朱世平，王福生，陳嬌，余歆，余洪，羅國濤，胡洲，馮錦英，趙曉春，洪棋斌

柑橘不同類型砧木的種子和苗期性狀

朱世平1，王福生1，陳嬌2, 3，余歆1，余洪1，羅國濤1，胡洲1，馮錦英1，趙曉春1，洪棋斌1

（1西南大學/中國農業(yè)科學院柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心，重慶 400712；2西南大學園藝園林學院，重慶 400716；3四川省富順縣農業(yè)農村局，四川富順 643200）

【目的】優(yōu)良的砧木能促進果樹生長、提高果實產量和品質、增強植株的抗逆性和適應性。目前我國柑橘生產上使用的砧木品系混雜，生長參差不齊，抗逆性差異明顯，嚴重影響了苗木質量。通過對各種種質類型柑橘砧木的連續(xù)多年評價，分析不同遺傳種質砧木的種子和苗期特征，鑒定影響砧木苗木質量的關鍵性狀，建立規(guī)范柑橘砧木的評價標準，為篩選優(yōu)良砧木單系提供指導?！痉椒ā恳?04份柑橘砧木種質為材料，連續(xù)5年評價單果種子數(shù)、種子飽滿度、千粒重和胚型等種子性狀及播種后的出苗率、黃化率、立枯率、株高和莖粗等苗期性狀，并對這些指標進行相關性、主成分分析以及不同年份間的變異系數(shù)分析。利用保守的直系同源序列（conserved ortholog sequences，COS）分子標記技術評價部分不同胚型砧木種質幼苗遺傳背景的一致性，分析部分種質中微型反向重復轉座元件（miniature inverted-repeat transposable element，MITE）片段插入與胚型的關聯(lián)性?！窘Y果】（1）枳、枳雜種和香橙的果實為多核和較多核，種子為混胚和多胚，種子飽滿，大部分材料的種子千粒重為200 g以上；而寬皮柑橘為少核、較多核和多核，多胚，種子中等飽滿，約一半種質的種子千粒重為100 g以下。（2）在苗期特性方面，香橙出苗率最高，黃化率較低，其幼苗對立枯病比較敏感；枳及其雜種的出苗率較高，黃化率也較高，但耐立枯??；寬皮柑橘的出苗率則較低，幼苗發(fā)生黃化和立枯的比例也比較低。比較播種后10個月內的幼苗生長勢，枳的生長勢最強，其次是枳雜種和香橙，而寬皮柑橘的生長勢最弱。（3）對種子和苗期性狀指標的相互關系及主成分分析結果表明，除黃化率和立枯率外，單果種子數(shù)、千粒重、飽滿度、單胚比例、多胚比例、胚型、出苗率、幼苗株高和莖粗等指標之間具有極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）的相關性，且不同指標對主成分的方差貢獻率有明顯差異。通過主成分分析能夠清楚地區(qū)分枳、枳雜種、香橙、寬皮柑橘及其他砧木的種質類型。除黃化率外，種子性狀和苗期表現(xiàn)的指標在不同年份間的變異系數(shù)相對較低，說明這些性狀較為穩(wěn)定。（4）COS分子標記結果顯示，單胚寬皮柑橘幼苗的變異程度比單胚枳及其他多胚或混胚類型種質的變異程度高；在單胚的柚和寬皮柑橘等種質中沒有MITE片段的插入，而在多胚的香橙、寬皮柑橘、枳雜種等種質中有插入，但是在枳種質中無論是單胚還是多胚均沒有檢測到MITE片段的插入?！窘Y論】柑橘砧木種子性狀和幼苗性狀指標之間高度相關，通常種子性狀優(yōu)異的砧木種質，其幼苗質量也較好。枳的種子和幼苗（播種后10個月）綜合性狀最好，其次是枳雜種和香橙，寬皮柑橘的種子和苗期綜合性狀最差。

