付烊，章必成

(1.湖北中醫(yī)藥大學附屬襄陽醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441001；2.武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430060)

惡性腫瘤的治療已經(jīng)全面進入精準醫(yī)學時代。通過尋找生物標志物以判斷腫瘤的生物學行為和選擇合適的治療手段，是精準醫(yī)學的一個重要特點。生物標志物通常被定義為一種可以客觀監(jiān)測和評估正常生理進程、病理進程或?qū)δ撤N治療干預藥物應答情況的指標或標志。近年來，各種生物標志物已經(jīng)開始用于腫瘤免疫治療的預后判斷和療效預測，并收到良好效果。

1 腫瘤預測和預后標志物的概念

腫瘤的預測標志物通常用于預測特定人群對某種特定手段的療效，可以成為治療的靶點。例如，對晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者進行基因檢測，如果發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)或Braf等驅(qū)動基因敏感突變陽性，則可分別給予相應的靶向藥物進行治療[1]。腫瘤的預后標志物則可用于判斷患者的復發(fā)風險和生存時間，與患者接受何種治療方法無關(guān)。例如，對乳腺癌患者進行21或58基因分析，以判斷患者的整體預后。

定義腫瘤的預測和預后生物標志物，通常需要通過臨床試驗進行嚴格挑選[2]。迄今為止，臨床常用的腫瘤預測生物標志物包括：乳腺癌(HER-2、ER/PR)，結(jié)直腸癌(K-ras)，胃腸道間質(zhì)瘤(c-Kit)，胃癌(HER-2)，NSCLC(EGFR、ALK和Braf等)，以及黑色素瘤(Braf)等；美國食品藥品管理局(FDA)批準的腫瘤預后生物標志物包括：乳腺癌(58基因RNA表達譜、70基因表達譜、HER-2和TOP2A)，前列腺癌(tPSA)等。

隨著惡性腫瘤的治療全面進入免疫治療時代，免疫治療的生物標志物逐步成為當前研究的熱點。目前，腫瘤免疫治療的生物標志物包括四大類：①來自腫瘤新抗原，如腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(microsatellite instability-high，MSI-H)/錯配修復缺陷缺失(mismatch repair deficient，dMMR)和新抗原負荷等；②來自腫瘤炎性微環(huán)境，如程序性細胞死亡蛋白配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphoeytes，TILs)和部分炎癥標志物等；③與腫瘤免疫抑制/逃逸有關(guān)的細胞或分子，如調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cells，Tregs)、骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、吲哚胺2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)、T 細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)和淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)等；④來自宿主環(huán)境的標志，如腸道菌群、胚系基因特征等[3]。在這些標志物中，大部分可用于鑒別有效、無效甚至有害人群，即為預測標志物；少數(shù)兼有預測療效和判斷預后的作用，即同時為預測和預后標志物。

2 免疫治療正性療效預測的生物標志物

2.1PD-L1 在腫瘤及其微環(huán)境中，PD-L1分為組成型表達和誘導型表達。目前認為，組成型表達是PD-L1基因在腫瘤組織中的固有表達，與免疫治療療效預測關(guān)系不大；而誘導型表達是指PD-L1在干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等分子的作用下出現(xiàn)的適應性聚焦表達，可導致腫瘤局部出現(xiàn)抑制性炎癥微環(huán)境，這也恰恰為腫瘤免疫治療提供了靶點[4]。

已經(jīng)證實，PD-L1表達有如下特征：①呈連續(xù)性表達模式，即腫瘤中可能有0%～100%的細胞表達PD-L1；②表達可能隨著治療(免疫、化療、放療或抗血管生成治療等)發(fā)生改變；③不同瘤種、不同組織學類型的腫瘤以及同一腫瘤內(nèi)部不同區(qū)域的PD-L1表達不同。目前已有多項臨床試驗和薈萃分析認為PD-L1可以作為預測晚期NSCLC免疫治療療效(包括單藥免疫治療及免疫聯(lián)合化療等)的生物標志物[5]。由于證據(jù)確鑿，自2019年起，PD-L1檢測得到了NCCN和CSCO晚期NSCLC診療指南的一致推薦。然而迄今為止，上述指南并沒有明確對腫瘤組織采用免疫組化法檢測PD-L1表達時采用何種方法和平臺。

