李雅楠 余利紅 陳新美 楊浩萌 黃火清

（1. 廣州醫(yī)科大學生命科學學院，廣州 511436；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京10081）

對畜禽及魚類等單胃動物而言，磷是其生長的必要元素。在谷物類及粕類飼料中，總磷的60%-70%是以植酸的形式存在的［1］。植酸又名肌醇六磷酸，在單胃動物（如人、豬和雞和魚類等）體內(nèi)，缺乏有效降解植酸的消化酶類，因此對植酸磷的利用率極低，不被消化的植酸磷排出體外導致土地和水資源污染；另一方面，植酸往往與蛋白類、糖類及有益礦物質如鐵、鋅、鈣等鰲合，也是一種抗營養(yǎng)因子，不利于營養(yǎng)物質及礦物質的消化和吸收［2］。因此，為了避免磷缺乏，飼料中往往還要額外添加無機磷（如磷酸氫鈣），這導致飼料成本提高，也造成磷礦這種不可再生資源的浪費［3］。

植 酸 酶（Myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase）是指能夠水解植酸及其鹽類物質中磷酸單酯鍵而生成低級磷酸肌醇和無機磷的一類酶的總稱［4］。飼料用植酸酶的商業(yè)化是在1991年荷蘭關于減少磷對環(huán)境污染立法的背景下啟動的［5］，在隨后的幾十年中，研究者們對植酸酶進行了深入廣泛的研究，一些綜述文章總結了植酸酶的發(fā)展過程［6-12］。植酸酶可以在單胃動物體內(nèi)水解植酸釋放無機磷，作為飼料添加劑，能夠明顯提高植酸磷的利用率，降低動物飼料中無機磷的補充量，同時降低排泄物中的磷含量，減少環(huán)境污染，而且植酸酶降解植酸并釋放出鰲合的有益礦物質，可有效提高飼料中可吸收鐵、鋅、鈣的含量［13］。目前，植酸酶已經(jīng)成為在單胃動物（如豬、雞、魚）飼料中應用最廣的酶制劑之一，其在單胃動物日糧中的添加效果也已經(jīng)得到了廣泛的認同［14］，實現(xiàn)了生態(tài)效益和經(jīng)濟效益的“雙贏”。

植酸酶的作用場所主要是單胃動物的胃及腸道，對于魚類而言，其消化道組成具有很大的多樣性，有的有胃，有的無胃，并且魚類的消化道相對較短，消化道的pH一般為6.5-7.5，接近中性，與豬和雞酸性的消化道有很大區(qū)別，因此，水產(chǎn)飼料里的植酸酶制劑要求在中性pH下具有較高的酶活性；另外由于魚類養(yǎng)殖的水體溫度一般在 0-30℃之間，因此，投放到養(yǎng)魚池的植酸酶需在低溫環(huán)境中具有較高的活性。而到目前為止，在飼料上應用的植酸酶最適pH值主要是酸性的，只能在酸性條件下發(fā)揮水解植酸的能力，在pH高于6.0時，酶活性損失嚴重［15］。但在中性pH值及低溫條件下具有高酶活性的植酸酶報道還很少，因此，開發(fā)中性低溫植酸酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較大的應用潛力和商業(yè)價值。

本研究通過兼并引物和Tail-PCR技術克隆了來自青霉的中性植酸酶基因［16］，并成功將其在畢赤酵母中進行異源表達，并對其酶學性質和動力學參數(shù)進行了分析，為植酸酶在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供了新的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 從自云南錫礦的酸性廢水中分離的青霉 C1菌株（Penicilliumsp. C1）［17］，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為：CGMCC No.4432。pEASY-blunt克隆載體及克隆宿主菌大腸桿菌XL-10購自北京全式金生物技術有限公司；表達宿主菌株畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115由本實驗室保存，表達載體 pPIC9 γ由本實驗室構建并保存。

1.1.2 試劑 植酸鈉購自Sigma公司；Genome Walking Kit（TaKaRa code：D316） 試 劑 盒 購 自TaKaRa公司；實驗所用的限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA 回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；Fly DNA聚合酶及pEASY系列克隆載體購自北京全式金生物技術有限公司；脫糖基化酶 Endo-［β］-N-acetylglucosaminidase H（Endo H）以及T4DNA連接酶為 New England Biolabs公司產(chǎn)品；真菌DNA提取試劑盒購自OMEGA公司（Fungal DNA Mini Kit，D3390-01）；蛋白質分子量標準為上海生化研究所產(chǎn)品；蛋白純化層析介質為Amersham Pharmacia產(chǎn)品；其它所用試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：0.5%酵母提取物，1%NaCl，1%蛋白胨；MD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，生物素4×10-4g/L，YNB 13.4 g/L；BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，甘油10 mL，生物素4×10-4g/L，YNB 13.4 g/L；BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，生物素4×10-4g/L，YNB 13.4 g/L，甲醇0.5%。