柑橘砧木；種子性狀；胚型；出苗率；一致性

0 引言

【研究意義】嫁接是現(xiàn)代園藝植物生產中應用最廣的一種繁殖技術，在中國最早被用于柑橘生產[1]。砧木是嫁接的最基本要素之一。優(yōu)良砧木能促進果樹早結豐產，提高果實品質，增強抗病性和對環(huán)境的適應能力[2]。美國、巴西等發(fā)達國家在20世紀30年代就開始標準化工廠育苗，培育健壯整齊的無病毒容器苗。我國在20世紀90年代開始標準化、規(guī)模化，培育柑橘無病毒容器苗，并從國外引進了柑橘砧木新品種如‘卡里佐’枳橙、‘施文格’枳柚等。但由于受柑橘砧木研究滯后和商業(yè)化砧木采種園不規(guī)范等因素的限制，目前只有個別砧木品種是采用純系種子育苗，如‘卡里佐’枳橙。對大部分柑橘砧木而言，生產上使用的種子均是同一類型的混合品系種子，而不是單一品種（系）的種子，使用上也沒有進行分級處理，導致在育苗過程中出現(xiàn)砧木的出苗率不穩(wěn)定，種苗生長勢不一致，整齊度較差等問題。調查結果顯示，很多苗圃因為砧木種子品種純度不夠或未分級，以及嫁接成活率低等造成每年約15%—35%的容器苗不能按時出圃，一方面增加了育苗成本，另一方面嚴重影響柑橘苗木的質量。因此，對柑橘砧木種質進行種子性狀及苗期評價，篩選出苗率高、長勢強、整齊度好的優(yōu)良單系砧木對柑橘規(guī)?；?、優(yōu)質化苗木繁育意義重大。【前人研究進展】枳、香橙、枳橙、紅橘和酸柚等是我國柑橘的主要砧木，其中枳的應用歷史最久，范圍最廣，面積最大，數(shù)量最多。在長期的進化和選擇過程中，出現(xiàn)許多不同的株系變異，而且相同類型砧木有遺傳多樣性豐富的不同種質[3-5]。但在實際生產中通常沒有區(qū)分這些變異株系，而是混合使用。萬良珍和周開隆[6]以9份枳單系為砧木，開展了‘哈姆林’甜橙的砧木比較試驗，發(fā)現(xiàn)枳的不同單系對‘哈姆林’的生長、產量和果實品質的影響有顯著差異。在生產上，枳砧具有許多優(yōu)良特性，如早結豐產性好，果實品質優(yōu)，抗衰退病、抗流膠病、抗根結實，線蟲病，抗寒能力強等，但同時也存在一些缺點，如不耐鹽，在堿性條件下容易缺鐵，對柑橘裂皮病、碎葉病等敏感，在掛果較多的情況下樹體易早衰等。戴勝根等[7]發(fā)現(xiàn)不同枳單系對嫁接甜橙后的黃化有不同程度的影響。以上結果說明，相同類型砧木的不同單系間存在較為明顯的遺傳差異，這些差異對嫁接親和性及產量、品質等都有影響。因此，需要加強不同砧木種質的系統(tǒng)評價，以篩選更加優(yōu)良的單系砧木。砧木通常用種子進行實生繁殖。實生繁殖的砧木苗根系發(fā)達，生長健壯且容易培育[8]。另外，與營養(yǎng)繁殖方式相比，種子不易攜帶病毒等病原，能保證苗木健康。目前，對柑橘砧木資源種子特性的研究報道較少，砧木的苗期評價也多側重于抗逆性方面，如耐旱性[9-11]和對pH的適應性[12-13]。解凱東等[14]比較了4個體細胞雜種砧木種質的種子特性，發(fā)現(xiàn)其中3個雜種組合的單果種子數(shù)較多，種子特性較優(yōu)，適于作砧木應用。但是作為優(yōu)良的柑橘砧木，必須同時具備優(yōu)良的種子特性、苗期性狀和抗逆性等，需要對多種性狀進行綜合評價和篩選?！颈狙芯壳腥朦c】我國是世界柑橘的重要起源中心，砧木資源非常豐富。但是由于我國柑橘砧木研究起步較晚，研究滯后，目前尚未有人工培育的具有自主知識產權的柑橘砧木新品種報道，也未對我國砧木資源開展系統(tǒng)評價，更沒有建立比較權威的柑橘砧木新品種評價的國家或行業(yè)標準。這導致柑橘砧木使用品系混雜，柑橘苗木質量參差不齊，嚴重影響我國柑橘產業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展?！緮M解決的關鍵問題】本研究以104份砧木資源為材料，對單果種子數(shù)、胚型等種子特性和苗期表現(xiàn)等影響柑橘苗木質量的相關指標進行連續(xù)5年的系統(tǒng)調查和評價，旨在篩選出優(yōu)良的砧木單系用于生產，同時為建立我國柑橘砧木新品種篩選和評價標準提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013—2017年連續(xù)5年采集104份砧木種質的成熟果實，包括枳、枳雜種、香橙、寬皮柑橘以及其他種類的砧木，收集種子進行評價。所有試驗材料均采自中國農業(yè)科學院柑桔研究所國家果樹種質（重慶）柑橘圃。對20份不同胚型的砧木種質進行與胚型緊密相關的微型反向重復轉座元件（MITE）片段插入的檢測[15-16]。利用保守的直系同源序列（COS）分子標記[17]對不同胚型的種質KPJ-023、KPJ-030（）、Z-006、Z-022、Z-040（）、ZZ-030（hybrid）、XC-011、XC-013（）等材料進行幼苗的一致性檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子的收集、處理及相關參數(shù)的測定

（1）單果種子數(shù)的計算及種子處理：根據(jù)不同砧木種質本身的物候期和生物學特性確定采集時間，在果實達到生理成熟后采收至實驗室進行種子相關指標的評價。枳的采集時間為9月下旬，枳雜種的采集時間為10—11月，其余砧木資源的采集時間為12月。每份砧木隨機采集50個果實并取出種子，隨機記錄其中20個果實的單果種子數(shù)，然后計算每個果實的平均種子數(shù)。根據(jù)平均每個果實的種子數(shù)量，分為無核、少核、較多核和多核4個級別，即：1—2粒為無核，3—5粒為少核，6—20粒為較多核，20粒以上（含20粒）為多核[8]。種子取出后用0.5%的溫熱生石灰溶液處理2—3 min，以洗凈表面包裹的果膠等黏稠物質。對于表面黏稠物質較多的枳及其雜種種子，需要重復處理幾次。處理后用自來水沖洗干凈，然后在（52± 1）℃熱水中浸泡10 min進行熱處理消毒，處理完成后立即放入自來水中使種子盡快降溫，然后在通風較好的弱光條件下將種子晾干至種皮發(fā)白，表面無明顯水汽后裝入塑料袋備用[18]。

