蔣 琳,楊志偉

(廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西高校特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530004)

裸燕麥俗稱(chēng)莜麥,是燕麥的一種,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,其中蛋白含量約13%～17%,是大米的3倍,面粉的1.6倍，具備人體所含的8種必需氨基酸,有“超級(jí)谷物”之稱(chēng)[1]。裸燕麥蛋白含量在谷物蛋白中居于首位,其中球蛋白含量超過(guò)50%。由于裸燕麥蛋白本身的理化性質(zhì)較差,致使裸燕麥的加工特性低,限制其研發(fā)與應(yīng)用[2-3]。為了改良裸燕麥蛋白的相關(guān)理化性質(zhì),并使之具有一定功能性,擴(kuò)寬裸燕麥資源的開(kāi)發(fā)前景,可以對(duì)裸燕麥蛋白進(jìn)行改性處理[4]。而糖基化改性是較為理想的一種改性方式,是在沒(méi)有任何化學(xué)試劑參與下,通過(guò)蛋白質(zhì)或多肽的游離氨基與還原糖中羥基化合物在常溫或者加熱時(shí)發(fā)生的共價(jià)結(jié)合的美拉德改性,生成蛋白-糖共價(jià)復(fù)合物[5]。

β-葡聚糖,一種結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖,是葡萄糖通過(guò)β-(1→3),(1→4)糖苷鍵連接而成的高分子聚合物,特有的高黏性使其與蛋白質(zhì)復(fù)合能增加乳化液的乳化穩(wěn)定性,增強(qiáng)蛋白凝膠性,且具有降低血糖,增強(qiáng)免疫力的功效[6-7]。然而,β-葡聚糖作為一種功能性?xún)?yōu)越的多糖,在蛋白質(zhì)的糖基化改性中應(yīng)用較少[8]。

此外,在近年來(lái)的研究中發(fā)現(xiàn),超聲波技術(shù)處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)、剪切力、空化作用等對(duì)于提高改性速率,改善產(chǎn)物性質(zhì)有著重要的作用[9]。目前,關(guān)于超聲波輔助糖基化改性的研究多集中在谷物蛋白與葡萄糖、乳糖等小分子糖的復(fù)合,對(duì)于蛋白與分子量較大的葡聚糖的糖基化改性的工藝研究以及相關(guān)理化和功能性質(zhì)的研究較少[4,10-12]。因此,本文將采用超聲波輔助裸燕麥蛋白與β-葡聚糖進(jìn)行糖基化改性,研究超聲處理對(duì)裸燕麥蛋白分子結(jié)構(gòu)和溶解特性的影響,使溶液體系中的自由氨基數(shù)量增多,更多的游離氨基與β-葡聚糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合,從而促進(jìn)糖基化產(chǎn)物的生成。研究不同反應(yīng)條件(超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比)對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響,通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件,為后續(xù)糖基化改性產(chǎn)物的理化和功能性的研究提供基礎(chǔ)[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裸燕麥米 市售;β-葡聚糖(≥98%) 西安千葉草生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(O Phthalic Aldehyde,OPA) 源葉生物有限公司;十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、無(wú)水碳酸鈉(≥99.8%) 天津博迪化工股份有限公司;酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);氫氧化鈉、硫酸銅 分析純,成都金山化學(xué)試劑有限公司;甲醇 分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;Folin-酚 北京索萊寶科技有限公司。

HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HJ-3控溫磁力攪拌器 江蘇金怡儀器科技有限公司;TLE204E分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 山東省濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司;TECAN酶標(biāo)儀 上海勒菲生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裸燕麥蛋白的制備 裸燕麥粉碎過(guò)40目篩,正己烷1∶3 (W/V)振蕩脫脂,過(guò)濾后在通風(fēng)櫥下放置,待正己烷揮發(fā)完全后即可。脫脂裸燕麥粉與蒸餾水按1∶13 (W/V)的比例混合,用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至10,40 ℃下磁力攪拌90 min,4000 r/min離心20 min,取上清液[15]。用 1 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH至4.3,靜置30 min后4000 r/min離心20 min,沉淀物水洗兩次調(diào)pH至7,透析48 h后冷凍干燥。

