高林森，溫吉更，李亞麗，郭燁

（河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟研究所，河北石家莊050051）

桑葉中含有多種功能性成分，開發(fā)利用價值很廣。近年來，學(xué)者們對桑葉進行研究，發(fā)現(xiàn)桑葉中含有黃酮類、生物堿、植物甾醇等物質(zhì)，且多糖、氨基酸、維生素等含量豐富[1]。桑葉黃酮的功效是多方面的，它是一種很強的抗氧劑，可有效清除體內(nèi)的自由基，抗氧化作用可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生[2-6]。

但是桑葉中黃酮的含量與桑品種、產(chǎn)地、季節(jié)以及葉位等都有顯著相關(guān)性。劉利等[7]研究表明，長穗桑、華桑葉片總黃酮含量分別為63.92、61.17 mg/g，極顯著高于其它桑種，白桑則極顯著低于其它桑種。俞燕芳等[8]的試驗結(jié)果表明，產(chǎn)地不同桑葉總酚、總黃酮的含量及其體外抗氧化活性有顯著差異，其中江西永新地區(qū)“農(nóng)桑14 號”總酚和總黃酮的含量最高。張麗麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種、不同生長期桑葉中的生物堿類、黃酮類成分含量差異較大，黃酮類成分的含量變化較小，10 月份之后亦呈下降趨勢。

近些年來大健康觀的地位與意義正在不斷提升[10]，河北省也在大力對藥食同源名單上特色果樹的醫(yī)學(xué)功能展開研究[11-14]，桑樹不僅是河北省的一種特色藥食同源果樹，而且在河北省的某些地區(qū)也有大面積的種植，因此本試驗對河北省大面積種植地區(qū)的桑葉進行了采摘，并對其總黃酮含量進行了對比分析。為河北省桑葉的產(chǎn)品研發(fā)及黃酮的有效利用提供了有力的科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

桲欏、冀 2、冀 3、冀 4、湖桑 32 號：承德市；無核大十、黑珍珠、紅果2 號、白玉王：邢臺市；黑珍珠、臺灣長桑：滄州市；黑珍珠、桂花蜜、紅果2 號、白葚子：衡水市。桑葉樣品采摘時間為6 月～9 月。

1.1.2 試驗藥品

硝酸鈉、鎂粉、硝酸鋁：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；蘆?。荷虾Ｋ剐派锟萍加邢薰?；氫氧化鈉：天津市大陸化學(xué)試劑廠；乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LGJ-18 冷凍干燥箱：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；KQ-500DB 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-98-II 恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；RS2200QUC 超純水機：上海樂楓生物科技有限公司；UVmini-1240 分光光度計：SHIMADZU 島津有限公司；REVCO EXF-80 ℃冰箱：美國 REVCO EXF 公司。

1.2 方法

1.2.1 桑葉的處理

1）冷凍干燥：以承德產(chǎn)區(qū)桲欏桑為試驗樣品，稱取鮮桑葉100 g 左右，在-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍1 h，再進行真空冷凍干燥，冷阱溫度-50 ℃左右，真空度0.025 MPa，冷凍干燥6 h。干燥后的桑葉粉碎待測[15]。

2）自然晾干：以承德產(chǎn)區(qū)桲欏桑為試驗樣品，稱取鮮桑葉100 g 左右，放于室溫20 ℃下晾干，將干燥后的桑葉粉碎待測[16]。

3）真空干燥法：以承德產(chǎn)區(qū)桲欏桑為試驗樣品，稱取桑葉100 g 左右平鋪于托盤中，于真空干燥箱中干燥。干燥條件分別為65 ℃、100 min 將干燥后的桑葉粉碎，待測[17]。

將處理后的桑葉用粉碎機打成粉末，過40 目篩子，備用。準(zhǔn)確稱取1.00 g 桑葉粉放于具塞試管，溶于70 %的乙醇，料液比 1 ∶40（g/mL），超聲混勻，放于70 ℃恒溫水浴鍋下恒溫水浴提取2 h，過濾去除提取液的雜質(zhì)，抽濾濃縮到20 mL。

1.2.2 總黃酮含量的檢測

取1 mL 待測提取液于試管中，加入5%NaNO3500 μL 后搖勻，靜置6 min。然后加入10%Al（NO3）3500 μL，靜置 6 min。最后加入 4%NaOH 1 mL，用 70%乙醇定容至5 mL，靜置15 min 后在510 nm 波長下測吸光度，用70%乙醇作為空白對照。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱300.0 mg 蘆丁，用70%酒精定容到100 mL，超聲混勻，得到最初3 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后把最初標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，得到中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，中間標(biāo)準(zhǔn)濃度為2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。然后吸取 1 mL 一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入5%NaNO3500 μL 后搖勻，靜置6 min。然后加入10%Al（NO3）3500 μL，靜置6 min。最后加入4%NaOH 1 mL，用70%乙醇定容至5 mL，靜置15 min后在510 nm 波長下測吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到了蘆丁濃度Y 與吸光度值x 的關(guān)系曲線的回歸方程為：Y=0.127 5x+0.031 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 6。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同生長地區(qū)桑葉中總黃酮含量比較