（2）種子飽滿度調查和千粒重的測定：根據(jù)種子種皮的充實程度，將種子分為飽滿、中等飽滿和不飽滿3個等級。1 000粒種子中有90%以上的種子為正常大小，種皮光滑沒有皺褶，且正常條件下干燥后種皮緊密包被胚的為飽滿；1 000粒種子中有80%以上的種子為正常大小，種皮有輕微皺褶且包被胚較為緊密的為中等飽滿；1 000粒種子中90%以上的種子較小，種皮有皺褶且種皮包被胚比較松散的為不飽滿。每份砧木種子隨機選擇100粒種子稱重，計算千粒重，每份材料重復3次。

1.2.2 胚型分類 每份砧木隨機挑選50粒種子，剝除種皮，在飽和濕度條件下靜置12 h后，多胚會互相自然分開或胚與胚之間變得比較松散，然后用鑷子將其完全分開，觀察并記錄胚的數(shù)量。每粒種子只有一個胚為單胚，有兩個及以上胚的為多胚。根據(jù)單胚和多胚的種子數(shù)分別計算單胚比例和多胚比例。單胚比例≥94%則為單胚類型，10%≤單胚比例＜10%為混胚類型，單胚比例＜10%為多胚類型[19]。單（多）胚比例的計算如下：

單（多）胚比例=（單（多）胚種子數(shù)/50）×100%

1.2.3 種子的播種、苗期觀察和統(tǒng)計 每年12月下旬至1月上旬播種。種子在播種前先用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min，然后在自來水中浸泡4—5 h，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，28℃條件下暗培養(yǎng)3—5 d至萌發(fā)[20]，最后播種到溫室中的96孔育苗盤（2013—2016年）或栽培槽（2017年）。每份材料播種100粒種子，所用的基質為草炭﹕河沙﹕椰糠（體積比為1﹕1﹕1）。播種3個月后統(tǒng)計出苗數(shù)、黃化苗數(shù)、感染立枯病植株數(shù)，并按照以下公式計算出苗率、黃化率和立枯病感病率（立枯率）。

出苗率=出苗數(shù)/播種種子數(shù)×100%

黃化率=黃化苗數(shù)/出苗數(shù)×100%

立枯率=感病苗數(shù)/出苗數(shù)×100%

為比較不同砧木的生長勢，2013—2016年在播種4—5個月后測定砧木幼苗的株高和莖粗，2017年在播種9個月后測定株高和莖粗。

1.2.4 不同胚型種質的MITE插入片段的檢測 根據(jù)Wang等[15]和Shimada等[16]的報道，MITE在含有RWP結構域的基因啟動子的插入是引起柑橘單胚和多胚性狀分離的主要原因，因此，利用MITE特異正向引物5′-GTTACTTGGAGACGGCCTAACG-3′和反向引物5′-TCGATCATGTAATGCTGACTC-3′（Shimada等[16]）檢測不同胚型的20份砧木種質的MITE片段插入。采用Premix TaqTM （TaKaRa TaqTM Version 2.0）（寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，中國）酶擴增目的片段，Premix酶混合液為10 μL，引物各2 μL，2 μL DNA模板，補水至20 μL，置于Biometra PCR儀中進行擴增，擴增程序參照王炯等[17]方法，并部分修改為：96℃預變性4 min，94℃變性30 s，64℃退火40 s，72℃延伸40 s，在每個循環(huán)將退火溫度降低0.5℃，循環(huán)10次；94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，循環(huán)22次；72℃延伸5 min。取6 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 砧木幼苗一致性的分子標記檢測 在種子胚型鑒定的基礎上，分別選擇單胚、多胚和混胚3種胚型共8份種質（單胚：KPJ-023、Z-040；混胚：XC-011、ZZ-030、Z-022；多胚，XC-013、KPJ-030、Z-006），隨機選取分布在全基因組中的27個COS分子標記（每條染色體上隨機選3個標記），對砧木幼苗進行一致性鑒定。以采集種子的母樹為對照，從種子播種后的幼苗中隨機選取25個單株采集混合樣品提取基因組DNA，每份種質分別取4份25個單株的混合樣品，然后進行分析。如果4份混合樣品的PCR產物電泳結果中有一個混合樣品出現(xiàn)與母本不一樣的帶型，說明這個混合樣品中至少有一個單株在這個位點發(fā)生了變異，即認為這100個單株中至少有1株發(fā)生了遺傳變異；如果4個混合樣中均出現(xiàn)了與母本不一樣的帶型，即認為這100個單株中至少有4株發(fā)生了變異，因此幼苗的變異株率（%）≥4%。位點變異率為發(fā)生變異的位點個數(shù)占27個位點的百分比，反映幼苗發(fā)生遺傳變異的程度。27對COS marker的引物序列見王炯[21]。PCR反應體系為優(yōu)化的15 μL體系：1×PCR Buffer，1.5 mmol·L-1的Mg2+，0.2 mmol·L-1的dNTPs，0.33 nmol·L-1的上、下游引物，1 U的DNA聚合酶，DNA模板約75 ng。PCR擴增反應在Biometra PCR儀上進行。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，64℃退火40 s，72℃延伸45 s，每個循環(huán)將退火溫度降低0.5℃，10個循環(huán)；94℃變性45 s，58℃退火40 s，72℃延伸 40 s，22個循環(huán)；72℃延伸5 min；PCR產物在4℃條件下保存。PCR產物用PAGE分離，具體方法見王炯等[17]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用Excel處理。指標在不同年份間的變異系數(shù)計算如下：先用Excel的‘AVERAGE’計算平均值，然后用‘STDEV’函數(shù)計算標準偏差，最后計算變異系數(shù)。變異系數(shù)的計算公式為：變異系數(shù)（CV）=（標準偏差/平均值）×100%。相關性分析和主成份分析均用基于R語言的軟件（https://www. r-project.org/）完成。相關性用“psych”包的corrtest函數(shù)，采用皮爾森方法進行分析；主成分用“FactoMineR”包的PCA函數(shù)進行分析。

