高源，王大江，王昆，叢佩華，張彩霞，李連文，樸繼成

基于葉綠體DNA變異的山荊子種質(zhì)遺傳多樣性和系統(tǒng)演化

高源，王大江，王昆，叢佩華，張彩霞，李連文，樸繼成

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

【目的】山荊子是中國(guó)原產(chǎn)蘋果屬植物中分布最廣泛的種，母系遺傳的葉綠體基因組的非編碼區(qū)適用于較低的分類階元（如科、屬）的系統(tǒng)研究。對(duì)野外考察新收集的山荊子種質(zhì)的葉綠體DNA（cpDNA）非編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，解析其序列遺傳變異，從母系遺傳基因的角度探究山荊子不同居群的遺傳多樣性和系統(tǒng)演化關(guān)系，為我國(guó)山荊子種質(zhì)資源的起源演化以及收集和保護(hù)提供理論依據(jù)。【方法】利用4對(duì)葉綠體DNA引物擴(kuò)增新收集的215份山荊子種質(zhì)資源的4個(gè)非編碼區(qū)H-A、S-G spacer+intron、T-5'L和5'L-F，對(duì)每個(gè)基因間區(qū)正反向測(cè)序獲得的序列進(jìn)行人工校對(duì)后，使用MEGA 7.0進(jìn)行序列拼接和比對(duì)，并構(gòu)建山荊子不同居群間基于遺傳距離的Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹；使用DnaSP ver5.10.01計(jì)算葉綠體DNA的遺傳多樣性參數(shù)，計(jì)算不同居群間的基因流和基因分化；利用Arlequin v3.5分析標(biāo)準(zhǔn)分子變異（AMOVA）；運(yùn)用NetWork ver4.6.1.2構(gòu)建種內(nèi)居群間的葉綠體DNA單倍型鄰接網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。【結(jié)果】4個(gè)葉綠體DNA非編碼區(qū)經(jīng)測(cè)序、拼接、比對(duì)和合并之后的片段長(zhǎng)度為3 777 bp，共有171個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)，其中包含150個(gè)插入-缺失位點(diǎn)、20個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和1個(gè)單一突變位點(diǎn)。在215份山荊子種質(zhì)中，H-A、S-G spacer + intron、T-5'L和5'L-F區(qū)域的變異位點(diǎn)數(shù)量分別為26、32、103和10個(gè)，單倍型數(shù)量分別為8、8、6和4個(gè)，合并之后的葉綠體DNA片段的單倍型為24個(gè)。核苷酸多樣性最高的區(qū)域?yàn)門-5'L（Pi=0.01174），單倍型（基因）多樣性最高的為S-G spacer+intron（d=0.599），最低的為5'L-F（d=0.228）。215份山荊子種質(zhì)葉綠體DNA多樣性較高（d=0.727，Pi=0.00577）。Tajima’s D檢驗(yàn)中，4個(gè)cpDNA區(qū)域在各檢驗(yàn)水平上均不顯著，檢測(cè)的4個(gè)cpDNA區(qū)域在進(jìn)化上遵循中性模型。AMOVA分析表明遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部?！窘Y(jié)論】供試4個(gè)葉綠體DNA非編碼區(qū)適合蘋果屬山荊子種質(zhì)遺傳多樣性和系統(tǒng)演化分析。在葉綠體DNA水平導(dǎo)致山荊子群體進(jìn)化的原因不是自然選擇，而是突變壓力和遺傳漂變。群體間遺傳分化與其地理距離不完全相關(guān)。山荊子可能為多點(diǎn)起源，推測(cè)黑龍江和吉林，內(nèi)蒙古，甘肅和山西為3個(gè)可能的起源地區(qū)。