1.2.2 裸燕麥蛋白/β-葡聚糖糖基化復(fù)合物的制備 稱(chēng)取一定量的裸燕麥蛋白(精確到0.001),用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為1%的蛋白溶液,按照一定的糖/蛋白質(zhì)量比加入β-葡聚糖,磁力攪拌20 min使溶液混合均勻。密封后放入超聲裝置中,在一定的超聲功率、一定的超聲溫度下進(jìn)行糖基化改性反應(yīng),反應(yīng)一定時(shí)間后取出冰浴冷卻。5000 r/min離心20 min,將上清液冷藏備用[16]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了使裸燕麥蛋白與β-葡聚糖糖基化反應(yīng)更完全,接枝度更高,糖基化產(chǎn)物理化性質(zhì)更好,本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助工藝,通過(guò)超聲處理改變裸燕麥蛋白的溶解特性,使體系中的自由氨基增多,促進(jìn)β-葡聚糖與裸燕麥蛋白的共價(jià)結(jié)合[10]。因此,本實(shí)驗(yàn)的單因素實(shí)驗(yàn)以溶解度和接枝度為指標(biāo),探究超聲波處理對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響,為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的確定提供依據(jù)。

1.2.3.1 超聲功率對(duì)裸燕麥蛋白/β-葡聚糖糖基化改性的影響 在β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲時(shí)間60 min、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲功率在0、120、180、240、300 W條件下對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 在質(zhì)量比2∶1、超聲溫度70 ℃、超聲功率240 W、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲時(shí)間在0、30、60、90、120 min條件下對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.3 超聲溫度對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 在質(zhì)量比2∶1、超聲功率240 W、超聲時(shí)間60 min、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究超聲溫度在50、60、70、80、90 ℃條件下對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.3.4β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比對(duì)裸燕麥蛋白糖基化的影響 在超聲功率240 W、超聲時(shí)間60 min、超聲溫度70 ℃、pH7.0條件下,以接枝度和溶解度為指標(biāo),研究β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比在1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1條件下對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比作為自變量,根據(jù) Box-Behnken 設(shè)計(jì)建立四因素三水平試驗(yàn),以接枝度為響應(yīng)值,通過(guò)響應(yīng)面分析對(duì)裸燕麥蛋白與β-葡聚糖的接枝條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)糖基化改性工藝條件。水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of RSM

1.2.5 接枝度的測(cè)定 稱(chēng)取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中,分別加入20%(W/V)SDS溶液2.5 mL,0.1 mol/L硼砂溶液25 mL,β-巰基乙醇100 μL,混合均勻后用蒸餾水定容至50 mL,得到OPA試劑。取4 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL糖基化后的上清液,混合均勻后于35 ℃水浴2 min,在340 nm處測(cè)定溶液吸光值,同時(shí)作空白對(duì)照[15]。

接枝度(%)=[A1-(A2-A0)]÷A1×100

式中:A1-相同條件下未參與糖基化改性的溶液吸光度值;A2-糖基化改性后溶液吸光度值;A0-相同條件下糖空白對(duì)照溶液的吸光度值。

1.2.6 溶解度的測(cè)定 采用福林酚法[16]測(cè)定上述上清液中溶解的蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為5次重復(fù)的均值,均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。數(shù)據(jù)采用Origin 8.0與Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析和圖像處理。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖1可以看出,隨著超聲功率的增加,裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝度和溶解度呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率達(dá)到240 W時(shí),接枝度為最大值32.36%±1.16%,溶解度達(dá)到12.87%±0.12%,之后隨著超聲功率的增大，接枝度和溶解度都逐漸減小。這可能是因?yàn)槌曁幚懋a(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械剪切作用使得蛋白質(zhì)分子發(fā)生機(jī)械性振蕩,蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,使原本有序的螺旋結(jié)構(gòu)中次級(jí)鍵斷裂,肽鏈打開(kāi),蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)疏松[17],同時(shí),超聲處理使得蛋白質(zhì)分子表面的自由氨基和羧基之間的靜電引力被打斷,蛋白質(zhì)分散開(kāi)來(lái),隨著超聲功率的增大,蛋白質(zhì)溶解度增大,溶液體系中自由氨基增多,接枝改性結(jié)合位點(diǎn)也相應(yīng)增多,接枝度增大[18]。但是,過(guò)大功率的超聲處理產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)使得蛋白局部溫度過(guò)高,使得原本展開(kāi)的肽鏈發(fā)生聚合,使得蛋白溶解度減小。接枝改性位點(diǎn)被掩蓋,使得蛋白糖基化改性受阻[19],接枝度下降。