2 結果

2.1 不同類型砧木資源的種子性狀

本試驗評價的47份枳均為多核，5年的平均單果種子數(shù)為20—44粒。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)大部分枳種子的種皮光滑，種子飽滿（圖1）。47份枳中，種子飽滿和中等飽滿的比例分別為74.5%和25.5%，5年的平均千粒重為141.6—266.2 g。從胚型上看，枳的平均單胚比例為5.2%—99.6%，平均多胚比例為0.4%—94.8%。根據(jù)胚型分類標準，47份種質中單胚、多胚和混胚的比例分別為4.3%、2.1%和93.6%（表1，圖2-A、2-B）。變異系數(shù)是衡量各觀測值的變異程度。枳種質多年評價結果顯示，種子千粒重的變異系數(shù)較小，為3.45%—27.64%，單果種子數(shù)的變異系數(shù)為2.2%—38.81%，多胚比例的變異系數(shù)為3.20%—58.28%，單胚比例的變異系數(shù)為0.8%—127.3%（表2、3）。10份枳雜種為較多核和多核，平均單果種子數(shù)為8—33粒。枳雜種種子的種皮表面光滑，種子較充實。10份枳雜種中，有6份種子飽滿，4份種子中等飽滿，其平均千粒重為135.7—239 g，平均單胚比例為0—87.5%，平均多胚比例為12.5%—100%。枳雜種種子的多胚和混胚均為5份，各占50%的比例（圖1-A、1-B，表1）。種子千粒重的變異系數(shù)為5.66%—27.48%，單果種子數(shù)的變異系數(shù)為4.72%—76.48%，多胚比例的變異系數(shù)為0—12.9%；單胚比例的變異系數(shù)為14.14%—84.85%（表2、3）。

12份香橙為較多核和多核，平均單果種子數(shù)為12—36粒。香橙種子表面較光滑，種子較充實（圖1-E、1-F）。12份香橙中，種子飽滿和中等飽滿分別所占比例為75%和25%。種子的平均千粒重為147.3—226.3 g，平均單胚比例為0—26.3%，平均多胚比例為73.8%—100%，其中多胚和混胚所占比重分別為58.3%和41.7%（表1，圖2-E）。種子千粒重的變異系數(shù)為6.71%—52.51%，單果種子數(shù)的變異系數(shù)為5.14%—54.39%，多胚比例的變異系數(shù)為0—26%，單胚比例的變異系數(shù)為0—223.61%（表2、3）。27份包含野生、半野生和地方良種的寬皮柑橘種質的種子特性差異較大，有少核、較多核和多核等類型，平均單果種子數(shù)為4—62粒。寬皮柑橘的種子外觀差異較大，大部分種子比較?。▓D1-C、1-D）。種子飽滿、中等飽滿和不飽滿的比例分別為11.1%、63.0%和25.9%，平均千粒重為55—391 g。平均單胚比例為0—99.5%，平均多胚比例為0.5%—100%，多胚、混胚和單胚的比例分別為81.45%、11.11%和7.41%（圖2-C、2-D，表1）。寬皮柑橘種子千粒重的變異系數(shù)為2.67%—36.09%，單果種子數(shù)的變異系數(shù)為5.41%—74.44%，多胚比例的變異系數(shù)為0—200%，單胚比例的變異系數(shù)為1.0%—200%（表3）。

表1 不同砧木種質種子性狀指標2013—2017年的5年平均值

A、B：枳雜種，ZZ2-17、ZZ-004；C、D：寬皮柑桔，KPJ-029、KPJ-012；E、F：香橙，XC-004、XC-013

表2 不同砧木種質苗期性狀指標多年平均值

表3 不同砧木種質種子和苗期性狀指標的多年變異系數(shù)（%）

A、B：枳，Z-027，單胚；Z-043，混胚；C、D：寬皮柑橘，KPJ-011，KPJ-020，多胚；E：香橙，XC-011，混胚；F：香櫞，XY-002，單胚

本試驗除了評價枳、枳雜種、香橙和寬皮柑橘外，還評價了5份香櫞及其雜種、1份酸橙、2份柚及其雜種等其他8份種質。不同類型種質的種子性狀和苗期表現(xiàn)差異較大（圖3）。柚及柚雜種、香櫞的平均單果種子數(shù)在47—75粒，為多核；而枸櫞和酸橙的平均單果種子數(shù)在11—20粒，為較多核。平均千粒重以柚雜種最高，為292 g，而小香櫞最低，為68 g。柚雜種的種子飽滿，其余幾種類型的種子中等飽滿，而酸橙種子則不飽滿。從胚型上看，柚和2份香櫞（圖2-F）為單胚，而其余幾種為多胚或混胚。