山荊子；葉綠體DNA；非編碼區(qū)；遺傳多樣性；系統(tǒng)演化

0 引言

【研究意義】山荊子（( L.) Borkh．），又稱山定子[1]，屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Mill．）[2]山荊子組（Sect.Koehne Ser.）山荊子系（Ser.Rehd.）[3]。山荊子在蘋果屬植物中分布最廣泛，屬東亞分布型，但多分布于我國(guó)境內(nèi)[4]，在近些年的野外考察地點(diǎn)都可以見到[5]。山荊子用途極廣，在園林造景上廣泛應(yīng)用，在蘋果生產(chǎn)上多用作砧木，還可用于抗性砧木的選育，是蘋果屬植物中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的珍貴野生種。從多角度充分研究山荊子的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)是對(duì)豐富的山荊子野生資源開發(fā)利用的前提?；谝巴饪疾焓占降奶O果屬植物，從母系遺傳基因的角度研究蘋果屬植物的遺傳多樣性水平，探究其原生境的系統(tǒng)演化途徑，對(duì)指導(dǎo)蘋果屬植物的收集和保護(hù)，探討蘋果屬不同種的系統(tǒng)演化具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】山荊子原產(chǎn)于亞洲東北部，在長(zhǎng)期演變和進(jìn)化過程中形成了豐富的變異類型[6]，現(xiàn)主要分布于中國(guó)的東北、華北及西南地區(qū)[7-9]，其現(xiàn)代高度適生區(qū)為山西太行山、管涔山和呂梁山，吉林和遼寧東北部，陜甘寧交界處，河北北部和魯中南地區(qū)[10]。山荊子表型多樣性變異豐富，居群遺傳分化和親緣關(guān)系復(fù)雜[11-16]。從分子角度，以往利用RAPD[13]、ISSR[17]和SSR[18-19]分子標(biāo)記方法對(duì)多個(gè)山荊子居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，推測(cè)山荊子起源于中國(guó)華北和東北[18]，河北山荊子的遺傳多樣性水平最高，并且主要在群體內(nèi)和個(gè)體內(nèi)部發(fā)生遺傳變異和分化[19]。以往主要利用表型和少量基因組分子標(biāo)記研究其遺傳多樣性，尚未從母系遺傳基因的角度對(duì)山荊子群體之間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行解析。鄒旭等[10]從氣候變化的角度對(duì)末次盛冰期以來的中國(guó)山荊子分布格局進(jìn)行了預(yù)測(cè)，但是現(xiàn)存的山荊子各居群間的系統(tǒng)演化關(guān)系則需要更多基因變異方面的證據(jù)加以驗(yàn)證。葉綠體基因組高度保守，非編碼區(qū)進(jìn)化速度較快，適用于較低的分類階元（如科、屬）的系統(tǒng)研究[20]。在植物中利用葉綠體基因組序列可直接進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)[21]，在植物系統(tǒng)發(fā)育研究中，葉綠體基因組母系遺傳基因的特點(diǎn)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[22]，在植物系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性和親緣演化關(guān)系等研究方面發(fā)揮著重要作用[23]。國(guó)外學(xué)者利用一至兩個(gè)葉綠體DNA（cpDNA）區(qū)域較早地開展了蘋果屬栽培品種和野生近緣種的葉綠體DNA變異和親緣關(guān)系等的研究[24-27]，丁芳兵[28]利用葉綠體基因k與核糖體基因相結(jié)合研究湖北海棠與近緣種的親緣關(guān)系；朱元娣等[29]利用相同的基因區(qū)域研究了新疆野蘋果與中國(guó)蘋果的系統(tǒng)發(fā)育，并得出的葉綠體基因k并不適用于栽培蘋果種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)論；徐榕雪[30]也利用該區(qū)域的內(nèi)含子序列信息，構(gòu)建了蘋果屬23個(gè)種共27份材料系統(tǒng)發(fā)育樹，但僅獲得遺傳變異信息位點(diǎn)23個(gè)，推斷k不太適合近緣種間及種下類群材料的遺傳關(guān)系分析。李慧峰[31]利用L-F序列構(gòu)建的泰沂山區(qū)蘋果屬植物系統(tǒng)樹在一定程度上可以支持表型分類結(jié)果，但無法有效解決其復(fù)雜遺傳背景下的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。葉綠體單個(gè)基因或單個(gè)基因間隔區(qū)難以滿足具有復(fù)雜遺傳背景的果樹種質(zhì)資源的遺傳分析要求，葉綠體基因組用于系統(tǒng)發(fā)育的研究已經(jīng)發(fā)展到多個(gè)基因及基因間隔區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)組合分析的階段[32-34]。由此可見，要利用葉綠體DNA對(duì)具有復(fù)雜遺傳背景的蘋果屬植物的遺傳變異分析，需要用大群體、進(jìn)化速率快的多個(gè)區(qū)域才可實(shí)現(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著葉綠體DNA研究技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，基于2008—2015年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃野外考察新收集入圃的蘋果屬山荊子種質(zhì)資源，在前期利用表型鑒定其代表性和SSR分子標(biāo)記遺傳評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上[19]，研究其葉綠體DNA多個(gè)非編碼區(qū)的遺傳變異，從母系遺傳基因的角度進(jìn)一步揭示山荊子的遺傳多樣性和系統(tǒng)演化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)新收集的215份山荊子種質(zhì)資源的4個(gè)非編碼區(qū)利用4對(duì)通用的葉綠體DNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，分析4個(gè)葉綠體DNA間區(qū)序列的遺傳變異，解析山荊子群體在葉綠體DNA水平上的遺傳多樣性，探討7個(gè)山荊子居群間的系統(tǒng)演化關(guān)系，為山荊子的起源演化及收集和保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試種質(zhì)中MB84—MB101采自國(guó)家果樹種質(zhì)公主嶺寒地果樹圃（吉林省公主嶺），其余種質(zhì)均采自國(guó)家果樹種質(zhì)興城梨、蘋果圃（遼寧省興城市）。2008—2015年，多次赴山荊子的主要分布區(qū)域內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西和甘肅等地進(jìn)行考察和收集，在野外通過表型鑒定為山荊子本種后，記錄種質(zhì)地理信息，采集表型差異較大的種質(zhì)接穗，分別入兩個(gè)圃嫁接繁殖，育成植株作為種質(zhì)保存。于2017年春季采集山荊子種質(zhì)的健康幼嫩葉片，葉片經(jīng)硅膠干燥之后備用；2018年完成所有材料4個(gè)葉綠體DNA非編碼區(qū)測(cè)序，所有供試山荊子材料信息見電子附表1。215份材料包括來自于內(nèi)蒙古42份、黑龍江83份、河北54份、吉林18份、山西13份、甘肅4份和遼寧1份。