圖1 超聲功率對(duì)裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖2可以看出,隨著超聲時(shí)間的不斷增加,裸燕麥蛋白糖基化改性體系中,接枝度先增大后減小,在超聲時(shí)間為90 min時(shí),接枝度達(dá)到最大值32.59%±1.34%。溶解度在90 min時(shí)達(dá)到12.3%±0.18%,之后趨于平緩。這可能是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的空化作用和熱效應(yīng)使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)疏松[20],蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速率增大,增強(qiáng)了蛋白的溶解性,同時(shí)也增加了自由氨基與β-葡聚糖分子的碰撞機(jī)率,接枝度升高。但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),使得原本斷裂的肽鏈重新聚合,蛋白的疏水性基團(tuán)增多,溶解度降低[21-22],同時(shí),可與糖分子結(jié)合的自由氨基位點(diǎn)被掩埋,接枝度下降。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.3 超聲溫度對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的影響 從圖3可以看出,隨著超聲溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先增高后緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度在70 ℃時(shí),接枝度達(dá)到最大值33.49%±1.66%。溶解度在70～80 ℃之間下降,80～90 ℃開(kāi)始上升(通過(guò)差式掃描量熱儀測(cè)得,裸燕麥蛋白變性溫度為89 ℃)。這可能是由于隨著改性的進(jìn)行,蛋白質(zhì)分子與β-葡聚糖結(jié)合,引入了親水性羥基,在一定程度上從空間上保護(hù)了蛋白質(zhì),使蛋白質(zhì)不易聚集,溶解度增大[22]。溶液體系中自由氨基增多,接枝改性速率也就增大。隨著溫度的升高,改性進(jìn)一步進(jìn)行,裸燕麥蛋白糖基化改性進(jìn)入美拉德最終階段,產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)生成類(lèi)黑精,并與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用阻礙了糖基化改性的進(jìn)行[22-23]。同時(shí),高溫使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性,空間結(jié)構(gòu)被破壞,鏈與鏈之間的分子間氫鍵容易聚集成團(tuán),不易被溶解[24],從而使得溶解度和接枝度降低。

圖3 超聲溫度對(duì)裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.1.4β-葡聚糖與裸燕麥蛋白質(zhì)量比對(duì)裸燕麥蛋白糖基化的影響 從圖4可以看出,隨著溶液體系中糖濃度的增高,接枝度先增大后減小。當(dāng)糖/蛋白質(zhì)量比為2∶1時(shí),接枝度達(dá)到最大值31.66%±0.76%,隨后接枝度緩慢下降。這可能是因?yàn)樵谶m當(dāng)?shù)奶菨舛确秶鷥?nèi),糖濃度的增大使得自由氨基與β-葡聚糖分子羥基的碰撞結(jié)合機(jī)率增大,促進(jìn)接枝改性的進(jìn)行,接枝度增大[25]。然而,當(dāng)糖濃度過(guò)高,溶液粘性變大,流動(dòng)性變小,使得分子間的相互作用緩慢。另外,由于β-葡聚糖為大分子糖,過(guò)高的糖濃度產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)進(jìn)一步阻礙了接枝改性的進(jìn)行[26]。同時(shí),溶解度隨著糖濃度的增高而增大之后趨于平穩(wěn)。這可能是由于接枝度的增大引入了更多的親水性基團(tuán),但當(dāng)接枝改性受阻后,溶液體系處于飽和狀態(tài),溶解度趨于平緩[27]。

圖4 糖/蛋白質(zhì)比對(duì)裸燕麥蛋白 糖基化改性接枝度和溶解度的影響Fig.4 Effects of mass ratio on the degree of grafting and solubility of OP glycosylation

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸分析,可以獲得接枝度關(guān)于超聲功率A、超聲時(shí)間B、超聲溫度C、糖/蛋白質(zhì)量比D的二次多元回歸方程為:

