王開玲，周海艷

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）屬于糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致眼盲的主要原因之一[1]。DR 病人出現(xiàn)視力減退、甚至失明，嚴(yán)重影響患者的正常生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜組織過度的炎性反應(yīng)及氧化損傷是DR 的重要病癥，也是引起細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能減退的關(guān)鍵因素[2-3]。血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）活性對(duì)熱較穩(wěn)定，具有抗炎癥、抗凋亡、舒張血管等生物活性，研究報(bào)道HO-1 在較多疾病中發(fā)揮保護(hù)性作用，如降低腎臟組織HO-1 表達(dá)會(huì)引起腎臟血流灌注減少，進(jìn)一步惡化腎臟的損傷，然而高表達(dá)HO-1 可以改善腎臟損傷[4]。蔡晶晶等[5]發(fā)現(xiàn)DR 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HO-1 mRNA 水平顯著低于正常人群，提示HO-1 也許可以作為保護(hù)性指標(biāo)介導(dǎo)DR 的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)藥在防控糖尿病視網(wǎng)膜病變方面有一定保護(hù)作用[6]。五味子乙素（schisandrin B，SchB）是從五味子中提取分離得到的木質(zhì)素類天然活性化合物，具有顯著的抗氧化、抗炎癥及抗細(xì)胞凋亡的作用，它可以通過抑制細(xì)胞內(nèi)炎性通路活化達(dá)到對(duì)心臟、大腦、肝臟及腎臟等組織的保護(hù)作用[6-8]。目前，SchB 對(duì)DR大鼠的保護(hù)作用及其對(duì)HO-1 蛋白的相關(guān)作用不明確，基于此，本文探討了SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜功能及HO-1 蛋白表達(dá)的影響，以期為DR 早期治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

7 周 齡200～250 g 雄性SPF 級(jí)SD 大鼠32只（遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，合格證SCXK2010-0012），分籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中。

1.2 藥物及試劑

五味子乙素（山東綠葉制藥，批號(hào)：H2011051108，純度≥98%），鏈脲佐菌素、鋅原卟啉購自美國(guó)Sigma 公司，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)試劑盒（南京建成公司，批號(hào)：L140915427)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）試劑盒（南京建成公司，批號(hào)：L140912517），血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ) 試劑盒（南京建成公司，批號(hào)：L141824517），細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）試劑盒（武漢華美公司，批號(hào)：H2018031406），一氧化氮（NO）試劑盒（武漢華美公司，批號(hào)：H2018041157），腫瘤壞死因子-α（tumor Necrosis Factor，TNF-α）試劑盒（武漢華美公司，批號(hào)：H2017110629），丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒（武漢華美公司，批號(hào)：H2017120850），超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1，SOD1）試劑盒（武漢尤爾生，批號(hào)：L140915390），過氧化氫酶(catalase，CAT) 試劑盒（武漢尤爾生，批號(hào)：L140914218），HO-1 及β-actin 單克隆抗體購自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 儀器 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)：NIB400）；酶標(biāo)儀（瑞士THERMO 公司，型號(hào)：Multiskan FC）；凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬生物科技公司，型號(hào)：ZF-258）。

1.4 方法

1.4.1 DR 模型構(gòu)建 大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素構(gòu)建DR 模型，3 d 后檢測(cè)大鼠血糖濃度，其中血糖濃度≥16.65 mmol/L 的大鼠作為實(shí)驗(yàn)組。

1.4.2 分組 將大鼠分為正常對(duì)照組、DR 組、DR+SchB 組及DR+SchB+鋅原卟啉組。正常對(duì)照組為未經(jīng)鏈脲佐菌素處理的SD 大鼠8 只，給予生理鹽水灌胃處理56 d；DR 組 為DR 模型鼠8 只，給予靜脈注射鏈脲佐菌素處理3 d；DR+SchB 組為DR 模型鼠8 只，給予靜脈注射鏈脲佐菌素處理3 d 和SchB 灌胃（30 mg/kg）56 d；DR+SchB+鋅原卟啉組為DR 模型鼠8 只，給予靜脈注射鏈脲佐菌素處理3 d、SchB 灌胃（30 mg/kg）56 d和鋅原卟啉（10 μmol/kg）56 d。

1.4.3 觀察指標(biāo) 大鼠灌胃8 周后，采用適量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，每只采血3 ml，靜置于冰上2 h 后3000 r/min 離心5 min，吸去血清轉(zhuǎn)移至無菌eppendorf 管內(nèi)超低溫保存。采用頸椎脫臼法處理大鼠，摘除雙側(cè)眼球分離視網(wǎng)膜，制備成勻漿放置4℃、13 000 g 離心15 min，吸取蛋白上清至新eppendorf管中，保存在-80 ℃冰箱。分別檢測(cè)血清HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平，同時(shí)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織勻漿ICAM-1、TNF-α、NO 及MDA 水平，還分析了勻漿中SOD1 和CAT 酶活性。操作步驟：加入待測(cè)樣品加入包被反應(yīng)孔中，置于37 ℃孵育1 h，然后洗滌3 次；然后加入新配的酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育1 h，拍板洗滌5次；再加入HRP 標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h，拍板洗滌5次；最后加入終止液反應(yīng)5 min，然后在酶標(biāo)儀中測(cè)定OD 值。