1.2 DNA提取

采用德國(guó)QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒提取供試材料春季嫩葉的基因組DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，一部分提取DNA原液-20℃冷凍保存，一部分原液稀釋至40 ng·μL-1備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

為保證雙向測(cè)序能夠測(cè)通葉綠體通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，從Shaw等[35]報(bào)道的葉綠體DNA序列中選取無回文結(jié)構(gòu)的基因區(qū)間和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在1 500 bp以下的葉綠體通用引物，4個(gè)基因間區(qū)H-A、S-G spacer + intron、T-5'L和5'L-F對(duì)應(yīng)的4對(duì)葉綠體通用引物（表1）由上海生工（Sangon）有限公司合成。50 μL的PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，正向和反向引物（10 μmol?L-1）各2.5 μL，d NTP（2.5 mmol?L-1）（Takara，Japan）5 μL，10×Buffer 5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U?μL-1）（Takara，Japan）0.6 μL，ddH2O 32.4 μL。參照Volk等[36]報(bào)道的反應(yīng)條件，對(duì)4個(gè)基因間區(qū)的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化（表2）。215份種質(zhì)4個(gè)葉綠體間區(qū)的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），對(duì)于擴(kuò)增成功并得到單一條帶的樣品直接送測(cè)序公司（上海美吉測(cè)序公司（北京））進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序儀為美國(guó)ABI 3730 DNA Sequencer。每個(gè)樣品在每個(gè)葉綠體DNA間區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行正、反向測(cè)序，215份材料的4個(gè)間區(qū)的葉綠體DNA序列全部測(cè)通。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)基因間區(qū)正、反向測(cè)序獲得的序列進(jìn)行人工校對(duì)，并使用MEGA 7.0[37]軟件進(jìn)行序列拼接、序列比對(duì)以及4個(gè)葉綠體DNA基因間區(qū)片段H-A、S-G spacer+intron、T-5'L和5'L-F的合并。所有拼接序列、比對(duì)序列都被保存為FASTA和MEGA格式。

表1 4個(gè)葉綠體基因間區(qū)及4對(duì)葉綠體DNA引物序列

表2 山荊子4個(gè)葉綠體基因間區(qū)的PCR擴(kuò)增

圖1 部分蘋果樣品在葉綠體DNA間區(qū)trnH-psbA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖

將單個(gè)區(qū)域片段和合并之后的片段保存后，使用DnaSP ver5.10.01[38]軟件計(jì)算山荊子種質(zhì)葉綠體DNA的遺傳多樣性參數(shù)，包括：變異位點(diǎn)（Vs）、單一突變位點(diǎn)（Ss）、簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)（Ps）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異（k）、單倍型數(shù)目（）、單倍型多樣性（d）、單倍型多樣性方差（Vh）、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差（Sh）和Tajima’s D值（Tajima’s D）。Tajima’s D值是檢驗(yàn)樣品葉綠體DNA區(qū)域是否遵循中性進(jìn)化模型的重要參數(shù)?；?個(gè)葉綠體DNA區(qū)域合并片段的山荊子種質(zhì)資源的葉綠體基因單倍型保存為Nexus文件，分別利用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)（median-Joining network，MJ）算法和最大簡(jiǎn)約（maximum parsimony calculation，MP）算法進(jìn)行計(jì)算和優(yōu)化，運(yùn)用NetWork ver4.6.1.2構(gòu)建種內(nèi)居群間的葉綠體DNA單倍型鄰接網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。