A、B：枳及其雜種Poncirus and its hybrids；A1：ZZ-008；A2：Z-036；A3：Z-024；A4：Z-031；A5：Z-040；A6：Z-042；B1：ZZ-011；B2：Z-030；B3：ZZ-054；B4：Z-028；B5：Z-033；B6：Z-011；B7：Z-014。C、D：寬皮柑橘及其他類型砧木Mandarins and other rootstocks；C1：KPJ-023；C2：KPJ-004；C3：KPJ-029；C4：ZZ-055；C5：KPJ-003；C6：KPJ-005；C7：KPJ-008；C8：KPJ-027；C9：KPJ-013；C10：ZZ-011；C11：KPJ-010；C12：KPJ-018；C13：Y-129；D1：KPJ-028；D2：LM-001；D3：KPJ-012；D4：SC-131；D5：KPJ-002；D6：KPJ-019；D7：KPJ-021；D8：KPJ-009；D9：KPJ-012；D10：XC-006

2.2 不同類型砧木種質的苗期表現(xiàn)

不同枳種質的苗期表現(xiàn)存在差異（圖3-A、B）。47份枳4年（因有一年由于特殊原因采果時間提前，導致播種后沒有萌發(fā)）的平均出苗率為62.6%—104.9%。黃化率為0.4%—10.09%，立枯率為0—8.33%。苗期的生長勢方面，苗盤播種4—5個月時的平均株高為8.24—15.21 cm，莖粗為1.3—1.8 mm；栽培槽播種9個月時的平均株高為30—59.9 cm，莖粗為2.0—3.2 mm（表2）。枳出苗率的變異系數(shù)為24.07%—50.44%，株高和莖粗的變異系數(shù)分別為21.28%—60.57%和9.0%—36.5%，而黃化率的變異系數(shù)則較大，為104.46%—223.61%（表3）。枳雜種4年的平均出苗率為69.62%—115.71%，黃化率為0.26%—9.37%，立枯率為0—1.42%。就生長勢來看，苗盤播種4—5個月時的平均株高為5.48—12.98 cm，莖粗為1.5—1.8 mm；栽培槽播種9個月時的平均株高為22.1—32.9 cm，莖粗為2.0—3.1 mm（表2）。枳雜種出苗率的變異系數(shù)為29.95%—79.28%，株高和莖粗的變異系數(shù)分別為18.34%—54.47%和10.6%—27.7%，而黃化率的變異系數(shù)則較高，為14.91%—223.61%（表3）。

香橙的苗期表現(xiàn)有明顯差異。12份香橙的平均出苗率為81.96%—166.69%，黃化率為0.15%—2.26%，立枯率為0—4.62%。在生長勢方面，苗盤播種4—5個月時的平均株高為4.57—9.56 cm，莖粗為1.2—1.7 mm；栽培槽播種9個月時的平均株高為16.1—35 cm，莖粗為2.1—3.2 mm（表2）。香橙種質出苗率的變異系數(shù)為21.62%—40.92%，株高和莖粗的變異系數(shù)分別為17.54%—91.22%和8.7%—25.7%，而黃化率的變異系數(shù)為160.22%—223.61%（表3）。不同寬皮柑橘的苗期表現(xiàn)也有較大差異（圖3-C、D）。寬皮柑橘的平均出苗率為28.6%—103.58%，黃化率為0—5.20%，立枯率為0—3.70%。在生長勢方面，苗盤播種4—5月時的平均株高為4.03—7.63 cm，莖粗為1.0—1.7 mm；栽培槽播種9個月時平均株高為7.7—42.1 cm，莖粗為1.4—2.9 mm（表2）。寬皮柑橘出苗率的變異系數(shù)為32.58%—107.03%，株高和莖粗的變異系數(shù)分別為29.81%—92.61%和8.7%—57.8%，而黃化率的變異系數(shù)則為141.97%—223.61%（表3）。其他幾種種質的平均出苗率為57.89%—113.87%，黃化率為0—6.29%，立枯率為0—1.88%。

2.3 種子和苗期性狀指標之間的相關性分析

單果種子數(shù)與種子的千粒重、飽滿度、單胚比例、幼苗（播種10個月內，下同）株高和莖粗呈極顯著正相關，而與多胚比例和胚型呈極顯著負相關。千粒重與種子飽滿度、單胚比例、幼苗株高和莖粗呈極顯著的正相關，而與多胚比例和胚型呈極顯著負相關，還與出苗率和黃化率呈顯著正相關。種子飽滿度與胚型呈極顯著負相關，而與單果種子數(shù)、千粒重、出苗率、幼苗的株高、莖粗呈極顯著正相關。單胚比例與多胚比例、胚型呈極顯著負相關，而與幼苗株高呈顯著正相關。多胚比例與胚型呈極顯著正相關，而與幼苗株高呈顯著負相關。胚型與幼苗的株高和5個月幼苗的莖粗呈極顯著負相關。幼苗株高與莖粗呈極著正相關，而與胚型呈極顯著負相關（表4）。

對種子性狀和苗期表現(xiàn)相關指標（黃化率和立枯率除外）進行了主成分分析（圖4）。結果表明，這些指標對第一主成分和第二主成分的累計方差貢獻率分別為45%和22%，二者合起來的方差貢獻率為67%，即包含了原始數(shù)據(jù)67%的信息，因此可以用這兩個主成分代表這104份種質的種子和苗期性狀的評價。砧木的單果種子數(shù)、種子千粒重、飽滿度、胚型、幼苗株高和莖粗對第一主成分的貢獻較大，而種子的單胚比例和多胚比例對第二主成分的方差貢獻較大?；诜N子性狀和苗期表現(xiàn)指標，對不同砧木種質進行了主成分分析（圖5）。結果表明，單果種子數(shù)為多核、種子飽滿、幼苗早期生長勢旺的枳對第一和第二主成分的方差貢獻率均較高，能明顯地與其他類型砧木區(qū)分，而種子數(shù)為少核或較多核、種子不飽滿、幼苗生長勢較弱的大部分寬皮柑橘種質對第二主成分貢獻率較多，而種子數(shù)為較多核或多核、種子較飽滿、幼苗生長勢中等的香橙和枳雜種對兩個主成分的貢獻率則介于枳和寬皮柑橘之間。

