素、抗真菌類西藥，這些藥物存在副作用大，長期使用容易產(chǎn)生耐藥等缺點(diǎn)，從高效低毒、抗菌譜和耐藥性等方面評價尚不能令人滿意。我國古代文獻(xiàn)中記載大量治癬方，如《外科啟玄》中的“鵝掌風(fēng)方”，《外科正宗》中的“枯礬散”，《洞天奧旨》的“菊粉散”、“熊脂膏方”等[9]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)300余種中藥具有抗真菌活性，從中草藥中尋找抗真菌新藥已成為近年來非常重要的研究方向。迄今為止，利用中藥復(fù)方噴劑治療須癬毛癬菌導(dǎo)致的皮膚真菌病還鮮有報道。

為開發(fā)治療兔須癬毛癬菌病的中藥新產(chǎn)品，本研究應(yīng)用分子生物學(xué)方法，并結(jié)合形態(tài)觀察、生化試驗，對兔須癬毛癬菌進(jìn)行分離鑒定；篩選配制中藥復(fù)方噴劑，并對其治療效果進(jìn)行對比研究。結(jié)果顯示，該中藥復(fù)方噴劑對兔須癬毛癬菌病具有較好療效。本研究制備的中藥復(fù)方噴劑對兔須癬毛癬菌病的治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料病料采自河北省保定市某兔場病兔患處的皮屑、痂皮和被毛。

1.2 試劑與中藥TaqDNA聚合酶（5 IU/μL）、2×PCR Master Mix、DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；陳皮、蒼術(shù)、青蒿、薄荷、板藍(lán)根、烏梅、姜黃、馬齒莧、黃連、五倍子購于山東省泰安市永春堂藥業(yè)有限公司；達(dá)克寧乳膏購自西安楊森制藥有限公司；分離培養(yǎng)基為沙氏培養(yǎng)基（SDA），配制方法：葡萄糖4%、蛋白胨1%、瓊脂2%。

1.3 病料的采集和處理使用75%酒精對病兔患處消毒后，用鑷子夾取患處及邊緣的皮屑、痂皮和被毛等病料于無菌的1.5 mL離心管中保存。將采集到的病料用接種環(huán)劃線或點(diǎn)種在沙氏斜面培養(yǎng)基（SDA）上，置28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周。

1.4 致病菌的分離鑒定

1.3.1 PSQI評分 在干預(yù)前及干預(yù)后4、8周時，采用PSQI[11]測試患者睡眠障礙程度。由專人發(fā)放調(diào)查表，同時向患者講解填寫方法和注意事項，囑患者獨(dú)立完成或在患者口述下，由家屬代為填寫，然后對調(diào)查問卷進(jìn)行回收。PSQI睡眠障礙量表主要包括7個睡眠因子：睡眠質(zhì)量、入睡時間、睡眠時間、睡眠效率、睡眠障礙、催眠藥物、日間功能障礙。每個因子0～3分，共18個計分條目。根據(jù)每個因子下面計分條目分值算出PSQI總得分。PSQI總分范圍為0～21分，得分≥7分說明睡眠質(zhì)量差，得分越高說明睡眠質(zhì)量越差。