1.2 方法

1.2.1 PhyC1成熟蛋白編碼區(qū)的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的真菌HAP植酸酶保守序列RHGVRXPT和HDTN，設計簡并引物HAP-FF和HAP-FR（表1），用于植酸酶基因片段的擴增。

表1 引物名稱及序列信息

提取青霉C1的基因組DNA（詳見Fungal DNA Mini Kit 說明書），并以此為模板，以HAP-FF和HAP-FR為上下游引物，F(xiàn)ly DNA聚合酶擴增植酸酶保守區(qū)DNA序列，用膠回收試劑盒回收該PCR產(chǎn)物，克隆到pEASY-blunt載體上，進行DNA測序，根據(jù)測序結果，設計擴增植酸酶保守基因的側翼序列的特異性引物，5'側翼序列的特異性引物為usp1/2/3；3'側翼序列的特異性引物為dsp1/2/3。特異性引物設計及PCR擴增程序詳見Genome Walking Kit試劑盒說明書。擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，特異性擴增的DNA條帶經(jīng)過瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，送至華大基因進行測序，直至獲得編碼PhyC1成熟蛋白的全長基因序列。

1.2.2 真核表達載體 pPIC9 γ-phyC1的構建 以青霉C1的基因組DNA為模板，以phyC1-mF和phyC1-mR 為上下游引物，用Fly DNA聚合酶擴增植酸酶phyC1基因全長序列，PCR產(chǎn)物帶有限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ的酶切位點（表1黑色斜體），用膠回收試劑盒回收該PCR產(chǎn)物，將其克隆到pEASY-blunt-simple載體上，經(jīng)過DNA測序，獲得正確的帶有phyC1基因的重組質粒，重組質粒經(jīng)SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的pPIC9γ表達載體連接，獲得重組表達載體pPIC9 γ-phyC1。

1.2.3 畢赤酵母的轉化和陽性轉化子篩選 畢赤酵母GS115菌株劃線獲得單克隆，并在YPD液體培養(yǎng)基中過夜生長至OD600=1.6左右，然后根據(jù)Invitrogen手冊的方法制備畢赤酵母感受態(tài)細胞。重組表達載體pPIC9γ-phyC1用BglⅡ酶切線性化后，取2 μg線性化質粒及80 μL感受態(tài)細胞加入電擊杯（0.2 cm Bio Rad）中，電擊（2.1 kV、25 μF、200Ω）轉化，然后涂布在MD平板上，于30℃恒溫箱中培養(yǎng)至長出轉化子，挑選生長旺盛的轉化子在小管中用3 mL BMGY 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后離心棄去培養(yǎng)基，再加入1.5 mL BMMY 液體培養(yǎng)基誘導2 d，測定各管的植酸酶活性，挑選活性高的單克隆作為種子，誘導PhyC1的大量表達。

1.2.4 PhyC1蛋白的誘導表達 將產(chǎn)植酸酶的菌株接種到裝有300 mL BMGY液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，在30℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)48 h用以增加菌體量，然后將培養(yǎng)液在 7 000 r/min 離心 10 min，棄上清，取沉淀（盡量除盡上清），再用100 mL含有0.5%甲醇的BMMY 液體培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)在30℃誘導培養(yǎng)，每隔12 h補加甲醇，使培養(yǎng)基中的甲醇濃度保持在0.5%的終濃度，并且每隔12 h取樣進行酶活測定。

1.2.5 重組植酸酶的純化 將獲取的菌液在4℃、8 000 r/min下離心10 min，收集上清液，對其進行50%-70%硫酸銨沉淀，然后13 000 r/min、4℃離心15 min，收集沉淀，將沉淀的蛋白溶于20 mmol/L pH 8.0 的Tris-HCl緩沖液中，并將其在相同的緩沖液中進行透析，透析后的酶液用PEG 6000進行濃縮。濃縮后的酶液通過陰離子交換層析（HiTrap Q Sepharose XL 5 mL）和分子篩凝膠層析（Sephacryl S-200 HR FPLC column）進行純化，得到電泳純的蛋白樣品。