n：單果種子數(shù) Seeds No. per fruits；●：千粒重1000-grain weight；▲：飽滿度 Plumpness；n：單胚比例 Monoembryo rate；●：多胚比例 Polyembryo rate；▲：胚型Embryo type；n：萌發(fā)率Germination rate；●：2013—2016年株高 Plant height in 2013-2016；▲：2017年株高 Plant height in 2017；n：2013—2016年莖粗 Diameter in 2013-2016；●：2017年莖粗 Diameter in 2017

◆：枳 Poncirus；◆：枳雜種 Poncirus hybrid；▲：香橙 C. junos；▲：寬皮柑橘 C. reticulata；+：枸櫞雜種 Citron hybrid；×：柚 Citrus maxima；⊕：枸櫞 Citron；à：柚雜種 Pummelo hybrid；T：酸橙 Sour orange

表4 不同砧木種質種子和苗期性狀各指標間的相關性分析

*和**分別表示在＜0.05和＜0.01水平下的相關性

* and ** mean the correlation at＜0.05 and＜0.01, respectively

2.4 不同胚型種質的MITE插入片段和不同胚型砧木幼苗變異的分子檢測

MITE片段插入檢測結果顯示，5份單胚種質中含RWP結構域的基因啟動子中沒有檢測到MITE片段的插入，在多胚的香橙、寬皮柑橘、枳雜種、柚雜種及酸橙中檢測到有MITE片段的插入，這一結果與Wang等[15]、Shimada等[16]的結果一致。但是，在5份無論是單胚還是多胚或混胚的枳種質中均沒有檢測到MITE片段的插入（圖6）。

27對COS標記對8份不同胚型的砧木種質幼苗的一致性分析的結果顯示，無論是單胚、多胚還是混胚，其幼苗均有一定程度的變異，因此，在育苗早期根據(jù)形態(tài)和長勢進行除雜是培育優(yōu)質苗木非常重要的步驟。從胚型上講，單胚種質KPJ-023幼苗的變異程度最高，而Z-040的變異程度較低，混胚和多胚的變異程度也較低。這些砧木幼苗的變異株率至少為1%（表5）。

M：標記；1—5：單胚，依次為Y-001（柚）；KPJ-012、KPJ-023（尖葉和圓葉莽山野柑）；Z-040、Z-027（枳）；6—20：多胚，依次為XY-003（香櫞）；KPJ-001、KPJ-007（寬皮柑橘）；XC-013、XC-007、XC-004（香橙）；KPJ-011、KPJ-021（寬皮柑橘）；Y-129（柚雜種）；Z-006、Z-022（枳）；ZZ-004（枳雜種）；Z-024（枳）；ZZ-002（枳雜種）；SC（酸橙）

3 討論

3.1 不同砧木種質的種子性狀分析

優(yōu)良的柑橘砧木不僅要有優(yōu)良的抗逆性，還要有較強的繁殖能力[12]。與接穗品種需要無核或少核果實不同，砧木品種要求單果種子數(shù)量多、質量好、胚型為多胚或混胚以滿足大規(guī)模培育健壯、一致性好的優(yōu)質苗木的需要。本次評價的幾種主要砧木類型中，以枳、枳雜種和香橙的種子性狀較好?？傮w來看，這3種類型砧木的單果種子數(shù)多，為較多核和多核，大部分種子比較飽滿。從胚型上看，這3種類型種質中除了有兩份枳為單胚外，其余均為多胚或混胚。而所評價的寬皮柑橘種質中，不同種質的種子性狀變異較大。單果種子數(shù)有少核、較多核和多核，平均千粒重差異也大。在本次測試的104份柑橘砧木資源中，除香櫞、柚、KPJ-023、KPJ-012為單胚外，其余的砧木資源均以多胚和混胚為主，這一結果與前人研究結果[5,19]一致。砧木種子的千粒重、單胚比例、多胚比例和單果種子數(shù)等多年數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均相對較小，一方面說明不同年份之間觀測值的離散程度較小，更重要的是說明了這些指標受外在因素的影響較小，遺傳穩(wěn)定性較好。本試驗首次在枳種質中發(fā)現(xiàn)了兩份單胚材料，在應用上，這兩份特異資源除可用作砧木育種親本以提高雜種效率外，也是開展基礎研究的好材料。寬皮柑橘砧木種質中，KPJ-023、KPJ-012為單胚，耐寒性強[23]，但對鹽敏感[24]，可以通過雜交育種對其進行遺傳改良。