1.4.1 菌落生長及形態(tài)學(xué)特征 用接種針挑取1.3中菌落中部新生菌絲，接種于SDA平皿進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取菌株sty純化培養(yǎng)物接種于SDA培養(yǎng)基平皿，30℃條件下培養(yǎng)4～5 d。肉眼觀察純化菌株的菌落生長情況，并用接種針挑取菌落經(jīng)伊紅美藍(lán)染色后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.4.2 生理學(xué)試驗 將2～3歲兒童毛發(fā)剪成1 cm左右，高壓滅菌10 min后，于超凈工作臺中散置數(shù)根毛發(fā)于SDA平皿中，將分離菌的菌懸液接種在毛發(fā)上，每根毛發(fā)3～5滴，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中。分別于接種后3～28 d，每天各取出數(shù)根毛發(fā)于載玻片上進(jìn)行毛發(fā)穿孔觀察，并拍照記錄。同時，將已純化菌落接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，進(jìn)行尿素酶試驗觀察。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定 挑取純化的單菌落菌絲約100 mg，加液氮反復(fù)研磨成粉末并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。依據(jù)EasyPureTM Genomic DNA Extraction kit說明提取真菌DNA，于1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察提取效果，其余樣品置-20℃保存?zhèn)溆谩２捎谜婢鷕DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列通用引物：ITS1（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"）、ITS4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進(jìn)行真菌ITS擴(kuò)增[10]。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板4 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將待測菌ITS序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，找出與其相似性最高的菌株。將得到的ITS序列用CLUSTALX 1.83進(jìn)行多重序列比對，用系統(tǒng)發(fā)育軟件MEGA4.1，采用最大似然法構(gòu)建基于ITS序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 中藥復(fù)方及濃度篩選試驗

1.5.1 中藥復(fù)方的制備 自擬中藥方劑，中藥復(fù)方Ⅰ：陳皮、蒼術(shù)、青蒿、薄荷（2∶2∶1∶1）；中藥復(fù)方Ⅱ：板藍(lán)根、烏梅、姜黃、薄荷（2∶2∶1∶1）；中藥復(fù)方Ⅲ：馬齒莧、黃連、五倍子、薄荷（2∶2∶1∶1）。按配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ稱取各原料藥，混合后加10倍體積（g/mL）的水浸泡1 h，常規(guī)方法煎煮，最終濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL的中藥復(fù)方提取液，即每1 mL相當(dāng)于生藥1 g，冷藏備用。

1.5.2 中藥復(fù)方篩選培養(yǎng)基的制備 配制SDA培養(yǎng)基，116℃滅菌30 min，冷卻至50～55℃，分別無菌添加1 g/mL中藥復(fù)方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，使終濃度為 0.3 g/mL，搖勻后，制備成中藥復(fù)方篩選培養(yǎng)基平板，冷藏備用。

1.5.3 中藥復(fù)方濃度篩選培養(yǎng)基的制備 配制SDA培養(yǎng)基，無菌添加篩選出的中藥復(fù)方使培養(yǎng)基中中藥復(fù)方終濃度分別為0、0.01、0.1、0.5 g/mL，搖勻后，制備成中藥復(fù)方濃度篩選培養(yǎng)基平板，冷藏備用。

1.5.4 藥敏試驗 采用帶毒平板法，接種環(huán)蘸取病原真菌點(diǎn)種于SDA培養(yǎng)基中央，28℃培養(yǎng)57 d，用直徑為6 mm的打孔器打取培養(yǎng)的病原菌制作成菌餅，并用接種針挑至中藥復(fù)方篩選培養(yǎng)基和中藥復(fù)方濃度篩選培養(yǎng)基平板中央。接種時，菌餅帶菌絲的一面向下，并用接種針輕輕壓緊，倒置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)空白對照組（不加中藥復(fù)方組）菌落生長至接近培養(yǎng)皿邊緣時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。按照下列公式計算：菌落擴(kuò)展直徑（mm）=菌落平均直徑（mm）- 6（mm，菌餅直徑）相對抑制率（%）=［（空白對照菌落擴(kuò)展直徑-處理菌落擴(kuò)展直徑）÷空白對照菌落擴(kuò)展直徑］×100

采用單因素方差分析，Duncan多重比較檢驗測定治療組之間的差異。

1.6 中藥復(fù)方效果驗證試驗選取河北保定患皮膚病的病兔90只。將病兔隨機(jī)分為陰性對照組、中藥復(fù)方治療組、西藥治療組，每組30只。陰性對照組不予任何治療；中藥復(fù)方治療組外噴濃度為0.1 g/mL的中藥復(fù)方噴劑（中藥復(fù)方Ⅱ），每日一次，每次約2～3 mL，使得外噴藥物完全覆蓋病兔病變部位，連續(xù)用藥5 d；西藥治療組用達(dá)克寧乳膏涂抹，每日一次，連續(xù)用藥5 d。15 d后評價療效，痊愈：真菌、濕疹、脂溢性皮炎、脫毛、爛肉、擦傷、皮膚潰爛等癥狀完全消失；顯效：真菌、濕疹、脂溢性皮炎、脫毛、爛肉、擦傷、皮膚潰爛等癥狀大部分消失；無效：真菌、濕疹、脂溢性皮炎、脫毛、爛肉、擦傷、皮膚潰爛等癥狀改善不明顯。按照下列公式計算：