雖然PD-L1是目前臨床上已被廣泛接受的免疫治療正性療效預測的生物標志物，然而，它是不完美的療效預測生物標志物[6]。首先，并非所有的PD-1或PD-L1抑制劑在使用前都需要檢測PD-L1。2019年8月，國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批準DAKO公司生產(chǎn)的PD-L1檢測試劑盒(克隆號：22C3)在中國上市，用于輔助鑒別可使用帕博利珠單抗(pembrolizumab)治療的NSCLC患者。2019年12月，NMPA批準DAKO公司的另一款PD-L1檢測試劑盒(克隆號：28-8)上市，用于輔助鑒別使用納武利尤單抗(nivolumab)治療的非鱗狀NSCLC患者。但是，22C3抗體適用于伴隨診斷，而28-8抗體僅適用于補充診斷。第二，并非所有PD-L1陽性患者都對免疫治療有效。以晚期NSCLC為例，PD-L1陽性患者采用pembrolizumab進行一線或二線單藥治療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)<50%，PD-L1 陰性患者也有10%～20%的ORR。第三，PD-L1表達的檢測平臺不一致。Blueprint II研究對多種檢測平臺的一致性進行了對比，發(fā)現(xiàn)22C3、28-8和SP263抗體的一致性高，而SP142和73-10抗體的一致性較差。雖然這5種檢測試劑盒/抗體均在美國獲批上市，但唯有DAKO 22C3 被FDA批準作為伴隨診斷的PD-L1檢測試劑(其他為補充診斷)。第四，PD-L1的表達具有時空異質(zhì)性。有研究比較了晚期NSCLC不同時間點、不同轉(zhuǎn)移器官組織中PD-L1的表達情況，發(fā)現(xiàn)不僅表達水平相差巨大，而且直接影響了患者接受免疫治療的無進展生存期(progression-free survival，PFS)。第五，PD-L1表達的檢測細胞有待進一步明確。大部分抗體只要求檢測腫瘤細胞，但是PD-L1抑制劑阿特珠單抗(atezolizumab)卻要求同時檢測免疫細胞和腫瘤細胞。

2.2TMB TMB是指腫瘤基因組去除胚系突變后的非同義突變的體細胞突變數(shù)量。新抗原是腫瘤特異性突變產(chǎn)生的多肽表位(抗原決定基)，具有結(jié)合主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)分子并被呈遞的功能。免疫原性是指由體細胞突變產(chǎn)生“非己”成分(轉(zhuǎn)化為多肽表位)能夠被T細胞識別引起腫瘤清除的免疫反應特性。目前認為，腫瘤TMB越高，新抗原產(chǎn)生就越多，腫瘤免疫原性就越高，因此，T細胞抗腫瘤反應越強[7]。

大量研究以及Meta分析已經(jīng)表明，TMB與PD-1/PD-L1抑制劑在多個瘤種中的療效相關(guān)[8-10]。CheckMate 026研究的探索性分析顯示，TMB與單藥nivolumab一線治療晚期NSCLC的PFS呈正相關(guān)。CheckMate 227研究第一部分的結(jié)果顯示：TMB≥10 mut/Mb的NSCLC患者，無論PD-L1表達如何，nivolumab+伊匹單抗(ipilimumab)的PFS均優(yōu)于化療。BF1RST研究的中期結(jié)果顯示，高液態(tài)TMB(b-TMB)亞組(≥16 mut/Mb)，atezolizumab療效有優(yōu)于化療的趨勢。Mystic研究的探索性終點顯示，高b-TMB亞組(≥2016 mut/Mb)，德瓦魯單抗(durvalumab)和durvalumab+替西木單抗(tremelimumab)療效均有優(yōu)于化療的趨勢?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，NCCN指南認為TMB是新興的療效預測生物標志物，TMB檢測也已經(jīng)寫入CSCO指南。

然而，TMB也是不完美的療效預測生物標志物。第一，TMB并非總是與免疫檢查點抑制劑治療的應答相關(guān)，其原因是腫瘤以逐步進化的方式發(fā)展，從而創(chuàng)造了克隆層級；克隆性突變(或同質(zhì)性腫瘤)產(chǎn)生的新抗原可能比來自亞克隆突變(或異質(zhì)性腫瘤)的新抗原更能有效引起腫瘤免疫應答[11]。第二，b-TMB并不能取代組織TMB，兩者是互相補充的關(guān)系。如果等位基因突變?yōu)榈拓S度的有意義的突變，b-TMB可能檢測不到，這樣可能出現(xiàn)b-TMB少于組織TMB的情況；另一方面，由于腫瘤組織空間的異質(zhì)性以及克隆分支等原因，b-TMB檢測出的亞克隆計數(shù)會多于組織TMB，但卻不一定有意義[4]。第三，TMB與PD-L1表達通常呈不/弱相關(guān)。已有多項研究證實，高TMB和PD-L1高表達人群只有非常少的交叉。第四，關(guān)于TMB的檢測技術(shù)、平臺、截斷值等均不得而知[12]。二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)檢測TMB分析非常費時，價格昂貴，技術(shù)要求高，提供的數(shù)據(jù)復雜；TMB閾值尚無明確定義。第五，TMB與免疫聯(lián)合化療的療效關(guān)系不明。來自KEYNOTE-021、189和407研究的結(jié)果顯示，無論組織學類型，還是通過全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)評估的TMB與pembrolizumab+含鉑化療或單用含鉑化療的療效之間均無顯著相關(guān)性。