使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建山荊子種內(nèi)居群間基于遺傳距離的Neighbour-Joining（NJ）[39]系統(tǒng)發(fā)育樹，并劃分居群組合。使用DnaSP ver5.10.01軟件計(jì)算種內(nèi)不同居群間的基因流和基因分化，評(píng)價(jià)種內(nèi)不同居群間的基因交流。使用Arlequin v3.5[40]軟件分析分子變異，選擇“標(biāo)準(zhǔn)分子變異分析”（standard molecular variation analysis，AMOVA）方法進(jìn)行計(jì)算，用20 000次排列來檢測(cè)不同分組變異的差異顯著性，評(píng)價(jià)種群內(nèi)居群間的遺傳分化。

2 結(jié)果

2.1 山荊子葉綠體DNA的多態(tài)性

4對(duì)葉綠體通用引物對(duì)215份中國(guó)原產(chǎn)蘋果屬植物山荊子的4個(gè)葉綠體DNA間區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，H-A、S-G spacer + intron、T-5'L和5'L-F在所有樣本中的序列長(zhǎng)度范圍分別為261—278 bp、1 367—1 383 bp、1 064—1 093 bp和957—965 bp，進(jìn)行序列比對(duì)后，4個(gè)區(qū)域的片段長(zhǎng)度分別為285、1 383、1 140和965 bp。其中，區(qū)域T-5'L核苷酸多態(tài)性最高，有92個(gè)插入-缺失位點(diǎn)和11個(gè)簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)；285 bp的非編碼區(qū)H-A有2個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和24個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，區(qū)域spacerintron有1個(gè)單一突變位點(diǎn)、5個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和26個(gè)插入-缺失位點(diǎn)；區(qū)域5'L-F的核苷酸多態(tài)性最低，簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)和插入-缺失位點(diǎn)分別僅有2個(gè)和8個(gè)。4個(gè)葉綠體基因間區(qū)序列組合之后長(zhǎng)度范圍為3 675—3 693 bp，經(jīng)序列比對(duì)之后的長(zhǎng)度為3 773 bp，含有150個(gè)插入-缺失位點(diǎn)、20個(gè)簡(jiǎn)約信息性位點(diǎn)和1個(gè)單一突變位點(diǎn)，共計(jì)171個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)（表3）。

215份中國(guó)原產(chǎn)蘋果屬植物山荊子的4個(gè)葉綠體間隔間區(qū)共有變異位點(diǎn)171個(gè)，區(qū)域H-A、S-G spacer+intron、T-5'L和5'L-F的變異位點(diǎn)分別為26、32、103和10個(gè)，區(qū)域T-5'L含有其中60.2%的變異位點(diǎn)，是山荊子4個(gè)葉綠體DNA間區(qū)中多態(tài)性較高的區(qū)域。核苷酸多樣性（Pi）和平均核苷酸差異（k）最大和最小的區(qū)域分別為T-5'L（Pi=0.01174，k=15.68937）和5'L-F（Pi=0.00045，k=0.44216）。H-A、S-G spacer+intron、T-5'L和5'L-F區(qū)域單倍型數(shù)目（）分別為8、8、6和4個(gè)，以S-G spacer+intron區(qū)域單倍型（基因）多樣性（d）最高為0.599，但其5'L-F單倍型（基因）多樣性（d）最低為0.228。區(qū)域T-5'L的單倍型多樣性方差和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.00168和0.041，均為4個(gè)區(qū)域中最高值。區(qū)域S-G spacer+intron單倍型多樣性雖然最高，但其單倍型多樣性方差和標(biāo)準(zhǔn)差均為最低，分別為0.00111和0.033（表4）。

215份山荊子的4個(gè)葉綠體DNA間區(qū)組合之后的片段共有24個(gè)單倍型，各種質(zhì)所屬單倍型見電子附表1。核苷酸多樣性、平均核苷酸差異、單倍型多樣性、單倍型多樣性方差和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.00577、23.79039、0.727、0.00084和0.029。