試驗結(jié)束后，各組兔取1～2只進(jìn)行剖殺并取陰性對照組兔患處皮膚、中藥復(fù)方治療組皮膚和未感染兔皮膚于甲醛中固定，用以制作石蠟切片，HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 致病菌的分離鑒定

2.1.1 菌落生長及形態(tài)學(xué)特征 sty菌落形態(tài)相似，呈細(xì)粉末狀，菌落正面顏色為白色，背面顏色為淡黃色，中間略有凸起，邊緣不整齊。在顯微鏡下，觀察到大量的菌絲（圖1A）及大、小分生孢子（圖1B），大分生孢子有6～8個隔，中間略粗；小分生孢子圓形，小孢子較大孢子多；鏡下未見到螨等寄生蟲。

圖1 菌絲和孢子顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Micro-strcture of spores and hyphae

2.1.2 生理學(xué)試驗結(jié)果 接種3～5滴分離菌的菌懸液于每根毛發(fā)上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中3～28 d培養(yǎng)，先后發(fā)現(xiàn)兒童毛發(fā)有凹陷缺損，即出現(xiàn)穿孔反應(yīng)（圖2）。尿素酶試驗發(fā)現(xiàn)待檢菌株接種無色尿素培養(yǎng)基3～7 d后轉(zhuǎn)為粉紅色，即尿素酶試驗陽性。

圖2 毛發(fā)表現(xiàn)楔形穿孔Fig.2 Wedge shape perforation in hair

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增得到ITS區(qū)全序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得了1條500 bp～750 bp的目的條帶（圖3），與真菌ITS序列堿基大小范圍相符合；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序大小為661 bp，與瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果一致，說明分離菌株為真菌。將ITS區(qū)測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，利用CLUSTALX 1.83軟件比較其與ITS序列核苷酸的同源性。分離菌株sty與GenBank序列號EU683893.1的親緣關(guān)系最近，相似性為99%，表明分離菌sty與EU683893.1為同一種真菌，即毛癬菌屬的萬博節(jié)皮菌。通過MEGA4.1軟件，依據(jù)萬博節(jié)皮菌ITS核苷酸序列，構(gòu)建萬博節(jié)皮菌發(fā)育樹（圖4）可知，該分離株與EU683893.1屬于同一分支，確定該菌為須癬毛癬菌復(fù)合體的萬博節(jié)皮菌（Arthoderma vanbreuseghemii）。

圖3 待測菌株ITS 序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification profiles of ITS sequence of the tested fungus strain

圖4 分離菌株ITS 序列與GenBank 序列的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ITS sequence of tested fungus strain compared with sequences in GenBank

2.2 中藥復(fù)方及濃度篩選試驗

2.2.1 中藥復(fù)方篩選試驗結(jié)果 采用帶毒平板法進(jìn)行抑菌試驗，在中藥濃度相同的情況下，中藥復(fù)方Ⅱ的抑制率為76%，與中藥復(fù)方Ⅰ（33.3%）、中藥復(fù)方Ⅲ（29.9%）差異顯著（P＜0.05），而中藥復(fù)方Ⅰ的抑制率與中藥復(fù)方Ⅲ兩者間差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

表1 不同中藥復(fù)方對須癬毛癬菌的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of different traditional Chinese medicine compound on Trichophyton mentagrophytes