2.3MSI-H/dMMR MMR系統(tǒng)是生物進化的“保衛(wèi)者”，具有修復DNA堿基錯配的功能，可以維持基因組的穩(wěn)定性和降低自發(fā)性突變。人類的MMR系統(tǒng)含有9個錯配修復基因MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6、MLH1、MLH3、PMS1及PMS2等，其中以MLH1和MSH2功能最為重要，負責最主要的修復任務。MSI-H常由dMMR引起[13]。多項臨床研究表明，MSI-H/dMMR實體瘤可從免疫治療中顯著獲益[12]。基于5個臨床試驗共149例患者ORR為 39.6%的結(jié)果，2018年5月23日，F(xiàn)DA宣布加速批準pembrolizumab用于對具有特定遺傳(生物標志物)特征的癌癥患者的治療。這是FDA首次不依照腫瘤的組織來源，而是基于生物標志物批準的抗腫瘤療法[14]。

MSI是遺傳不穩(wěn)定性的標志物，因此，伴有不穩(wěn)定基因組的腫瘤可同時表現(xiàn)為MSI-H和高TMB[15]。大多數(shù)(83%)MSI-H的樣本同時表現(xiàn)為高TMB，然而，僅16%高TMB樣本表現(xiàn)為MSI-H。這兩種表型同時出現(xiàn)與腫瘤類型高度相關(guān)，如高TMB和MSI-H同時出現(xiàn)在胃腸道腫瘤中，但是在伴高TMB的黑色素瘤、肺癌和鱗狀細胞癌中，MSI-H并不常見。因此，MSI-H與TMB是部分重疊的療效預測生物標志物。

2.4其他新興的療效預測標志物 除上述3個已被臨床公認的正性療效預測生物標志物之外，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-I分子的多樣性及特定T細胞亞群T細胞受體(T cell receptor，TCR)的克隆性等也是新興的、值得關(guān)注的標志物。HLA基因能夠“教”免疫系統(tǒng)中的T細胞識別“自己”和“異己”，擁有更多樣化HLA基因意味著免疫系統(tǒng)更有能力識別不屬于機體內(nèi)部的“東西”；已有研究表明，HLA-I類分子多樣性越高，免疫治療療效越好；如果合并突變負荷高，免疫治療療效就最好[16]。

機體內(nèi)所有的TCR構(gòu)成了TCR庫，其多樣性直接反映了機體免疫應答的狀態(tài)。TCR庫的瘤內(nèi)異質(zhì)性可能和基因組的瘤內(nèi)異質(zhì)性密切相關(guān)，與患者術(shù)后的復發(fā)風險成正相關(guān)。最新研究表明，CD+8PD-L1+T細胞TCR克隆多樣性更高，免疫治療響應越好[17]。

3 免疫治療負性療效預測的生物標志物

3.1STK11基因突變 STK11基因又名LKB1基因，其突變能調(diào)節(jié)冷腫瘤免疫微環(huán)境，是非鱗NSCLC PD-1抑制劑原發(fā)耐藥的重要因素。已有研究證明，無論pembrolizumab還是durvalumab治療晚期NSCLC，STK11突變或KEAP1突變均與免疫治療療效呈負相關(guān)。而且，TMB和PD-L1的腫瘤細胞陽性比例分數(shù)(tumor proportion score，TPS)狀態(tài)未影響到STK11突變或KEAP1突變NSCLC患者接受免疫治療的結(jié)果[18]。

3.2PTEN基因缺失 PTEN基因缺失可導致PI3K通路增強，進而致IFN-γ、顆粒酶B基因表達降低以及CD+8T細胞數(shù)目減少。在晚期黑色素瘤中，PTEN缺失與TILs減少正相關(guān)，PTEN表達與抗PD-1治療反應相關(guān)[19]。在子宮平滑肌肉瘤中，PTEN缺失導致新抗原減少，進而導致免疫治療耐藥[20]。

3.3轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)上調(diào) TGF-β是一種重要的免疫抑制分子，主要通過刺激組織纖維化和細胞外基質(zhì)沉積，抑制免疫功能，促進血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2018年，《Nature》同期發(fā)表兩篇文章[21-22]，分別從基礎(chǔ)及臨床兩方面揭示腫瘤相關(guān)成纖維細胞分泌的TGF-β通過清除T細胞介導PD-L1抑制劑耐藥，與atezolizumab的療效負相關(guān)。