表3 供試山荊子的4個(gè)cpDNA區(qū)域的多態(tài)性信息

表4 供試山荊子葉綠體DNA單倍型多樣性

對(duì)4個(gè)區(qū)域進(jìn)行Tajima’s測(cè)驗(yàn)，Tajima’s D值全部為負(fù)值，區(qū)域5'L-F的Tajima’s D值最低，為-1.70516，區(qū)域T-5'L的Tajima’s D值最高，為-0.29083。除區(qū)域5'L-F的D值在0.05＜＜0.10＞水平上不顯著，其余3個(gè)區(qū)域的D值均在＞0.10水平上不顯著。4個(gè)區(qū)域合并之后，Tajima’s D值為-0.54177，在＞0.10水平上不顯著（表5）。

表5 215份山荊子葉綠體 DNA 片段的Tajima’s D值

2.2 山荊子的遺傳分化

將215份山荊子按照來源省份分為7個(gè)群體（表6），對(duì)7個(gè)群體間的基因流、基因變異和分子變異進(jìn)行分析。分子變異分析的結(jié)果表明遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，占全部變異的93.03%，約6.97%的變異來自于居群之間，群體內(nèi)和群體間可遺傳變異的相關(guān)性均極顯著（＜0.001）（表7）。群體間3個(gè)遺傳分化系數(shù)（=0.11345，=1.95；=0.06494，=3.60；=0.11353，=1.95）均不高，3個(gè)遺傳分化系數(shù)體現(xiàn)出來的7個(gè)群體間的遺傳變異分別為11.345%、6.494%和11.353%，與群體分子變異方差分析（AMOVA）中群體間方差分量的貢獻(xiàn)率相近；而群體內(nèi)的遺傳變異分別為88.655%、93.506%和88.467%，都說明遺傳變異主要存在于群體內(nèi)部。

遼寧山荊子群體只有1份材料，因此只用剩余6個(gè)山荊子群體計(jì)算兩兩群體間的分化系數(shù)。6個(gè)群體兩兩間分化系數(shù)為-0.0247—0.216，甘肅和山西山荊子群體間遺傳分化系數(shù)最低為-0.024，其次是黑龍江與吉林山荊子群體間遺傳分化系數(shù)為0.002，甘肅與吉林山荊子群體間遺傳分化系數(shù)最高，為0.0216。群體間遺傳分化系數(shù)與其地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)（表8）。

2.3 山荊子居群間的遺傳關(guān)系

計(jì)算7個(gè)山荊子群體間的遺傳距離并用Neighbour-Joining（NJ）的方法構(gòu)建聚類樹?；诰尤洪g遺傳距離，在NJ聚類樹上分成2個(gè)明顯的類群。黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和山西的山荊子群體可歸為類群Ⅰ，4個(gè)?。▍^(qū)）接壤連在一起，該類群分組與地理距離相關(guān)；類群Ⅱ有河北和甘肅山荊子群體，該類群分組與地理距離不相關(guān)（圖2）。

表6 215份山荊子按來源省份的7個(gè)群體

表7 山荊子居群的分子變異分析

表8 6個(gè)來源地區(qū)山荊子群體間遺傳分化系數(shù)

圖2 基于群體間遺傳距離構(gòu)建的山荊子一致性NJ樹

2.4 山荊子葉綠體DNA單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

分別運(yùn)用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法和最大簡(jiǎn)約算法來計(jì)算和優(yōu)化山荊子葉綠體DNA單倍型間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，構(gòu)建蘋果屬山荊子種質(zhì)葉綠體DNA單倍型的關(guān)聯(lián)圖（圖3）。單倍型和中介矢量位點(diǎn)分別用H和mv表示。H1、H7、H21和H22位于中介網(wǎng)絡(luò)圖的軀干（Tarso）上，說明H1、H7、H21和H22分化時(shí)間要早，是較為原始的單倍型。網(wǎng)絡(luò)圖中只有一個(gè)缺失的單倍型mv1。變異位點(diǎn)上，H1與H7有1個(gè)位點(diǎn)差異，H1與H21有2個(gè)差異，H1與H22有1個(gè)差異，H7與H21有1個(gè)差異，H7與H22有2個(gè)差異，H21與H22有1個(gè)差異。網(wǎng)絡(luò)圖中H1包含H6、H13、H14、H18和H23，H16包含H17。105份山荊子種質(zhì)的單倍型為H1，包含河北山荊子24份、黑龍江山荊子45份、吉林山荊子12份、遼寧山荊子1份、內(nèi)蒙古山荊子14份、山西山荊子9份；3份山荊子種質(zhì)的單倍型為H6，包含黑龍江山荊子2份和吉林山荊子1份；H13為1份來自吉林的山荊子，H14為1份來自內(nèi)蒙古的山荊子，H18為2份來自內(nèi)蒙古的山荊子，H23為來自河北的1份山荊子。H1單倍型組中包含了大部分的黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和山西山荊子，遺傳分化較小。這進(jìn)一步證實(shí)了黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和山西的山荊子群體遺傳關(guān)系較近。

