張麗娜，王 晉，李碩果，巫祥云，韓玉剛

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所，北京 100081；2.國家科技基礎條件平臺中心，北京 100862；3.中國科學院 生物物理研究所，北京 100101)

1 超分辨熒光共聚焦顯微技術進展

細胞內(nèi)超微結構及其動態(tài)變化一直都是生物學研究中的重要內(nèi)容，自16世紀末期簡易顯微鏡出現(xiàn)，到1665年R·Hooke(羅伯特·虎克)用復合式顯微鏡觀察軟木塞的薄切片，發(fā)現(xiàn)并命名了cell(細胞)，再到1674年，荷蘭顯微鏡學家Antoni van Leeuwenhoek(安東尼·列文虎克)用自制顯微鏡首次發(fā)現(xiàn)了微生物，隨后三個多世紀以來，光學顯微成像技術經(jīng)歷了從普通的明場顯微鏡到熒光顯微鏡，并進一步發(fā)展到激光共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、超分辨率顯微鏡等不同成像技術，推動生物學研究進入了新時代.

2014年諾貝爾化學獎授予美國科學家Eric Betzig(埃里克·白茲格)和William E.Moerner(威廉姆·艾斯科·莫爾納爾)及德國科學家Stefan W.Hell(斯特凡·W·赫爾)，獎勵其開創(chuàng)性的貢獻使得光學顯微成像技術的分辨極限拓展到了納米尺度.其中，Betzig E等[1]實現(xiàn)了基于光活化(photo-activation)/光轉(zhuǎn)換(photo-convertible)熒光分子的“(熒光)光敏定位成像技術”photo-activated localization microscopy, PALM)，獲得了定位精度可達2～25 nm的超分辨率圖像.Sahl S J[2]在激光掃描共聚焦光路的基礎上，利用熒光分子的受激輻射效應，將一個高強度的耗損光調(diào)制成面包圈形狀，與激發(fā)光束中心準直，之后將兩束光一起照射到樣品上，通過抑制點擴散函數(shù)中心點之外的地方發(fā)出熒光的點掃描“受激輻射損耗成像技術”(stimulated emission depletion microscopy，STED)，達到了縮小成像系統(tǒng)實際艾里斑的尺寸的效果，從而實現(xiàn)了提高系統(tǒng)分辨率的目的.隨后，他們又進一步發(fā)展了“可逆飽和光學熒光轉(zhuǎn)化成像技術”(reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT)，以及并行掃描(parallelized scanning, RESOLFT)技術，大幅提升了系統(tǒng)的時間分辨率.

另一種基于傅里葉光學原理發(fā)展起來的超分辨成像技術：結構光照明超分辨成像技術，通過不同角度、不同相位的結構光照明，獲得了包含不同頻率信息的原始數(shù)據(jù)，通過移頻合并獲得了遠超過系統(tǒng)截止頻率范圍的更多高頻信息的倒空間頻譜圖，即突破光學系統(tǒng)的衍射極限獲得了更高空間頻率的樣品信息.線性結構光照明超分辨成像技術可以將橫向空間分辨率提升至100 nm 左右，縱向分辨率提升到了280 nm[3].而非線性結構光照明(nonlinear SIM，NL SIM)通過控制照明光模式，可以使橫向空間分辨率進一步提高到了40 nm[4].隨后出現(xiàn)的“貝塞爾光片結構光照明成像技術”(bessel light-sheet SIM)[5]，利用貝塞爾光片照明光路僅對在焦面的熒光分子進行激發(fā)成像，有效減少了非焦面熒光分子的發(fā)光，大大提升了圖像信噪比，也有效降低了三維成像過程中對樣品的輻照總劑量.“掠射結構光照明成像”(grazing incidence SIM，GI-SIM)[6]通過掠射(grazing incidence)照明產(chǎn)生一個厚度與物鏡景深相匹配的照明光片，實現(xiàn)了快速二維超分辨成像，為多維度生命現(xiàn)象的動態(tài)研究提供了強有力的觀察手段.