2.2.2 中藥復(fù)方濃度篩選試驗結(jié)果 將sty菌餅接種于中藥復(fù)方Ⅱ濃度篩選培養(yǎng)基中心，當(dāng)空白對照菌落生長至接近培養(yǎng)皿邊緣時，進(jìn)行抑制作用測定。結(jié)果可見（表2），當(dāng)中藥復(fù)方濃度為0.5 g/mL時可完全抑制須癬毛癬菌生長，抑制率為100%；中藥復(fù)方濃度為0.1 g/mL時，抑制率為61.4%；中藥復(fù)方濃度為0.01 g/mL時，抑菌率為8.2%。

2.3 中藥復(fù)方效果驗證試驗結(jié)果

2.3.1 中藥復(fù)方治療效果 用0.1 g/mL中藥復(fù)方Ⅱ噴涂病兔患處皮膚，連續(xù)用藥5 d，觀察10 d。結(jié)果可見，中藥復(fù)方治療組起效時間比西藥治療組快，用藥第3 d結(jié)痂已經(jīng)脫落，而西藥治療組結(jié)痂才開始松軟；且中藥復(fù)方治療組新生皮毛比西藥治療組早；中藥復(fù)方治療組沒有復(fù)發(fā)現(xiàn)象，而西藥組有復(fù)發(fā)現(xiàn)象。陰性對照組一直保持頭部、耳朵、嘴處結(jié)痂嚴(yán)重，癥狀改善不明顯，未見自愈現(xiàn)象（表3）。

表2 不同濃度中藥復(fù)方對須癬毛癬菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of different concentration traditional Chinese medicine compound on Trichophyton mentagrophytes

表3 中藥復(fù)方噴劑與西藥治療感染須癬毛癬菌皮膚病兔的對比效果Table 3 Comparative effect of traditional Chinese medicine compound spray and western medicine on rabbit infected with Trichophyton mentagrophytes

中藥復(fù)方治療組的總有效率為100%，西藥治療組總有效率為66.7%，中藥復(fù)方治療組優(yōu)于西藥治療組（表4）。且在治療過程中，未發(fā)現(xiàn)兔只有任何不良及過敏反應(yīng)，證明中藥復(fù)方治療效果顯著，且無毒副作用。

2.3.2 皮膚組織切片觀察結(jié)果 治療試驗結(jié)束后，取未感染兔皮膚組織、陰性對照組和中藥復(fù)方治療組兔患處皮膚組織制作切片，HE染色觀察（圖5）。與未感染兔皮膚組織（圖5C、5D）相比，陰性對照組兔患處皮膚組織切片出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的單一核細(xì)胞浸潤，浸潤部位主要是毛囊周圍、毛囊中及真皮毛細(xì)血管周圍（圖5A），呈較密集團(tuán)塊狀或梭狀，毛囊數(shù)量減少（圖5B），視野出現(xiàn)大片空白無毛囊區(qū)。中藥復(fù)方治療組兔患處皮膚炎性細(xì)胞浸潤明顯減少（圖5E），毛囊數(shù)量有所增加（圖5F）。

表4 中藥復(fù)方噴劑對感染須癬毛癬菌皮膚病兔的治療效果Table 4 Therapeutic effect of traditional Chinese medicine compound spray on rabbit infected with Trichophyton mentagrophytes

3 討論

研究表明，引起兔皮膚真菌病的主要是毛癬菌屬、小孢子菌屬和表皮癬菌屬[11]。兔皮膚真菌病傳播迅速、難治愈，尤其在夏季溫度較高的情況下，發(fā)病率很高，嚴(yán)重影響兔的毛皮質(zhì)量，降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，給養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴(yán)重威 脅[12]。本研究對患病兔進(jìn)行病菌分離鑒定，對耳部、面部、腹部、腿部分別進(jìn)行了結(jié)痂的沙氏培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)均為同一種菌落，正面白色背面黃色，且無其他雜菌生長，說明所分離菌為目標(biāo)菌的可能性很大。在須癬毛癬菌傳統(tǒng)的鑒定方法中，沙氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)觀察十分重要，但易受主觀因素和環(huán)境因素的影響。分子生物學(xué)方法可以彌補(bǔ)其缺陷，可結(jié)合ITS和LSU區(qū)段的序列分析比對來鑒定出須癬毛癬菌有性型菌種[13]，目前ITS間區(qū)序列分析被認(rèn)為是皮膚真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。本研究經(jīng)ITS序列對比分析，最終確定河北保定地區(qū)患病兔為感染須癬毛癬菌屬的萬博節(jié)皮菌，此分子生物學(xué)方法也已廣泛用于真菌的鑒定[8,15-16]。