3.4β-catenin信號通路激活 一方面，β-catenin通過促進ATF3 的轉(zhuǎn)錄，抑制T細胞浸入腫瘤局部。另一方面，Wnt/β-catenin通路激活，提升Tregs存活能力，誘導CD+4T細胞向Th17分化，促使樹突狀細胞分泌IL-10/12，抑制CD+8T細胞功能，從而抑制機體抗腫瘤免疫應答。

3.5JAK突變 由腫瘤特異的T細胞產(chǎn)生的IFN-γ，能識別腫瘤細胞或抗原呈遞細胞上的相應受體，從而發(fā)揮免疫效應。腫瘤細胞上IFN-γ通路相關(guān)蛋白，如IFN-γ受體(IFNGR1與IFNGR2)、IFN-γ受體鏈(JAK1與JAK2)、STATs及IRF1等突變與缺失，下游免疫反應無法啟用(MHC-I與PD-L1)，導致免疫治療耐藥[23]。

3.6HLA-I表達缺失 B2M參與HLA-I類分子折疊和轉(zhuǎn)運到細胞膜。對基線和免疫治療復發(fā)后的樣本進行NGS檢測，發(fā)現(xiàn)B2M突變。B2M突變能使腫瘤細胞膜表面的HLA-I表達缺失，無法實現(xiàn)抗原呈遞，CD+8T細胞從而失去識別功能[24]。

3.7HLA-I等位基因的雜合性缺失 HLA-I等位基因雜合性缺失即HLA-I純合型。臨床研究表明，至少一個位點HLA-I(A&B&C)純合型及突變負荷低的患者，免疫治療不獲益[25]。

4 腫瘤免疫治療的預測和預后生物標志物

根據(jù)預后生物標志物的定義，并不存在免疫治療的預后標志物一說。前文提到的PD-L1、TMB，都不是腫瘤的預后生物標志物。最新研究表明，PD-L1表達越高，靶向治療耐藥出現(xiàn)越早，PD-L1高表達是靶向用藥的負性預測指標；當淋巴細胞浸潤被用作NSCLC的預后標志物時，細胞增殖、PD-L1、吸煙史和組織學應該予以考慮[26]。雖然CheckMate 227研究提示TMB雖然同時具有預測和預后價值，但CheckMate 026認為高TMB患者化療效果更差；迄今為止，仍認為TMB只有預測免疫治療療效的價值[27]。

T細胞炎癥微環(huán)境是惡性腫瘤的正向預后標志物[28]，目前有研究認為它還是免疫治療的療效預測標志物。炎性基因表達譜(gene expression profiling，GEP)是檢測特定細胞或微環(huán)境中基因RNA水平表達，可反映細胞功能或評估微環(huán)境狀況；炎性GEP可反映腫瘤微環(huán)境中免疫細胞狀況，包含了細胞類型、數(shù)量、功能、定位等信息。一項涉及20個瘤種的313例患者的回顧性研究，分析了PD-1抑制劑療效和18個炎癥基因表達水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GEP評分高的患者亞組，ORR更高，PFS更長[29]。雖然TMB與GEP可以獨立預測療效，但是將兩者聯(lián)合起來，預測效果會更好。對KEYNOTE系列研究匯總顯示，在泛實體瘤、頭頸部鱗癌和NSCLC等3個隊列中，ORR和PFS獲益患者均為：TMBhiGEPhi>TMBlo或GEPlo>TMBloGEPlo [30]。

體細胞拷貝數(shù)變異(somatic copy number alterations，SCNA)包括非整倍體、亞二倍體、超二倍體、四倍體等，是惡性腫瘤的負性預后標志物。最新研究表明，它是免疫治療療效的正向預測標志物。在多種腫瘤中，全染色體SCNA與免疫浸潤呈負相關(guān)；在ipilimumab治療黑色素瘤時，SCNA與TMB可以一起用于預測療效，勝過其中任一指標；而且，SCNA可以獨立用于預測療效。其機制可能是SCNA導致免疫活性相關(guān)基因缺失，如HLA基因。

5 結(jié)束語

目前關(guān)于免疫治療療效預測的標志物研究主要集中在預測正向療效的PD-L1、TMB和MSI-H/dMMR上，其中又以PD-L1在臨床應用上的認可度最高。HLA-I分子的多樣性、TCR庫的克隆性和T細胞炎性GEP有望成為新興的正性療效預測標志物。免疫治療負性療效預測的生物標志物則主要包括特定基因的突變、免疫抑制分子或免疫抑制細胞等，但這方面的研究還剛剛起步，尚不能成為臨床應用的證據(jù)。現(xiàn)有的研究表明，僅有T細胞炎性GEP和SCNA，既是腫瘤的預后生物標志物，也是免疫治療的療效預測標志物。尋找和發(fā)現(xiàn)最佳的腫瘤免疫治療的預測和預后標志物，依然道阻且長。