通過查找大量文獻和實地調(diào)研[18-20]，了解到河北省大面積栽桑樹的地區(qū)有邢臺、泊頭、獻縣、衡水和承德等地，由于地區(qū)和氣候的不同，泊頭、獻縣、衡水和邢臺主栽桑樹的品種為黑珍珠，另外為了桑果的收益會栽種其它品種桑樹，比如桂花蜜、紅果二號、臺灣長桑（南方桑樹品種）和白葚子等，而承德地區(qū)栽種的桑樹品種較多，其中適應(yīng)性較廣的為桲欏、冀3、冀2、冀4和湖桑32 等桑葉。因此對衡水、獻縣、泊頭和邢臺產(chǎn)區(qū)的黑珍珠桑葉和承德栽種較多的桲欏桑葉，總黃酮含量進行了對比分析（n=5），試驗過程中桑葉的采摘日期相差不超過3 d，桑葉干燥方式均為冷凍干燥。結(jié)果見圖1。試驗結(jié)果表明，不同產(chǎn)地總黃酮含量存在差異，其中承德產(chǎn)地桲欏?？傸S酮的含量最高，為32.65 mg/g，其次是衡水、獻縣、泊頭和邢臺產(chǎn)地的黑珍珠桑葉，分別為 30.25、29.54、29.26、27.02 mg/g。

圖1 不同產(chǎn)地總黃酮含量Fig.1 Total flavonoid content in different producing regions

2.2 不同品種桑葉中總黃酮含量比較

由于承德產(chǎn)區(qū)桑葉品種較多，且桑葉中總黃酮含量比其他產(chǎn)區(qū)都高，因此以承德產(chǎn)區(qū)桑葉為例，對不同品種桑葉中總黃酮含量進行了對比分析。對承德產(chǎn)區(qū)桲欏、冀3、冀2、冀4 和湖桑32 這6 個品種春桑葉中的總黃酮含量進行了測定，結(jié)果見圖2，其中總黃酮含量最高的是桲欏桑葉，含量為29.36 mg/g，其次是冀3、冀2、冀4 和湖桑32，含量分別為27.84、26.69、26.12、22.47 mg/g（n=5）。

圖2 不同品種總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids in different varieties

2.3 不同生長時期桑葉中總黃酮含量比較

選擇桑葉品種較多的承德產(chǎn)區(qū)桑葉，分析不同月份下桑葉中總黃酮含量的差異。本試驗分別采摘了承德產(chǎn)區(qū) 6、7、8 和 9 月份桲欏、冀 3、冀 2、冀 4 和湖桑32 五大品種的桑葉，測得的總黃酮含量見表1。

表1 不同季節(jié)、不同品種桑葉總黃酮含量Table 1 Total flavonoids in mulberry leaves of different seasons and varieties

由試驗結(jié)果可知，不管哪個品種的桑葉，由于季節(jié)的原因，總黃酮的含量變化較大，其中承德夏季剛長出的幼嫩葉子總黃酮含量最高，隨著生長時期的延長，總黃酮含量會降低，其中桲欏桑六月份總黃酮含量的32.65 mg/g，在九月份降低到了27.22 mg/g，降低了16%。

2.4 不同干燥方式桑葉中總黃酮含量比較

不同的干燥方式對桑葉中總黃酮含量會產(chǎn)生一定的影響。

干燥方式對桑葉總黃酮的影響見表2。

由試驗結(jié)果可知，冷凍干燥的桑葉總黃酮含量最高，為30.30 mg/g，有利于桑葉長期保存。其次是自然晾干，含量最低的是烘干方式?？赡苁且驗辄S酮屬于熱敏性物質(zhì)，溫度越高對黃酮的破壞程度越大，黃酮的損失就越大。

表2 干燥方式對桑葉總黃酮的影響Table 2 Effect of drying method on total flavonoids in mulberry leaves

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，河北省主栽的桑樹，在不同生長地域、不同品種、不同生長時期和不同干燥方式桑葉下總黃酮的含量存在差異。其中邢臺、泊頭、獻縣、衡水產(chǎn)區(qū)的種植最多的黑珍珠桑黃酮含量，相比于承德的桲欏桑少。且桲欏桑在桲欏、冀3、冀2、冀4 和湖桑32 五大品種黃酮含量也是做高的為29.36 mg/g。且一般來說春季采摘的桑葉黃酮含量高于秋季的。

對于桑葉的處理方式，其中冷凍干燥法制備的桑葉色澤最好，與新鮮桑葉最為接近，總黃酮的含量也最高，平均含量為30.30 mg/g，真空干燥法制備的桑葉總黃酮含量最低，為25.14 mg/g，且桑葉的色澤也最差，自然晾干的桑葉的總黃酮含量以及色澤都處于中間狀態(tài)，相對于冷凍干燥法，自然晾曬不僅成本低，而且操作簡便，相對于真空干燥法，自然晾曬的桑葉總黃酮含量較高，樣品品質(zhì)較好，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本研究為改善傳統(tǒng)的桑葉利用結(jié)構(gòu)和開發(fā)桑葉的新用途，以及桑葉總黃酮的有效利用提供了科學(xué)依據(jù)。