這些新型成像技術“打破”了曾被認為是不可逾越的光學衍射極限，可達到百納米、甚至十幾納米的光學分辨率，故被稱為“超分辨成像技術”(super-resolution microscopy).而自問世以來，超分辨成像技術在觀察和發(fā)現(xiàn)新的細胞超微結構、功能等方面已經(jīng)成為不可或缺的利器.

2 市場主流激光共聚焦顯微鏡技術評價

目前市面上雙光子激光共聚焦顯微鏡主要以徠卡、蔡司和奧林巴斯三家居多.近年來雙光子顯微鏡的技術革新也較快，徠卡SP8 DIVE為2018年最新推出的全光譜式雙光子共聚焦.該儀器基于SP8平臺，具有更快的掃描速度及靈敏度，雙光子外置光譜式掃描檢測器，無需更換濾塊，可實現(xiàn)雙光子發(fā)射光全光譜掃描.蔡司的LSM NLO在2014年發(fā)布，但技術革新較少，僅檢測器部分作了新的改進，整體光路變化不大.從發(fā)布至今，圍繞著LSM880平臺進行的研發(fā)升級也較少，只推出了Airyscan，并且蔡司的價格普遍偏高.Olympus的FV MPE，其特點在于系統(tǒng)靈活性高，可以根據(jù)客戶要求進行改裝，且價格低廉，但光學敏感度及重復精度均不理想，軟件及硬件的操作較為復雜，應提高人性化設計.

超分辨共聚焦(納米成像)技術是目前國際上納米分辨成像領域最先進的成像技術，只有徠卡、通用電氣和尼康等幾家公司擁有較為成熟的產(chǎn)品.而通用電氣的系統(tǒng)為一體化儀器，使用SIM技術，對圖像質(zhì)量進行軟件提升，分辨率接近100 nm，缺點是無法對光學功能進行更多的拓展，難以滿足厚組織的原位成像分析.尼康公司生產(chǎn)的N-STORM 系列產(chǎn)品，分辨率可以達到20 nm(軟件計算)，但是由于需要使用特殊的熒光染料，制樣方式復雜難度較大，只能針對薄樣品成像，難以適用于活體與組織樣本.

徠卡STED的設計以激光掃描系統(tǒng)為構架，可以較為靈活的擴充到納米成像以及雙光子成像等其他方式.但該設備需要的光照度是活細胞可以承受的一百萬倍，因此不適于活細胞成像，同時實際分辨率受限于光漂白和光毒性，無法達到用熒光小球測出的理論分辨率[7].例如，徠卡STED承諾可以實現(xiàn)優(yōu)于50 nm的分辨率，到目前為止仍然無法給出90 nm的Hessian SIM揭示出來的活細胞線粒體內(nèi)嵴的結構動態(tài)[8-9].

3 中國研發(fā)高分辨熒光共聚焦顯微技術的情況

光學顯微已有近400年的歷史，在其發(fā)展過程中，分辨率的提升是一代又一代學者專家追求的目標.1873年阿貝提出了光學顯微鏡分辨率受衍射現(xiàn)象的限制，只能達到200 nm左右，無法進一步提升.然而進入本世紀以來，單分子定位顯微鏡(STORM/PALM)、結構光照明顯微鏡(SIM)、受激輻射光耗竭顯微鏡(STED)等顯微成像技術掀起了生命科學研究工具的技術革命，把顯微鏡的分辨率又提升了一個數(shù)量級，其中PALM和STED于2014年獲得了諾貝爾化學獎.