砧木種質的胚型對大規(guī)模培育一致性好的優(yōu)良柑橘苗木非常重要。如果有可靠的分子標記，可以在砧木雜交后代進行早期檢測，篩選具有多胚性狀的優(yōu)良單株，這樣不僅可以降低育種成本，更重要的是可以縮短選育周期，加快砧木新品種的培育進程。Wang等[15]、Shimada等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在含有RWP結構域基因的啟動子中，MITE片段的插入與柑橘多胚性狀緊密相關。為了充分利用MITE片段插入標記進行雜交砧木的早期篩選，對不同胚型砧木種質進行MITE片段插入的檢測，大部分種質的結果與Wang等[15]和Shimada等[16]報道的一致，說明可以利用此標記對這些類型砧木雜種的多胚性狀進行早期篩選。但是，在檢測的5份枳種質中無論是單胚還是多胚均沒有檢測到MITE插入片段的存在（圖6）。究其原因，一方面可能是枳屬與柑橘屬親緣關系較遠，含有RWP結構域基因的啟動子序列差異較大所導致，另外一種可能是枳的多胚性狀受其他的機制調控。洪棋斌等[25]根據(jù)不同雜交群體的遺傳學分析發(fā)現(xiàn)，柑橘屬和枳屬中的無融合生殖（多胚現(xiàn)象）是受位于細胞核內的兩對互補的顯性基因A1和A2的調控，且其中一對為顯性純合致死效應。因此，關于枳多胚性狀的遺傳調控值得開展進一步的研究。

表5 砧木采種樹與幼苗一致性檢測

表中“-”和“+”分別表示幼苗與種子采種樹的遺傳背景一致和變異

“-” and “+” mean identity and variation of the seedlings with their seed source tree, respectively

3.2 不同砧木種質的早期苗期性狀分析

砧木苗期表現(xiàn)對苗木繁育至關重要。本試驗的104份砧木資源中，不同種類砧木以及相同種類不同種質的出苗率差異明顯。香橙的出苗率最高，其次是枳和枳雜種，而寬皮柑橘的出苗率則相對較低。本次測試的部分砧木出苗率與Sykes[26]報道的結果較為一致或部分較低，這可能與種質的基因型、種子狀態(tài)和培養(yǎng)條件有關。

本次評價的104份砧木中，每種砧木類型均出現(xiàn)不同程度和不同比例的黃化現(xiàn)象，其中黃化率＜5%的種質居多。關于柑橘黃化的研究，大多數(shù)工作都是針對成年樹的黃化，主要原因主要有營養(yǎng)元素缺乏、病害、環(huán)割過度、土壤酸化板結等，但是對苗期黃化的原因研究較少。有研究認為柑橘苗期黃化可能是受遺傳因素和土壤營養(yǎng)狀況影響，也有研究認為是種子發(fā)育不完全造成的。本試驗中砧木幼苗的黃化比例因不同年份而有差異，通過對變異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)砧木黃化率的變異系數(shù)較大，這說明砧木幼苗的黃化可能主要與種子的生理狀態(tài)、苗床基質的營養(yǎng)狀況、管理水平等有關。立枯病是柑橘苗期的主要病害，這4種主要類型的砧木種質中，香橙幼苗對立枯病更為敏感，而枳、枳雜種和寬皮柑橘對立枯病的耐性較好。在生長勢方面，對播種10個月內的幼苗進行比較，枳的株高最高，其次是枳和香橙，而寬皮柑橘則最低。

砧木幼苗遺傳背景的一致性對培育健康、優(yōu)質苗木非常重要。在柑橘育苗早期，根據(jù)葉片形態(tài)和生長勢差異去雜是去除遺傳背景不一致或天然雜種的有效方法[27]。但要培育優(yōu)良砧木品種，對幼苗的一致性檢測是評價的重要指標。理論上講，用作砧木的種子應為多胚以保持砧木遺傳背景的一致性，因為多胚種子的胚主要由珠心細胞發(fā)育而來，其遺傳背景與母本相同。本研究對不同胚型砧木資源幼苗遺傳背景的分析結果顯示，單胚的寬皮柑橘KPJ-023幼苗的變異程度較高，而單胚枳Z-040幼苗的變異程度較低，這說明在開放性授粉條件下，寬皮柑橘KPJ-023與周圍柑橘資源的花期相遇，更容易接受外來花粉產生雜種胚，使后代產生較多變異，而單胚枳Z-040幼苗的變異程度比較低，這可能與枳和其他柑橘的花期不遇以及枳所能使用的標記位點變異較少有關。多胚和混胚種質幼苗的變異程度均比較低，其主要原因在于珠心胚多，且珠心胚的位置更靠近營養(yǎng)輸導組織，在多胚或混胚種子中，珠心胚的數(shù)量和營養(yǎng)優(yōu)勢更加明顯，導致雜種胚的退化，因此，播種后的幼苗主要是珠心苗，其與母本在遺傳背景上更為一致。但多胚種子的幼苗中也出現(xiàn)了少量的變異株，這可能與體細胞變異或有性多胚有關[28]。無論是多胚還是混胚種子的砧木，種子中均存在較低比例的單胚種子，因此，不能排除非常低頻率的雜種胚的可能。

3.3 砧木種子和苗期性狀指標的相互關系

砧木的種子和苗期性狀指標之間存在緊密的相關性。播種10個月內的幼苗株高和莖粗之間呈顯著正相關，而二者與種子的單果種子數(shù)、千粒重、飽滿度呈極顯著的正相關，與胚型呈極顯著負相關關系，說明可以通過篩選種子性狀優(yōu)異的砧木選系以提高苗木的質量。但種子胚型和出苗率之間沒有相關性，這一結果與Scalon等[29]和Kishore等[30]的研究結果相似。主成分分析結果表明，相關性高的指標對主成分的方差貢獻率更高。通過主成分分析，枳、枳雜種、香橙、寬皮柑橘和其他幾種類型的砧木種質之間存在明顯的差異，這些差異與施文格分類系統(tǒng)中對枳屬和柑橘屬內種的分類結果比較一致[5]。這一方面說明這些砧木資源在種子和苗期性狀指標上的性狀差異，另一方面也說明了這些砧木資源在遺傳背景、親緣關系和分類學上的差異，而因為后者的差異才決定了其生物學特性的差異。