接枝度(%)=37.29+1.85A+4.93B+0.031C-1.288D+0.84AB+1.50AC+1.36AD+1.36BC+1.76BD+2.97CD-11.22A2-5.38B2-3.22C2-4.62D2

2.2.2 響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖分析 圖5～圖10分別給出了超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、糖/蛋白質(zhì)量比對(duì)糖基化改性裸燕麥蛋白接枝度影響的響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖。從響應(yīng)面圖可知,在因素較低水平條件下響應(yīng)值隨著每個(gè)因素的增大而增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,又逐漸減小。由表3和圖5分析可知,在響應(yīng)組合試驗(yàn)中,超聲時(shí)間B不顯著(P>0.05),對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝程度影響不大,在一定時(shí)間內(nèi),隨著超聲溫度的升高,接枝度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),且超聲溫度C的一次項(xiàng)極顯著(P<0.0001)影響接枝度大小。同時(shí),BC響應(yīng)面的等高線(xiàn)圖密集呈橢圓狀,由此也說(shuō)明超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用顯著,交互作用對(duì)接枝度影響較大。從表3和圖6～圖10可知,超聲功率A、超聲時(shí)間B、糖/蛋白質(zhì)量比D的一次項(xiàng)均極顯著(P<0.0001)影響裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝程度。同時(shí),由方差表中可以看出,AB、AC、AD、BD、BC的交互項(xiàng)都呈現(xiàn)極顯著性(P<0.0001),且等高線(xiàn)圖呈橢圓狀,表明AB、AC、AD、BD、BC的交互項(xiàng)均極顯著影響接枝度的大小。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the regression model

注:*:P<0.05表示顯著,**:P<0.01表示極顯著。

圖5 超聲時(shí)間與溫度交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.5 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic time and ultrasonic temperature on grafting reaction

圖6 超聲溫度與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.6 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic temperature and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖7 超聲時(shí)間與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic time and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖8 超聲功率與糖/蛋白質(zhì)量比交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.8 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and sugar/protein mass ratio on grafting reaction

圖9 超聲功率與溫度交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.9 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and ultrasonic temperature on grafting reaction

圖10 超聲功率與時(shí)間交互作用對(duì)接枝度影響的曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.10 Surface and contour plots of mutual-influence of ultrasonic power and ultrasonic time on grafting reaction

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0對(duì)方程求極大值,得出超聲輔助裸燕麥蛋白糖基化改性的最優(yōu)理論條件為超聲功率240.93 W,超聲時(shí)間94.20 min,超聲溫度74.86 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2.11∶1,此時(shí)接枝度為37.33%±1.68%。結(jié)合到實(shí)際操作的可行性,選擇以下實(shí)驗(yàn)條件:超聲功率240 W,超聲時(shí)間95 min,超聲溫度75 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1。在此條件下,進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到裸燕麥蛋白糖基化改性的接枝度為35.79%±0.86%。達(dá)到預(yù)測(cè)值的95.03%,與未超聲處理,加熱溫度75 ℃,加熱時(shí)間95 min,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,條件下的接枝度15.3%±0.63%相比,提高了2.34倍。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)討論了不同改性條件對(duì)裸燕麥蛋白糖基化改性中接枝度的影響,通過(guò)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)建立了超聲輔助裸燕麥蛋白糖基化改性工藝的模型,并對(duì)此模型進(jìn)行了優(yōu)化,得到裸燕麥蛋白糖基化改性的最優(yōu)工藝條件為超聲時(shí)間95 min,超聲功率240 W,超聲溫度75 ℃,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,在此條件下,糖基化改性的接枝度達(dá)35.79%±0.86%,約為未超聲條件下(溫度75 ℃,加熱時(shí)間95 min,糖/蛋白質(zhì)量比2∶1,接枝度為15.3%±0.63%)的2.34倍。采用超聲波輔助蛋白質(zhì)糖基化改性,成本低,效率高。同時(shí),最優(yōu)工藝條件下的裸燕麥蛋白糖基化改性產(chǎn)物的制備也為后續(xù)研究其理化和功能性提供基礎(chǔ),有利于裸燕麥蛋白資源在食品中的開(kāi)發(fā)和利用,提高經(jīng)濟(jì)效益。