中國科學院和北京大學為代表的科研團隊在超分辨儀器的技術領域取得了重大突破.在結構照明超分辨顯微鏡領域，北京大學的陳良怡團隊[10]和中國科學院生物物理研究所的李棟團隊[11]分別發(fā)展了海森結構光超高分辨率顯微鏡和掠入射結構光超分辨成像技術，把分辨率提高到100 nm以內(nèi)的同時也將時間分辨率提升到數(shù)百幅每秒，非常適合細胞器互作等動態(tài)過程的研究，并且所需要的光照度小于常用的共聚焦顯微鏡光照度三個數(shù)量級.由于極低的光漂白以及光毒性，實現(xiàn)了高速超高分辨率成像下超長時間的動態(tài)觀察.在單分子定位顯微鏡領域，中國科學院生物物理研究所的徐濤和紀偉團隊[12]發(fā)展了冷凍單分子定位顯微鏡和一種新型的干涉單分子定位顯微鏡(repetitive optical selective exposure，ROSE).冷凍單分子定位顯微鏡在提高分辨率的同時可實現(xiàn)與冷凍電鏡融合成像，ROSE顯微鏡實現(xiàn)了不同干涉條紋下單分子高速成像，避免了閃爍和發(fā)光時間短等對定位精度的影響，將單分子定位顯微鏡的分辨率提升到3 nm以內(nèi)的分子尺度，定位精度接近1 nm，具有更高的亞細胞結構解析能力.這些技術為生命科學的研究提供了強有力的技術手段，是顯微成像領域的重大突破，具有廣泛的應用前景.

中國科學院蘇州醫(yī)工所的張運海團隊，對入射光進行偏振調(diào)制，得到尺寸較小的徑向偏振光縱向分量的聚焦光斑，成功提高了現(xiàn)有圖像掃描顯微成像技術的分辨率，獲得了高信噪比且更高分辨率的圖像.該技術利用徑向偏振光的縱向分量具有緊湊型光斑的特性，獲得了較小的照明光斑，并進行圖像掃描顯微成像，與普通圖像掃描成像相比，其分辨率提高了7%[13].

北京大學陳良怡帶領的科研團隊歷時2年研發(fā)了智能超高靈敏度活細胞超分辨顯微鏡(HiS-SIM)[10]，是現(xiàn)有商用超分辨率顯微鏡中成像靈敏度和分辨率最高的，并配備多種成像模式、操控便捷、高性能圖像重建和智能圖像處理，產(chǎn)品服務于基礎生物學研究、臨床醫(yī)學及病理學研究、精準藥物篩選等領域科技人員，重點致力于活細胞超分辨率智能成像解決方案.該設備價格較高，是我國研發(fā)的 高端顯微鏡.另外，中國科學院蘇州醫(yī)工所也開發(fā)了商品化的高速雙光子顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡.

4 激光共聚焦顯微鏡開放共享情況

按照《國務院關于國家重大科研基礎設施和大型科研儀器向社會開放的意見》和中央改革辦督察組的要求，2019年5月至9月，科技部、財政部會同有關部門，委托國家科技基礎條件平臺中心，組織開展了2019年中央級高等學校和科研院所等單位科研設施與儀器開放共享評價考核工作[14].

總體看來，與2018年相比，參評單位對開放共享更加重視，科研設備與儀器的利用率進一步提升，支撐科技創(chuàng)新的成效更加顯著.參評科研儀器的年平均有效工作機時為1 440 h，平均對外服務機時為240 h.納入國家網(wǎng)絡平臺統(tǒng)一管理的儀器入網(wǎng)比例為95%.80%的參評單位建立了在線服務平臺，并實現(xiàn)了與國家網(wǎng)絡管理平臺互聯(lián)對接，其中中央級高校和科研院所單位的497臺激光共聚焦顯微鏡參加了考核，總運行機時為487 423.34 h，平均運行機時為980.73 h，明顯低于參評的科研儀器年平均有效工作機時1 440 h.其中494臺激光共聚焦顯微鏡對外開放共享服務，總服務機時為9 553.90 h，平均對外服務機時為140.80 h，明顯低于參評的科研儀器年平均對外服務工作機時240 h.由此可見，激光共聚焦顯微鏡的整體使用效率需要進一步提升，充分論證新購激光共聚焦顯微鏡的需求，并在儀器設備查重評議環(huán)節(jié)嚴格把關，提高科技資源的高效效率.

總之，超分辨熒光共聚焦顯微鏡已成為生命科學細胞生物學研究的重要技術手段.2019年我國共購置顯微鏡316臺，國外品牌為主.根據(jù)我國評價考核結果分析，高校和科研院所購置的激光共聚焦顯微鏡使用機時偏低，基本上呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，后續(xù)購置應謹慎有序安排.