賴媛媛， 王宇婷， 陳家倪， 齊 軍， 何振業(yè)

（1.國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518116；2.深圳市華中科技大學協(xié)和深圳醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518000）

2019年12月，武漢地區(qū)突發(fā)一種由新型冠狀病毒引起的肺炎病例。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織將這一新發(fā)傳染病正式命名為新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），同時，國際病毒分類委員會將這一新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。SARSCoV-2傳染性極強，醫(yī)務人員感染率高達29%[1]?；颊叱Ｒ?guī)檢測的臨床樣本（血、痰液、糞便及尿液等）可產生氣溶膠，具有潛在致病性和高傳染性。為了給臨床提供快速、準確的診療依據(jù)，且能避免實驗室人員感染，本文就SARS-CoV-2的病原學特點、臨床實驗室檢測手段及臨床實驗室的生物安全防控措施作一綜述。

1 SARS-CoV-2病原學特點及流行病學特征

SARS-CoV-2是直徑為60～140 nm，且有包膜的β屬冠狀病毒，與非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)及中東呼吸綜合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV) 為同一屬[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)SARSCoV-2編碼15種非結構蛋白（nsp1～nsp10、nsp12～nsp16）、4種結構蛋白（S、E、M和N）和8種輔助蛋白（3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14），且這些編碼蛋白的氨基酸序列上，與SARS-CoV之間存在差異性氨基酸位點，如編碼的8b蛋白（121個氨基酸）的長度要長于SARS-CoV（84個氨基酸）[3]。有學者用冷凍電鏡技術發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的S蛋白對人體ACE2的親和力高于SARS-CoV的S蛋白[4]，提示SARS-CoV-2與SARS-CoV在致病性、傳染性和抵抗力等方面存在差異。SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min以及脂溶劑（75%乙醇、含氯消毒劑、氯仿等，氯己定除外）均可有效滅活病毒[5]。人類為SARS-CoV-2易感宿主，在人際間除飛沫傳播外，還存在糞-口傳播、間接接觸傳播和氣溶膠傳播等多種傳播途徑[6]，傳染性比SARS-CoV和MERS-CoV強[7]。COVID-19患者常出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽和乏力的癥狀，嚴重時會導致呼吸系統(tǒng)功能衰竭，還可能引起消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及泌尿系統(tǒng)的功能障礙[8]。

2 COVID-19實驗室檢測

2.1 血液檢測

COVID-19患者白細胞總數(shù)正?；驕p少，淋巴細胞計數(shù)減少，C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A升高[5]。中性粒細胞/淋巴細胞比值可用于評估COVID-19患者病情的進展程度，準確性較高，如COVID-19患者的中性粒細胞/淋巴細胞比值≥3.13，表明患者有較高重癥的風險[9]。有研究結果顯示，COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量雖然都有明顯減少，但狀態(tài)均表現(xiàn)為過度活化，且CD8+T細胞有高毒性[10]。這是COVID-19患者免疫系統(tǒng)損傷的重要原因。

2.2 生化和免疫檢測

COVID-19患者會出現(xiàn)肌酸激酶、乳酸脫氫酶、丙氨酸氨基轉移酶以及天門冬氨酸氨基轉移酶升高[5]，還會出現(xiàn)血清白蛋白水平降低、血漿血管緊張素Ⅱ水平升高，部分患者還出現(xiàn)尿蛋白水平升高[11-12]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者血漿中細胞因子（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等）水平明顯升高[13]，表明SARS-CoV-2感染會引發(fā)細胞因子風暴。

2.3 凝血功能檢測

有研究結果表明，COVID-19患者纖維蛋白原以及D-二聚體會升高；當COVID-19患者出現(xiàn)早期的彌散性血管內凝血時，D-二聚體可顯著升高，伴有凝血酶原時間的輕度延長；當COVID-19患者出現(xiàn)顯性的彌散性血管內凝血時，血小板計數(shù)會顯著減少；COVID-19死亡病例中，患者血漿中的纖維蛋白降解產物也顯著升高[13]。

2.4 病原學檢查

2.4.1 SARS-CoV-2的核酸檢測 目前，主要采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（r e a ltime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測患者標本（鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及糞便等）中是否含有SARS-CoV-2特異性的RNA序列，來對COVID-19進行早期病原學診斷[14]。但這一檢測方法存在一定的假陰性，原因在于：（1）臨床樣本采集的部位與方法不同，導致SARS-CoV-2的載量過少，無法檢測；（2）診斷試劑的可靠性及敏感性有限。為此，在檢測之前，應做到以下2點：（1）對臨床樣本的質量進行評估，保證采集的臨床樣本病毒載量能在檢測范圍內；（2）驗證試劑的性能，保證結果的精密度和符合性。