1.4.4 Western Blot 實(shí)驗(yàn) 采用BCA 試劑盒測(cè)定勻漿中蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸7 min。用12%的SDS-PAGE 凝膠塊電泳分離蛋白，完成后轉(zhuǎn)膜。切割不同分子量目的蛋白條帶至對(duì)應(yīng)HO-1 及β-actin 一抗溶液中（稀釋比均為1：3000），4 ℃震蕩過夜，采用HRP 標(biāo)記的二抗（稀釋比1:1000）37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3 次后加入ECL 顯影液，采用X 光膠片曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SchB 對(duì)DR 大鼠血清中血糖及新生血管相關(guān)指標(biāo)的影響

SchB 對(duì)DR 大鼠新生血管相關(guān)指標(biāo)（HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ）水平的影響（表1），提示DR 組大鼠HIF-1α（t=3.439，P=0.016）、VEGF（t=6.092，P=0.006）及ANGⅡ（t=9.026，P=0.002）水平高于正常對(duì)照組；新生血管治療后會(huì)明顯降低HIF-1α（t=5.109，P=0.009）、VEGF（t=3.286，P=0.019）及ANGⅡ（t=7.309，P=0.007）水平，但是SchB 與鋅原卟啉共同治療對(duì)DR 大鼠HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平均無影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)SchB 與鋅原卟啉治療后對(duì)大鼠血糖濃度也無明顯降低，但是藥物干預(yù)組血糖有下降趨勢(shì)。

表1 SchB 對(duì)DR 大鼠血清中血糖及新生血管相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，n=8）

表1 SchB 對(duì)DR 大鼠血清中血糖及新生血管相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，n=8）

注：*與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；#與DR 組比較，P＜0.05。HIF-1α：缺氧誘導(dǎo)因子1α；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；ANGⅡ：血管緊張素Ⅱ

2.2 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子水平的影響

SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥相關(guān)指標(biāo)（ICAM-1、NO 及TNF-α）水平的影響如表2 所示，提示DR 組大鼠視網(wǎng)膜組織ICAM-1（t=10.043，P=0.000）、NO（t=8.328，P=0.003）及TNF-α（t=10.192，P=0.000）水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；SchB 治療后會(huì)明顯降低ICAM-1（t=4.573，P=0.015）、NO（t=7.649，P=0.004）及TNF-α（t=5.937，P=0.009）水平，但是SchB 與鋅原卟啉共同治療對(duì)DR 大鼠ICAM-1、NO 及TNF-α 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響

SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（MDA、SOD1 及CAT）的影響如表3 所示，提示DR 組大鼠視網(wǎng)膜組織MDA 水平相對(duì)于正常對(duì)照組升高（t=4.219，P=0.017），而SOD1（t=5.313，P=0.007）及CAT（t=12.331，P=0.000）活性降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SchB 治療后會(huì)降低MDA 水平（t=4.315，P=0.008）、升高SOD1（t=6.312，P=0.002）及CAT（t=11.094，P=0.000）活性，但是SchB 與鋅原卟啉共同治療對(duì)DR 大鼠MDA 水平、SOD1 及CAT活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子水平的影響（±s，n=8）

表2 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子水平的影響（±s，n=8）

注：* 與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與DR 組比較，P＜0.05。ICAM-1：人細(xì)胞間粘附分子1；NO：一氧化氮；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

表3 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響（±s，n=8）

表3 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響（±s，n=8）

注：* 與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與DR 組比較，P＜0.05。MDA：丙二醛；SOD1：超氧化物歧化酶1；CAT：過氧化氫酶

2.4 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 表達(dá)的影響

SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 表達(dá)水平的影響（圖1）所示，提示DR 組大鼠HO-1 表達(dá)水平低于正常對(duì)照組（t=4.336，P=0.008）；五味子乙素治療后會(huì)明顯誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)上調(diào)（t=6.113，P=0.006），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是SchB 與鋅原卟啉共同治療對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 表達(dá)，與DR組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜血管密度的影響

圖1 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 表達(dá)的影響。1A HO-1 表達(dá)的電泳圖；1B 4 組HO-1 表 達(dá)的條圖。* 與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；# 與DR組比較，P＜0.05。HO-1：血紅素加氧酶1

DR 組大鼠視網(wǎng)膜血管增生，排列紊亂，毛細(xì)血管面積密度增高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.047，P=0.003）；五味子乙素治療組大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的分布較為均勻，血管增生不明顯，與模型組比較，毛細(xì)血管面積密度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.094，P=0.012）；但是SchB 與鋅原卟啉共同治療對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜血管密度無明顯影響（圖2）。