1.2.6 脫糖基化及SDS-PAGE分析 畢赤酵母表達的異源蛋白往往會被糖基化修飾，造成異源表達的蛋白分子量與理論分子量不符的情況，因此，我們對純化的PhyC1進行脫糖基化處理及蛋白電泳驗證，分析其糖基化情況和實際分子量，脫糖基化反應體系如下：向18 μL純化的酶液中加入2 μL 10×Glycoprotein變性緩沖液，100℃煮沸10 min，使酶蛋白充分變性；再加入2.4 μL 10×G 5 緩沖液、2 μL Endo H，37℃水浴處理 1 h。而后通過SDSPAGE電泳分析重組酶的實際和理論分子量。SDSPAGE濃縮膠和分離膠分別是5%和12%的丙烯酰胺凝膠溶液。

1.2.7 植酸酶活性測定 將純化的酶液用NaAc-HAc緩沖液進行稀釋一定倍數(shù)（0.25 mol/L；并含有 0.05%BSA 和 0.05% Triton X-100 ；pH 4.5），將 50 μL 稀釋后的酶液加入到 950 μL 1.5 mmol/L 植酸鈉底物（用上述NaAc-HAc緩沖液配制）中，在37℃水浴鍋中反應15 min，加入1 mL 10%（W/V）TCA 終止反應，最后加入2 mL顯色液（1%（W/V）四水合鉬酸銨，3.2%（W/V）濃硫酸，7.32%（W/V）硫酸亞鐵）進行顯色。對照管是先加入TCA混勻后再加酶液，其它步驟相同。顯色后，在700 nm光吸收下測定OD值，并計算酶活。

1.2.8 重組植酸酶的酶學性質分析

1.2.8.1 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH測定：將純化后的酶液在不同的 pH（2.0-12.0）條件下進行酶促反應，所使用的緩沖液如下：0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 2.0-4.0；0.1 mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH 4.0-7.0；0.1 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH 7.0-9.0；0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH 9.0-12.0。酶促反應在37℃下進行。

pH穩(wěn)定性測定：將純化后的酶液用不同pH緩沖液稀釋，使其在不同pH、37℃處理1 h，然后用最適pH緩沖液稀釋，使其在最適pH、37℃下進行酶促反應測定酶活性研究酶的pH穩(wěn)定性。每個pH下的測定重復3次，取平均值。

1.2.8.2 最適反應溫度和熱穩(wěn)定性 在最適pH條件下，使酶促反應在不同溫度（0℃-70℃）條件下進行，通過測定酶活性來確定最適溫度。熱穩(wěn)定性測定是在40℃、45℃、50℃條件下將酶液分別處理2-60 min后，在37℃、最適pH條件下進行酶活性測定。每個溫度下的測定重復3次，取平均值。

1.2.8.3 比活性測定 酶活性單位定義：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol無機磷所需的酶量為一個酶活性單位（U）。比活力單位定義是：每毫克酶蛋白所含有的酶活力單位。用結晶牛血清白蛋白（BSA）配置標準蛋白質溶液，并繪制蛋白含量標準曲線。通過考馬斯亮藍G-250試劑測定樣品中酶蛋白的含量，同時在37℃下測得重組植酸酶的酶活，由此得到酶的比活。

1.2.8.4 不同化學試劑及相關金屬離子對重組植酸酶PhyC1酶活性影響測定 在酶促反應體系中加入相應的金屬離子及相關化學試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質的終濃度為1 mmol/L，在最適pH、37℃條件下測定。以沒有加金屬離子和化學試劑的反應為對照。

1.2.8.5 PhyC1動力學常數(shù)Km值及Vmax的測定 在PhyC1的最適反應條件下，以 0.0625 mmol/L的植酸鈉為底物，依次在酶促反應進行 1、3、5、7、10、15 min 時加入1 mL 10% TCA 試劑終止反應，測定酶活性，計算出酶活性與時間的比值，在一定時間內(nèi)比值呈一常數(shù)，則在此時間內(nèi)的酶促反應為一級反應，此時間即可做為測定Km和Vmax的反應時間。在一級反應時間內(nèi)，用不同濃度的植酸鈉（0.0625、0.1、0.125、0.2、0.25、0.5、1.0 和 1.5 mmol/L）為底物，在最適條件下測定酶活，計算相應的酶促反應速度，按照雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）測定Km值及Vmax。