此外，目前還有納米孔靶向測序（nanopore targeted sequencing，NTS）方法。該方法主要檢測SARS-CoV-2的10 kb基因區(qū)域，增加捕獲SARS-CoV-2核酸的概率，且可讀出其基因序列，敏感性和準確性高于RT-qPCR。NTS可實現(xiàn)在4 h內準確檢測SARS-CoV-2，且可檢測SARSCoV-2基因組變異情況[15]。

2.4.2 SARS-CoV-2的特異性抗體檢測 血清中的SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測可用于篩查和輔助診斷COVID-19。IgM是COVID-19患者體內早期（發(fā)病3～5 d）出現(xiàn)的抗體，而IgG則是感染中、后期產生的抗體[5]，對COVID-19患者進行血清特異性IgM和IgG抗體檢測，不僅可用于早期疑似病例篩查，還可以用于COVID-19患者的病程監(jiān)測和回顧性診斷。特異性抗體檢測也有其局限性，主要為：（1）產生抗體前存在窗口期；（2）抗體檢測易受干擾，如患者血液中存在類風濕因子、非特異IgM或自身抗體等，會導致檢測結果出現(xiàn)假陽性。

3 實驗室生物安全防護

3.1 實驗室環(huán)境生物安全防護

3.1.1 實驗室分區(qū) 實驗室須合理劃分清潔區(qū)、緩沖區(qū)和污染區(qū)，避免交叉污染。須在生物安全二級以上的實驗室內進行COVID-19患者的常規(guī)血液檢測、體液檢測以及SARS-CoV-2的核酸檢測[6]。應注意的是：（1）血常規(guī)和C反應蛋白等檢測建議采用閉管操作，病毒抗原或抗體篩查等開放性操作應在生物安全柜內進行；（2）實驗室環(huán)境須符合分子生物學實驗室基本要求，并獲得有關部門批準后方可開展SARS-CoV-2的核酸檢測工作；（3）若負壓實驗室出現(xiàn)正壓時，實驗室人員應緊急撤離。

3.1.2 實驗室環(huán)境消毒 臨床實驗室需采用以下的消毒措施[16]：（1）實驗室每天都要進行紫外線照射進行空氣消毒，照射時間不短于30 min；（2）實驗室每天需在試驗前后使用1 000 mg/L有效氯消毒液對工作臺面及地面進行消毒；（3）生物安全柜等金屬設備和儀器采用75%乙醇進行消毒。

3.1.3 實驗室生物安全操作失誤或意外的防護處理 當臨床樣本出現(xiàn)溢灑時，應將實驗室空間密閉，防止污染物擴散；采用5 500 mg/L有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區(qū)30 min后進行擦拭消毒[17]，消毒液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，有效期為1 d。

3.2 實驗室人員生物安全防護

需要接觸SARS-CoV-2標本的實驗室人員應實施生物二級以上的個人防護[16]。

實驗室人員防護用品穿戴順序為：在非發(fā)熱門診等常規(guī)檢驗區(qū)域執(zhí)行手衛(wèi)生，戴帽子、醫(yī)用外科口罩/醫(yī)用防護口罩和手套；在發(fā)熱門診實驗室和PCR實驗室等進行SARS-CoV-2檢驗的高風險區(qū)域需戴護目鏡/防護面罩（屏），穿隔離衣和穿防護鞋套（靴），戴橡膠手套。

實驗室人員防護用品脫順序為：在污染區(qū)脫手套、脫隔離衣、脫防護鞋套（靴）、脫防護面罩/護目鏡。注意事項：（1）執(zhí)行每一步動作后需執(zhí)行手衛(wèi)生；（2）脫防護服前，可用500 mg/L有效氯消毒劑進行全身噴霧消毒；（3）防護面罩與護目鏡須75%乙醇浸泡消毒后方可重復使用。在緩沖區(qū)脫口罩、帽子后執(zhí)行手衛(wèi)生，方可進入清潔區(qū)。