圖2 SchB 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜血管密度的影響。2A 正常對(duì)照組；2B DR 組；2C DR+SchB 組；2D DR+SchB+鋅原卟啉組

3 討論

糖尿病是最常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，然而DR 為糖尿病較為常見的并發(fā)癥之一，最后導(dǎo)致患者視力減退、甚至失明，會(huì)給患者及家庭帶來極大的影響[9]。到目前為止，DR 的發(fā)病機(jī)制仍處于研究階段，并未得到明確闡述，于是臨床上探索防治DR的有效藥物一直是研究熱點(diǎn)。

VEGF 對(duì)血管新生具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，并且在DR 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)，參與DR 形成的多個(gè)環(huán)節(jié)。生理?xiàng)l件低水平VEGF 能保證血管的穩(wěn)定性及視網(wǎng)膜正常生長(zhǎng)，當(dāng)血糖水平升高時(shí)會(huì)導(dǎo)致VEGF 產(chǎn)生增高，進(jìn)一步誘發(fā)視網(wǎng)膜血管滲漏、內(nèi)皮細(xì)胞增殖形成新的血管[10]。在DR 發(fā)病初期，視網(wǎng)膜微血管處于缺血缺氧條件下，高糖及缺氧刺激HIF-1α 的活化，后者進(jìn)一步促使VEGF 基因的高表達(dá)，促進(jìn)DR 病情惡化[11]。VEGF 會(huì)誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子的釋放，其中ANGⅡ能夠作用與血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使血管的形成。臨床研究也發(fā)現(xiàn)VEGF 與ANGⅡ與DR 患者并且相關(guān)性較好[12]，并且中藥葛根素還能通過抑制VEGF 基因表達(dá)改善DR 病情[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DR 大鼠血清中HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平顯著升高，SchB 治療后可明顯降低大鼠血清中HIF-1α、VEGF 及ANGⅡ水平，提示SchB可以抑制新生血管的形成，從而改善視網(wǎng)膜病變程度。

氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)也是DR 發(fā)生發(fā)展的重要因素，機(jī)體氧化穩(wěn)態(tài)失衡及炎性因子大量產(chǎn)生可能是引起糖尿病患者并發(fā)視網(wǎng)膜病變的關(guān)鍵原因。糖尿病引起的代謝紊亂會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)自由基的大量升高，氧化應(yīng)激產(chǎn)物會(huì)活化多元醇、蛋白激酶C 途徑及己糖胺途徑，引起新生血管的形成，還能活化炎性通路[14]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)DR 患者體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 水平明顯升高，而抗氧化酶SOD 活性卻明顯降低；然而葛根素治療后能明顯降低視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物的水平，提升抗氧化酶活性，降低氧化損傷，改善DR 病情[15-16]。SchB 具有抗氧化及抗炎癥的藥理活性，本研究也發(fā)現(xiàn)SchB 治療后能夠明顯降低DR 大鼠視網(wǎng)膜組織炎性因子ICAM-1、NO、TNF-α 及氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 水平，并且誘導(dǎo)抗氧化酶SOD1 及CAT 活性的增強(qiáng)。而HO-1 具有抗炎癥、抗氧化、舒張血管等生物活性，因此誘導(dǎo)其高表達(dá)能夠改善DR 大鼠的視網(wǎng)膜病變。早期研究提示早期糖尿病小鼠，視網(wǎng)膜組織中HO-1 表達(dá)增加，但到了疾病發(fā)展的后期HO-1 表達(dá)水平降低，引起抗氧化能力下降[17]。早期已證實(shí)DR 分為增殖前期和增殖期，在DR 各個(gè)階段選用不同治療方案，才可能獲得最佳治療效果。謝林英等[18]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)糖尿病DR 患者開展早期視網(wǎng)膜光凝術(shù)，盡管對(duì)視野有一定損害，但仍能提高或保持其視功能；然而對(duì)增殖期患者采用此方案進(jìn)行治療時(shí)，臨床療效較差，并且對(duì)視野的損傷程度更為嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)是在構(gòu)建DR 模型鼠時(shí)同時(shí)給予SchB 治療，屬于DR 增殖前期階段的治療；然而，SchB 是否對(duì)DR 增殖階段的治療有效或帶來負(fù)向影響需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DR組大鼠視網(wǎng)膜組織中HO-1 呈低表達(dá)，而經(jīng)過SchB治療后可誘導(dǎo)HO-1 表達(dá)；然而這種作用可以被HO-1 抑制劑鋅原卟啉逆轉(zhuǎn)，說明SchB 對(duì)DR 大鼠的早期保護(hù)作用可能主要通過上調(diào)HO-1 表達(dá)抑制新生血管形成、炎性反應(yīng)及氧化損傷。