1.2.8.6 蛋白酶耐受性的測定 用0.2 mol/L、pH 7.0的Tris-Hcl緩沖液配制0.1 mg/mL的胰蛋白酶。按照蛋白酶與純化植酸酶質量比為1∶1的比例在植酸酶中加入胰蛋白酶，在37℃分別保溫 0、5、10、20、30、60 min 后取樣放置于冰上，然后對蛋白酶處理后的樣品用最適pH緩沖液稀釋，在37℃、最適pH條件下進行酶活性測定，研究蛋白酶對植酸酶活性的影響。

2 結果

2.1 植酸酶基因phyC1的克隆

通過簡并引物的擴增及染色體步移方法，最終獲得了來源于青霉的植酸酶基因phyC1的ORF序列，如圖1所示：phyC1的結構基因全長1 477 bp，有意思的是58 bp的內(nèi)含子序列（黑體加下劃線），正處于phyC1信號肽的內(nèi)部。PhyC1成熟蛋白編碼449個氨基酸，理論分子量為50 kD，預測等電點4.73，含有6個潛在的N糖基化位點。將phyC1的結構基因在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，PhyC1屬于典型的組氨酸植酸酶家族HAP（Histidine Acid Phosphatase），在N端和C端分別含有該家族保守的RHG和HD基序，其中兩個組氨酸和天冬氨酸是植酸酶催化殘基。PhyC1與來源于Talaromycesverruculosus（KUL82701.1）的植酸酶的氨基酸序列最為相似，相似性約為92%；與來源于Talaromycescellulolyticus（GAM38406.1）的植酸酶的氨基酸序列相似性約為90%；與來源于Penicilliumsp. ‘occitanis’（PCG95438.1）的植酸酶的氨基酸序列相似性約為87%。

圖1 植酸酶phyC1的核酸序列

2.2 植酸酶基因phyC1在畢赤酵母中的表達與純化

phyC1基因通過SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切位點與 pPIC9γ表達載體連接，獲得重組表達載體pPIC9 γ-phyC1，線性化的重組載體經(jīng)電激轉化，導入酵母GS115菌株，經(jīng)過平板篩選和小管篩選，選取植酸酶活性最高的轉化子，在裝有200 mL培養(yǎng)基的1 L搖瓶中進行誘導表達，96 h左右發(fā)酵液酶活達到最高，離心收集發(fā)酵液，對其進行50%-70%硫酸銨沉淀、透析、濃縮，濃縮的酶液利用陰離子交換層析和分子篩凝膠層析進行純化，以純化的樣品進行酶學性質的分析。將純化的樣品10 μL進行 SDSPAGE 蛋白電泳分析（圖2），結果表明，重組酶純化條帶單一，分子量約為60 kD左右，經(jīng)Endo H脫糖基化處理后，重組酶的分子量下降至50 kD左右，說明在GS115菌株中PhyC1蛋白被糖基化。

圖2 重組酶PhyC1的SDS-PAGE分析

2.3 最適pH和pH穩(wěn)定性測定

將純化的酶液在37℃下置于pH 2.0-8.0的緩沖液中測定酶活力，結果顯示重組植酸酶PhyC1的最適pH為6.5；在pH值為7.0時酶活性也很高，剩余酶活為90%，說明該酶是一個中性的植酸酶（圖 3-a）。

將PhyC1分別在不同pH緩沖液（pH 2.0-12.0）中于冰上處理 60 min，在最適pH6.5，37℃的條件下測定不同pH處理后的酶活力。結果顯示在pH 2.0-4.0的條件下，剩余酶活為15%-40%，而在pH 5.0-10.0條件下，剩余酶活為80%-100%，pH 11.0-12.0條件下，剩余酶活僅為10%以下（圖3-b）?？梢奝hyC1在 pH5.0-10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好。

圖3 PhyC1的最適pH（a）和pH穩(wěn)定性（b）

2.4 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在最適pH為6.5的條件下，不同溫度下測定PhyC1的活性，結果如圖4-a所示，PhyC1的最適反應溫度為50℃，在0-20℃時，該酶仍然保持一定的酶活性。熱穩(wěn)定性測定時，40℃保溫60 min后，其相對酶活力仍然保留80%以上，說明PhyC1在40℃條件下熱穩(wěn)定性較好；在45℃保溫20 min后，其剩余酶活為40%左右，但在50℃保溫20 min后，酶活完全喪失，說明該酶在50℃條件下熱穩(wěn)定性較差，如圖4-b所示。

