張宗源，蔣詠梅,章文賢

組蛋白乙酰化對(duì)靈芝生長(zhǎng)、靈芝多糖和靈芝酸生物合成的影響

張宗源1,2，蔣詠梅1,章文賢1

（1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350108；2河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

【目的】組蛋白乙?；揎棇?duì)真菌生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝合成具有重要的調(diào)控作用。研究組蛋白乙?；瘜?duì)靜置培養(yǎng)的靈芝生長(zhǎng)發(fā)育和主要代謝物合成的影響，為表觀遺傳手段提高靈芝多糖和靈芝酸生物合成提供理論依據(jù)。【方法】采用液體振蕩-靜置兩階段法培養(yǎng)靈芝。在靜置培養(yǎng)階段添加不同濃度（0、0.6、60、120和180 μmol·L-1）辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA），采用常規(guī)方法測(cè)定或觀察靈芝生物量、糖消耗、上層菌絲膜形成、菌絲體形態(tài)、靈芝孢子生成以及靈芝酸和靈芝多糖生物合成，利用蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定靈芝組蛋白乙?；剑焕胵RT-PCR技術(shù)對(duì)靈芝多糖（和）、靈芝酸（、、和）生物合成關(guān)鍵基因以及靈芝全局調(diào)控因子相關(guān)基因（和）進(jìn)行表達(dá)分析。【結(jié)果】SAHA處理使靈芝組蛋白H4乙?；教岣?，最高為對(duì)照組的1.6倍；抑制了靈芝菌絲體生長(zhǎng)和色素產(chǎn)生，改變了菌絲體的形態(tài)。靈芝孢子的形成也受到抑制，且SAHA濃度越大，抑制程度越明顯。SAHA處理顯著增加了靈芝多糖的產(chǎn)量，最高增加50%；靈芝酸生物合成受到抑制，與對(duì)照相比降低13%—27%；qRT-PCR分析結(jié)果表明SAHA處理下靈芝多糖與靈芝酸合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)均有不同程度上調(diào)，其中靈芝多糖合成關(guān)鍵酶基因提升1.5—3.5倍，靈芝酸合成關(guān)鍵酶基因提升1.8—12.1倍；靈芝全局性調(diào)控因子和的表達(dá)被抑制，僅為對(duì)照組的11.30%—62.4%?！窘Y(jié)論】組蛋白乙酰化可通過(guò)靈芝全局調(diào)控因子調(diào)控靈芝生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)而影響靈芝酸生物合成，同時(shí)組蛋白乙?；瘜?duì)靈芝多糖生物合也有影響。