3.3 臨床樣本處理

3.3.1 檢驗前的樣本處理 檢驗前對臨床樣本的處理需采用以下防護措施[18-19]：（1）標本采集。采集者須按照三級生物安全防護，且在采集過程中要做到盡量減少接觸患者皮膚、衣服、用品等；避開患者咳嗽的時刻，避免飛沫傳播；盡量縮短在床旁的持續(xù)時間。（2）樣本轉運。COVID-19患者的臨床樣本需專人運輸，運輸者須采用二級生物安全防護，需采用具有3層包裝的專用運輸系統(tǒng)，包括SARS-CoV-2專用轉運箱、樣本盒和有生物安全標識的密封袋，標本采集后，將臨床樣本裝入密封袋，置于樣本盒中，再放入轉運箱。運輸時間不超過2 h。運輸期間保持轉運箱平穩(wěn)。若運輸發(fā)生意外，須到接收地點與接收者共同處理。（3）樣本接收與處理。接收、分揀、離心疑似或確診患者臨床樣本時，實驗室人員須采用二級生物安全防護。交接環(huán)節(jié)需有記錄，以便溯源。開啟轉運箱取樣本前，應使用75%乙醇噴霧消毒轉運箱；從密封袋取出樣本后，應用紫外燈或75%乙醇對樣本及轉運箱、樣本盒進行消毒。樣本離心后靜置10 min方可取出。若離心時臨床樣本出現(xiàn)灑漏時，實驗室人員須按照三級生物安全防護，需立即停止離心，靜置30 min以上后進行75%乙醇噴霧消毒處理方可取出標本，并使用75%乙醇擦拭（噴淋）消毒離心機。

3.3.2 檢驗中的樣本處理 檢驗中對臨床樣本的處理需采用以下防護措施[6，19]：（1）血常規(guī)由閉管的全自動儀器檢測，執(zhí)行此操作的實驗室人員須采用二級生物安全防護。若需涂片鏡檢，實驗室人員須按照三級生物安全防護在生物安全柜內操作，涂片完成后須紫外照射30 min后再取出閱片。閱片完成后，應將玻片置于5 500 mg/L含氯消毒液的銳器盒中。（2）生化、免疫與凝血功能檢測需開蓋檢測。應在生物安全柜內完成開蓋后，用專用箱運輸至全自動儀器檢測。執(zhí)行此操作的實驗室人員須采用三級生物安全防護。生物安全柜操作前后需開啟風機運行5 min。（3）SARS-CoV-2的核酸檢測：樣本進行核酸擴增前需對臨床樣本進行病毒滅活（56℃孵育30 min后加入蛋白酶K或試劑盒自帶的核酸提取裂解液）。執(zhí)行此操作的實驗室人員須采用三級生物安全防護。

3.3.3 檢驗后樣本處理 檢驗后對臨床樣本的處理需采用以下防護措施[6]：（1）檢驗報告建議無紙化，若需要紙質報告，須有效消毒才出檢驗科。（2）開蓋的臨床樣本檢測完后須在生物安全柜中重新蓋上新的管帽密封，置于有生物危害標識的雙層醫(yī)用垃圾包裝袋（黃色）中密封放置。（3）所有的臨床標本，包括密閉試管和開蓋的試劑盒，均需要采用高壓滅菌。

4 廢棄物處理

4.1 廢液的處理

對于檢驗過程中產生的感染性廢液，需用10 000 mg/L有效氯消毒劑進行消毒處理，且需驗證消毒效果，確保感染源被徹底滅活[20]。

4.2 固體廢物的處理

對于實驗過程中產生的固體廢物（如檢驗后的臨床樣本、耗材和個人防護裝備等）須使用雙層標注“新型冠狀病毒感染的肺炎”的包裝袋包裝，采用鵝頸結式分層封口，經高壓滅菌后，集中將其通過廢棄物通道送至固體醫(yī)療廢棄處理單位處置[21]。

4.3 建立廢棄物處理記錄

定期監(jiān)測處理后的污水及壓力蒸汽滅菌效果，并如實填寫所有“新型冠狀病毒感染的肺炎”標本的處理記錄，且此資料保存3年[21]。

5 總結

及時發(fā)現(xiàn)、早期診斷和快速干預對于挽救COVID-19患者的生命至關重要?？焖?、準確的實驗室檢測可以為COVID-19的診療提供重要的依據(jù)。目前臨床上用于COVID-19患者診斷的重要的實驗室檢查有血液檢測、生化及免疫檢測和病原學檢查。其中病原學檢查，包括SARSCoV-2特異性抗體和核酸檢測為COVID-19確診提供了病原學依據(jù)。由于這些臨床樣本具有潛在的致病性和傳染性，故實驗室人員在檢驗操作的全過程中，應采用必要的實驗室生物安全防護措施，避免在檢驗過程中交叉感染，而且要防止臨床樣本中可能含有的病原體對外界環(huán)境的污染。