4 結論

砧木的種子性狀指標和幼苗苗期性狀指標高度相關，種子性狀優(yōu)異如單果種子數(shù)較多、種子飽滿、多胚、千粒重較重的砧木種質，其幼苗的生長勢較好?？傮w來看，枳的種子和幼苗（播種后10個月）的綜合性狀最好，其次是枳雜種和香橙，寬皮柑橘種子和苗期的綜合性狀最差。本研究對不同砧木的種子和苗期性狀的多年評價結果，可為下一步利用全基因組關聯(lián)分析（GWAS）中挖掘與柑橘砧木種子數(shù)量、胚型及幼苗株高和莖粗相關的候選基因或相關的分子標記研究提供可靠的表型數(shù)據(jù)。

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Seed Traits and Seedling Performances of Different Types of Citrus Rootstock

ZHU ShiPing1, WANG FuSheng1, CHEN Jiao2,3, YU Xin1, YU Hong1, LUO GuoTao1, HU Zhou1, FENG JinYing1, ZHAO XiaoChun1, HONG QiBin1

(1Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences/ National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712;2College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716;3Bureau of Agriculture and Rural Affairs of Fushun County, Fushun 643200, Sichuan)

【Objective】Good rootstock could promote plant growth, improve fruit yield and quality, and enhance stress tolerance and adaptability. Currently in China, mixed genotype of seeds is generally used for propagation of nursery trees. Variable germination, growth, and stress tolerance of seedlings are the common problems significantly affecting the quality of nursery trees, also the performance of orchard plants. This research was aimed to study the key parameters related to the quality of seedlings in different genotypes of rootstocks, to establish the standards for evaluation of rootstock and provide guidelines for selection of superior rootstock. 【Method】 104 different citrus rootstock germplasm accessions were evaluated in five consecutive years on their seed characteristics, such as seed number per fruit, plumpness of seeds, 1 000-grain weight, embryonic type, and the seedling performances, such as germination rate, occurrence of etiolation and blight, and the growth vigor. The uniformity of the seedlings of some rootstock accessions were identified by COS (Conserved Ortholog Sequences) markers. Association of MITE (Miniature inverted-repeat transposable element) insertion with embryonic type was also investigated in some rootstock accessions. 【Result】 (1) Fruits ofand its hybrids, as well asaccessions were highly multi-seeded and multi-seeded. Most of the seeds were plumpy, polyembryonic and mixed-embryonic type. The 1000-grain weight of most accessions was more than 200 g. The seed numbers per fruit in mandarins were highly variable in the range of low-seeded, multi-seeded and highly multi-seeded. Most seeds were medium plumpy and polyembryonic. The 1 000-grain weight in approximately half of the mandarin accessions was less than 100 g. (2) Seedling performances differed among different types of rootstocks.demonstrated the highest frequency of germination, and lower etiolation rate, but the seedlings were sensitive to blight disease. The germination rates ofand its hybrids were lower than that ofbut the etiolation rate was higher. Their seedlings were tolerant to blight disease. The germination rates of most mandarin accessions were comparatively low, and the rates of both etiolation and blight were also low. Comparisons of seedling growth at 10 months after sowing,showed the strongest growth vigor, followed by its hybrids and, while those of mandarins were the least measured by both seedling height and stem diameter. (3) Correlation analysis revealed that except for the occurrences of etiolation and blight, parameters between the traits of seeds and seedlings such as seeds per fruit, 1000-grain weight, plumpness, the mono-embryo rate, poly-embryo rate, embryonic type, the height and the stem diameter of seedlings were tightly correlated at the levels of high significance (＜0.01) or significance (＜0.05). The contribution of each individual parameter to the overall variation was highly different. PCA (principle component analysis) could clearly distinguish the genetic differences between the different types of rootstocks. The coefficient variations of the parameters except for etiolation rate were not significantly variable among different years, indicating those traits were comparatively stable. (4) Results of COS marker showed that mono-embryonic seedlings of mandarin were less uniform than that of mono-embyonic seedlings ofand all the poly-embryonic and mixed-embyonic accessions. MITE insertion was detected in polyembryonic accessions of mandarin,andhybrids, but did not in monoembryonic accessions of mandarin and pummelo. However, MITE insertion did not observed either in monoembryonic or polyembryonic accessions of some. 【Conclusion】Parameters between seed traits and seedling performances were highly correlated. These results indicated that the high quality of seedling was greatly associated with good characters of seed. Measured by overall performance, the characters of both seeds and seedlings ofwere the best, followed byhybrids andthose of mandarins were the worst.

citrus rootstock; seed trait; embryonic type; seedling performance; uniformity

2019-07-09；

2019-09-19

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0201503）、現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系項目（CARS-26）、中央高?；緲I(yè)務費（XDJK2016B024）、國家柑桔工程技術研究中心開放課題資助項目、重慶市現(xiàn)代山地特色高效農業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊建設計劃（晚熟柑桔脆李技術體系）、西南大學雙一流學科建設項目、西南大學博士/引進人才計劃基金（SWU117038）

朱世平，E-mail：zhushiping@cric.cn。通信作者洪棋斌，E-mail：hongqibin@cric.cn

（責任編輯 趙伶俐）