H7為2份黑龍江山荊子，H21為1份山西山荊子，H22為1份甘肅山荊子和2份河北山荊子。H3為3份黑龍江山荊子和1份內(nèi)蒙古山荊子，H4為1份黑龍江山荊子和1份內(nèi)蒙古山荊子，H5為8份河北山荊子和8份黑龍江山荊子，H7、H8和H9分別是2份、1份和1份黑龍江山荊子，H10包含6份河北山荊子、1份黑龍江和1份吉林山荊子，H11為1份吉林山荊子，H12為12份河北山荊子和1份吉林山荊子，H15包含的甘肅、黑龍江、內(nèi)蒙古和山西山荊子分別是1份、1份、4份和3份，H16包含的甘肅、黑龍江和內(nèi)蒙古山荊子分別是1份、1份和2份，H17為1份內(nèi)蒙古山荊子，H19和H20分別為1份內(nèi)蒙古山荊子和1份河北山荊子，H24為1份甘肅山荊子。

河北山荊子單倍型最多，有H1、H5、H10、H12、H20、H22和H23共7個(gè)單倍型；甘肅山荊子有4個(gè)單倍型，分別為H15、H16、H22和H24，H15、H16和H24均是由H22衍生的單倍型，而H22只有1份甘肅山荊子和2份河北山荊子。從葉綠體基因單倍型上，進(jìn)一步證實(shí)了河北和甘肅山荊子群體的遺傳關(guān)系較近。

3 討論

山荊子葉綠體DNA多樣性研究涉及到的區(qū)域有H-A、S-G spacer+intron、T-5'L和5'L-F，核苷酸多樣性最高的區(qū)域?yàn)門-5'L，單倍型（基因）多樣性最高的為S-G spacer+ intron，最低的為5'L-F。梨屬植物葉綠體DNA間隔區(qū)D-I和L-F的多態(tài)性最高[41]。梨和蘋果分別為薔薇科的梨屬和蘋果屬植物，其在母系遺傳基因進(jìn)化過程中出現(xiàn)了較大的差異，充分體現(xiàn)出非編碼區(qū)適用于較低的分類階元（如科、屬）的系統(tǒng)研究[20]。

圖3 基于山荊子4個(gè)葉綠體基因間區(qū)合并序列的單倍型中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖（Median-Joining network，MJ）

葉綠體DNA的非編碼區(qū)在被子植物中的遺傳變異有倒位、易位、插入/缺失和核苷酸替換等[42]，可利用其豐富的遺傳變異有效進(jìn)行親本鑒定、遺傳多樣性分析以及系統(tǒng)發(fā)育等研究[41,43-44]。本研究4個(gè)葉綠體基因區(qū)域的突變類型主要表現(xiàn)為點(diǎn)突變、堿基插入或缺失。4區(qū)域合并后的山荊子葉綠體DNA遺傳多樣性（d=0.727，Pi=0.00577）高于前人在梨屬豆梨[45]上鑒定的遺傳多樣性（d=0.719，Pi=0.00105），略低于梨屬杜梨[46]的遺傳多樣性（d=0.807）。Tajima’s D檢驗(yàn)中，4個(gè)cpDNA區(qū)域在各檢驗(yàn)水平上均不顯著，說明檢測(cè)的4個(gè)cpDNA區(qū)域在進(jìn)化上遵循中性模型，在分子水平導(dǎo)致進(jìn)化的原因不是自然選擇，而是突變壓力和遺傳漂變。

按照山荊子來源區(qū)域劃分群體后，經(jīng)過對(duì)山荊子群體的分子變異分析明確了群體內(nèi)差異是遺傳變異的主要來源。3個(gè)遺傳分化系數(shù)中，按照NEI等[47]方法計(jì)算遺傳分化系數(shù)與分子變異計(jì)算結(jié)果最接近。同時(shí)，顯著大于，暗示山荊子居群中存在譜系地理結(jié)構(gòu)。譜系地理探討物種及種內(nèi)居群形成當(dāng)前分布格局的演化過程和歷史原因，根據(jù)物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合個(gè)體地理分布，可以推測(cè)擴(kuò)張、瓶頸效應(yīng)、地理隔離和遷移等居群歷史事件[48]。因此，對(duì)于暗示存在譜系地理結(jié)構(gòu)的山荊子，基于其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)合其地理信息，研究其譜系地理是山荊子種質(zhì)資源進(jìn)一步的研究重點(diǎn)。

兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)值均小于0.05。按照WRIGHT的理論[49]，值為0—0.05的群體間不存在遺傳分化，值為0.05—0.15的群體間為中度遺傳分化，值為0.15—0.25的群體間為高度分化。所有供試群體的值為0.11345，各群體間綜合評(píng)價(jià)為中度遺傳分化，表明供試山荊子的各群體曾在過去的某個(gè)時(shí)間相互發(fā)生過基因交流，但同時(shí)又抵制了基因漂變導(dǎo)致的群體間的遺傳分化。河北和吉林山荊子群體、河北和黑龍江山荊子群體、黑龍江和吉林山荊子群體值介于0—0.05，其群體間不存在遺傳分化；內(nèi)蒙古和山西山荊子群體、內(nèi)蒙古和吉林山荊子群體、山西和吉林山荊子群體、黑龍江和內(nèi)蒙古山荊子群體、黑龍江和山西山荊子群體、河北和山西山荊子群體的值在0.15—0.25，其兩兩群體間為中度分化；甘肅與黑龍江山荊子群體、甘肅與吉林山荊子群體、甘肅與內(nèi)蒙古山荊子群體、甘肅與河北山荊子群體、河北與內(nèi)蒙古山荊子群體間的值在0.15—0.25，其群體間高度遺傳分化。值越大，表明群體間遺傳差異程度越大，同時(shí)群體越穩(wěn)定，群體間基因交流越少；反之，值越低，表明群體間的基因交流越頻繁，群體基因的穩(wěn)定性就越差[50]。值通常介于0—1，而甘肅和山西山荊子群體間的遺傳分化系數(shù)為負(fù)值，說明其基因交流更加頻繁。除與山西山荊子群體，甘肅群體與另外4個(gè)省份的山荊子群體間均為高度的遺傳分化，基因交流最少，甘肅群體最穩(wěn)定。而河北與黑龍江山荊子群體間以及河北與吉林山荊子群體間的遺傳分化值，僅略低于黑龍江與吉林群體間的遺傳分化值。河北與黑龍江山荊子群體間以及河北與吉林山荊子群體間均無遺傳分化，基因交流頻繁，這與高源等[19]基于SSR對(duì)山荊子進(jìn)行的群體遺傳分化分析得出的結(jié)論相同。中國(guó)河北蘋果栽培歷史悠久，山荊子作為其中一種砧木，隨苗木在各地交流頻繁，供試河北山荊子主要來源于果區(qū)山地或廢棄果園旁邊，而黑龍江和吉林山荊子主要來源于原生境群落，推測(cè)部分河北山荊子可能主要來源于黑龍江和吉林地區(qū)。群體間基于遺傳距離的聚類分析表明，黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和山西山荊子群體間的遺傳距離相對(duì)較近，而甘肅與河北山荊子群體間遺傳距離較近。

所有山荊子種質(zhì)共有24個(gè)單倍型，有4個(gè)單倍型位于中介鄰接網(wǎng)絡(luò)的軀干上，其中單倍型H1包含了6個(gè)來源地區(qū)的105份山荊子種質(zhì)，是所有單倍型中種質(zhì)數(shù)量最多、來源最廣泛的。若單倍型在種群或居群中覆蓋范圍最廣、出現(xiàn)頻率最高，并處于單倍型網(wǎng)絡(luò)的中心位置，那么這種單倍型很可能是網(wǎng)絡(luò)圖的所有單倍型中最為古老的類型[51]。因此，H1單倍型可以被認(rèn)為是最古老的單倍型。以H1為中心呈星狀輻射，說明其發(fā)生種群擴(kuò)張。位于軀干上的閉合環(huán)所包含的4個(gè)單倍型涵蓋了除甘肅外的所有來源地區(qū)，而處于鄰接網(wǎng)絡(luò)外圍的單倍型也涵蓋了所有來源地區(qū)。

不同群體種質(zhì)數(shù)量的差異可能會(huì)影響群體內(nèi)的遺傳多樣性水平和群體間的遺傳分化系數(shù)，雖然在遺傳分化的分析過程中去除了僅有1份種質(zhì)的遼寧山荊子群體，但不同來源的山荊子群體之間的遺傳關(guān)系和遺傳分化不完全與地理距離相關(guān)的情況，有可能是不同來源的群體數(shù)量差異造成的。因此，還要繼續(xù)加大種質(zhì)資源收集的力度，對(duì)于群體數(shù)量比較少的區(qū)域，進(jìn)一步細(xì)化收集區(qū)域，目標(biāo)是即使以少量的種質(zhì)也能代表該區(qū)域的遺傳變異；對(duì)于群體數(shù)量比較多的區(qū)域，擴(kuò)大考察范圍，可能會(huì)有新的葉綠體基因單倍型出現(xiàn)，為蘋果屬不同種以及種下類型的起源和演化提供新的證據(jù)。