圖4 PhyC1的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

2.5 PhyC1的比活及動力學常數(shù)的測定

純化的重組酶，經(jīng)過蛋白濃度測定和酶活性測定，計算出PhyC1的比活性為16 U/mg；在37℃，pH 6.5條件下，純化的重組植酸酶PhyC1對植酸鈉的動力學參數(shù)Km和Vmax分別為0.11 mmol/L和21.83 μmol/min/mg。

2.6 PhyC1對不同金屬離子和化學試劑的耐受性

在最適pH、37℃條件下，測定在標準反應總體系中加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子與化學試劑，結果如圖5所示，Na+、K+、Li+、EDTA、巰基乙醇在此條件下對酶活性無影響，也有部分金屬離子對酶產(chǎn)生抑制作用，對酶活抑制影響效果排列為 ：Mg2+＜Ni2+＜ Ca2+＜ Cr3+＜ Co2+＜Ag+＜Cu2+＜Fe3+＜Mn2+＜Pb2+＜Zn2+，其中 Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+的抑制作用最強，剩余酶活力極低，而化學試劑中SDS對酶的抑制作用最強，酶活完全受到抑制。

圖5 PhyC1對化學試劑和金屬離子的耐受性

2.7 胰蛋白酶耐受性

圖6 PhyC1的胰蛋白酶耐受性

如圖6所示，植酸酶PhyC1在胰蛋白酶處理60 min后，剩余酶活達70%以上，說明該植酸酶有很強的抗胰蛋白酶水解的能力。

3 討論

植酸酶廣泛存在于植物、動物和微生物中，目前，應用最廣泛的是來源于黑曲霉Aspergillus niger的PhyA［18-19］和來源于大腸桿菌Escherichia coli的AppA［20-21］。但以上植酸酶均為酸性植酸酶，其最適pH值為4.0-6.0，使其在魚類和蝦類飼料中的應用受到很大的限制。已有研究表明，在飼料中補充酸性植酸酶對斑節(jié)對蝦、日本對蝦和南亞野鯪的生長性能并無影響，但補充中性植酸酶卻改善了異育銀鯽的生長性能和營養(yǎng)物質消化率［22］，因此在植酸酶的選擇上要依據(jù)不同動物的消化道酸堿性而定。

目前，青霉來源的植酸酶已經(jīng)有一些報道，最適pH值均在4.0-5.5之間［23-27］，本研究獲得的植酸酶phyC1是來源于本實驗室分離保存的青霉菌Penicillium pinophilum［17］，植酸酶基因是首次在該菌種中報道，依據(jù)植酸酶分類方法，phyC1屬于組氨酸酸性植酸酶HAP家族［6］，因其最適pH為6.5，偏中性，與現(xiàn)有的組氨酸酸性植酸酶有一定差異，因此屬于HAP家族中一個新的成員，并且phyC1在pH為5-10的范圍內(nèi)維持80%以上的活性，而且在較低的溫度下保持更高的活性，這些性質特征都表明植酸酶PhyC1在低溫及pH偏中性的環(huán)境下具有較高的植酸酶活性和穩(wěn)定性，非常適宜在魚類的消化道內(nèi)發(fā)揮作用。但該酶的熱穩(wěn)定性較差，可以通過水產(chǎn)飼料加工中近幾年發(fā)展起來的后噴涂工藝，得到緩解。另外在今后的研究中，通過蛋白質工程的手段，對該基因進行酶學性質改良，因此該低溫中性植酸酶PhyC1可以作為儲備的水產(chǎn)用功能性基因資源，為中性植酸酶的研發(fā)和應用提供參考。

目前，酶制劑在魚蝦飼料中的應用已經(jīng)取得了一定成效，為了使植酸酶得到更加廣泛的應用，科學家們通過遺傳工程和蛋白質工程等技術手段獲得在酶學性質方面具有更加廣泛 pH 作用范圍、蛋白酶抗性、熱穩(wěn)定性提高的植酸酶，以適應動物消化道內(nèi) pH 條件的變化、增加蛋白酶抗性、減少飼料制粒過程中的損失［28］。隨著符合水產(chǎn)動物生理特點的酶制劑的開發(fā)，植酸酶將在水產(chǎn)飼料中得到更多的應用，從而提高飼料利用率，節(jié)約飼料資源，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。