帶毒平板法抑菌試驗是將供試藥劑與培養(yǎng)基混合，以培養(yǎng)基上菌落生長速度來衡量化合物的毒力大小。一般用于不產(chǎn)孢子或產(chǎn)孢子量較少而菌絲較密的平伏放射生長真菌。須癬毛癬菌生長為平伏放射狀，采用帶毒平板法，可直觀清晰的觀察藥物對菌落的抑制情況，同時通過測量擴(kuò)展直徑，計算抑制率。

圖5 皮膚組織切片觀察（10×10 倍）Fig. 5 Observation of skin tissue sections(10×10 times)

單味中藥的真菌抑菌作用已有較多研究，張國哲等[18]從132味中藥中篩選出13味抗真菌活性較強(qiáng)的中藥，以黃芩、黃連、五倍子、訶子組方，對白色念珠菌、石膏樣小孢子菌和紅色毛癬菌具有較好的抑菌能力。單味中藥在有些方劑中并無明顯的抗真菌活性，但在復(fù)方中卻呈現(xiàn)一定療效[19]。本研究選擇幾種常見且具有較好抗真菌活性的中藥進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)復(fù)方Ⅱ：板藍(lán)根、烏梅、姜黃、黃芪、薄荷抑菌效果最好，抑制率為76%，且抑菌作用隨著藥物濃度的升高而加強(qiáng)，當(dāng)藥物濃度為0.5 g/mL時可完全抑制須癬毛癬菌生長。這可能與烏梅酸性較強(qiáng)，含有較豐富的蘋果酸、檸檬酸有關(guān)，能破壞真菌生長環(huán)境有關(guān)。另外真菌細(xì)胞壁的多糖成份、細(xì)胞膜的麥角固醇是真菌細(xì)胞所特有的，中藥能抑制這些成份的生物合成，破壞真菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抗真菌的作用[20]。

在效果驗證試驗中，用0.1 g/mL中藥復(fù)方噴劑對患病兔進(jìn)行治療，結(jié)果總有效率為100%，痊愈率66.7%，而西藥治療組總有效率為66.7%。中藥復(fù)方噴劑治療效果顯著，能有效祛除皮膚表層結(jié)痂，促進(jìn)創(chuàng)傷面愈合和被毛生長，恢復(fù)皮膚原貌。原因與中藥的功效有關(guān)，板藍(lán)根、烏梅抗菌能力較強(qiáng)，姜黃有促進(jìn)毛發(fā)再生的功效，薄荷具有清熱散毒、散火的功效；另外，自制中藥噴劑為酸性環(huán)境，能迅速降低皮膚表層pH值，有效抑制真菌生長，恢復(fù)皮膚表面微環(huán)境。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中藥噴劑治療后，患處皮膚細(xì)胞浸潤減少，毛囊增多。患病較輕的動物治療2～3 d天即可痊愈，病癥重者治療 5～10 d即可痊愈。在1年后的回訪觀察中，中藥治療組未有復(fù)發(fā)現(xiàn)象。本研究自制中藥復(fù)方劑型為液體噴劑，較膏劑類產(chǎn)品使用更加方便，可直接噴于兔只患病部位，能快速滲入皮膚，促進(jìn)結(jié)痂脫落，加快創(chuàng)傷愈合；自制中藥復(fù)方噴劑在動物試驗中取得了較好的治療效果；中藥來源廣泛，不容易產(chǎn)生耐藥性，具有廣闊的應(yīng)用空間。