4 結(jié)論

山荊子可能為多點(diǎn)起源。結(jié)合山荊子遺傳分化和遺傳關(guān)系的分析，推測(cè)黑龍江和吉林為一個(gè)起源地，地域跨度大的內(nèi)蒙古為一個(gè)起源地，甘肅和山西為一個(gè)起源地，3個(gè)區(qū)域分別由大興安嶺和陰山山脈分隔；河北地區(qū)山荊子含有最古老的單倍型，但受人為散播的影響，其為初生分布中心還是次生分布中心有待進(jìn)一步研究。各個(gè)起源地區(qū)的山荊子經(jīng)歷著種群擴(kuò)張的進(jìn)化過程，同時(shí)作為砧木在各地區(qū)間交流頻繁程度的不同造成各地區(qū)間山荊子遺傳分化的差異。

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Genetic Diversity and Phylogenetics of(L.) Borkh Revealed by Chloroplast DNA Variation

GAO Yuan, WANG DaJiang, WANG Kun, CONG PeiHua, ZHANG CaiXia, LI LianWen, PIAO JiCheng

(Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】(L.) Borkh is the most widely distributed native species in China. The non-coding region of chloroplast genome by maternal inheritance is suitable for the systematic study of lower taxonomic levels (such as families and genera). The non-coding regions of cpDNA of 215 germplasms were sequenced, and their genetic variation was analyzed. In this study, the genetic diversity ofand the phylogenetic relationship among different populations were explored from the perspective of maternal inheritance, which provided a theoretical basis for origin and genetic evolution, collection and protection ofgermplasm resources in China.【Method】Four non-coding regions (H-A,S-G spacer + intron,T-5'L and 5'L-F) of 215 germplasms were amplified by four primers. After manually proofreading sequences obtained through forward and backward sequencing, MEGA 7.0 was used for sequence splicing and alignment, and based on genetic distance, the Neighbour-Joining phylogenetic tree was constructed among different populations of. DnaSP ver5.10.01 was used to calculate the genetic diversity parameters of chloroplast DNA, gene flow and gene differentiation among different populations. Arlequin v3.5 was used to analyze standard molecular variation (AMOVA), and NetWork 4.6.1.2 was used to construct Median-Joining network for cpDNA haplotypes among intraspecific populations of.【Result】The length of four non-coding regions of chloroplast DNA was 3 777 bp after sequencing, splicing, alignment and merging, and 171 variable sites were detected, which included 1 singleton variable sites, 20 parsimony informative sites and 150 insertion-deletion gaps. Among 215 accessions of, the number of variable sites of regionH-A,S-G spacer + intron,T-5'L and 5'L-F were 26, 32, 103 and 10, respectively. The number of haplotypes for four regions were 8, 8, 6 and 4, respectively, and after four regions merged, the haplotypes of chloroplast DNA fragments were 24. The region with highest nucleotide diversity wasT-5'L (Pi=0.01174), and the region with highest haplotype diversity wasS-G spacer + intron (d=0.599), and the haplotype diversity of 5'L-F was the lowest (d=0.228). The cpDNA diversity ofwas high (d=0.727, Pi=0.00577).Tajima’s test showed all Tajima’s D values were not statistical at different levels, which indicated that variation of those chloroplast regions followed natural theory of molecular evolution. AMOVA showed that genetic variation mainly existed within populations.【Conclusion】The four non-coding regions of chloroplast DNA were suitable for the analysis of genetic diversity and phylogenetics of. At the cpDNA level, it was not natural selection, but mutation pressure and genetic drift that led to population evolution of. The genetic differentiation among populations was not completely correlated with their geographical distance.might originate from several sites, and the three possible origins, including Heilongjiang and Jilin, Inner Mongolia, Gansu and Shanxi, were inferred.

; chloroplast DNA; non-coding region; genetic diversity; phylogenetics

2019-07-21；

2019-11-01

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303093）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2018-RIP-02）、農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)（NB2015-2130135-39）

高源，E-mail：gaoyuan02@caas.cn。通信000作者王昆，E-mail：wangkun5488@163.com。通信作者叢佩華，E-mail：congph@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）