靈芝；組蛋白乙?；混`芝酸；靈芝多糖；SAHA

0 引言

【研究意義】靈芝（）是我國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的珍品，具有重要的藥用價(jià)值和保健功能。研究表明靈芝酸（GA）[1]與靈芝多糖（胞外多糖EPS、胞內(nèi)多糖IPS）[2]是其主要的藥用成分，其中靈芝酸因具有抗癌、抗HIV等功效，靈芝多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用而受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[3-4]。近期研究表明，靈芝多糖還作為植物免疫誘抗劑增加番茄植株對(duì)灰霉病抗性[5]和小麥對(duì)紋枯病的抗性[6]。FANG[7]等發(fā)現(xiàn)液體振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)法與傳統(tǒng)的液體發(fā)酵和固體培養(yǎng)靈芝子實(shí)體等方法相比，能顯著提高靈芝活性物質(zhì)的產(chǎn)量。近年來(lái)，隨著對(duì)靈芝酸和靈芝多糖的應(yīng)用需求，進(jìn)一步提高其產(chǎn)量很有必要。真菌表觀遺傳研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙酰化不僅能夠影響菌落建成[8]、光響應(yīng)[9-10]，而且還調(diào)控真菌的有（無(wú)）性發(fā)育[11-12]、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成[13-15]，并在維持細(xì)胞周期[16]、環(huán)境適應(yīng)[17]等方面也起著至關(guān)重要的作用。化學(xué)表觀遺傳抑制劑的使用為真菌生長(zhǎng)發(fā)育和代謝的表觀遺傳研究提供了新的策略[18-19]，同時(shí)也可成為增加真菌代謝產(chǎn)物合成的強(qiáng)有力手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】據(jù)鄧茂常[20]的文獻(xiàn)記載，我國(guó)于20世紀(jì)60年代末已經(jīng)開(kāi)展靈芝液體深層發(fā)酵技術(shù)的研究。在接下來(lái)的10多年里，研究的側(cè)重點(diǎn)主要為發(fā)酵過(guò)程中靈芝菌絲體形態(tài)的變化和如何獲得更多的靈芝生物量[21]。90年代至今，在提高靈芝酸和靈芝多糖生產(chǎn)方面已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，主要致力于靈芝深層培養(yǎng)的最佳條件、最佳培養(yǎng)基配方、接種量以及反應(yīng)器的選擇等，以提升靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量[22-24]。2002年，F(xiàn)ANG等[7]首次報(bào)道了一種液體振蕩發(fā)酵與液體靜置培養(yǎng)兩階段培養(yǎng)法，使靈芝酸生物合成大大提高，隨后有大量研究在此基礎(chǔ)上展開(kāi)，包括在靜置培養(yǎng)中添加P450誘導(dǎo)劑苯巴比妥[25]、添加鈣離子和鎂離子或錳離子[26]以及靜置培養(yǎng)過(guò)程中氮源限制[27]和調(diào)節(jié)氣相氧濃度[28]對(duì)靈芝酸合成都有提高作用。劉高強(qiáng)等[4]以14C標(biāo)記的葡萄糖作為碳源初步推斷出靈芝胞外多糖IPS-1合成基本途徑；JI等[29]通過(guò)基因工程手段高表達(dá)靈芝同源基因，提高了靈芝多糖產(chǎn)量；劉柯等[30]通過(guò)異源表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因也獲得了高產(chǎn)靈芝多糖菌株。組蛋白乙酰化修飾是真菌表觀遺傳研究的主要內(nèi)容之一。組蛋白乙酰化平衡主要依靠組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）維持。SAHA是一種化學(xué)表觀遺傳抑制劑，可抑制HDAC活性，打破組蛋白乙?；?，改變基因的轉(zhuǎn)錄從而影響真菌的生長(zhǎng)和代謝。WILLIAMS等[31]利用組蛋白去乙酰化抑制劑和DNA甲基化抑制劑作用12種真菌，其中一些真菌的次級(jí)代謝物產(chǎn)量提高而且還分離得到結(jié)構(gòu)新穎的次級(jí)代謝物。在黑曲霉研究中，SAHA添加改變了次級(jí)代謝物合成基因的表達(dá)水平[32]。BASIMIA等[18]通過(guò)SAHA處理，嚴(yán)重抑制了黃曲霉毒素生物合和孢子的產(chǎn)生。【本研究切入點(diǎn)】目前靈芝的發(fā)酵研究主要側(cè)重于發(fā)酵條件優(yōu)化、添加激發(fā)子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)工程以及基因工程菌構(gòu)造等策略，以促進(jìn)靈芝生長(zhǎng)，提高代謝物合成，而組蛋白乙?；谋碛^遺傳有待進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)SAHA處理，研究組蛋白乙?；瘜?duì)靈芝生長(zhǎng)、菌絲形態(tài)、孢子分化以及靈芝酸和靈芝多糖代謝合成的影響，并進(jìn)一步在分子水平探討SAHA處理后，組蛋白乙?；瘜?duì)靈芝發(fā)育及靈芝酸和靈芝多糖合成的作用機(jī)理，為解析靈芝表觀遺傳調(diào)控其代謝的分子作用奠定基礎(chǔ)，為提高靈芝酸和靈芝多糖產(chǎn)量提供新思路。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年9月至2016年12月在福建師范大學(xué)國(guó)家教育部工業(yè)微生物研究工程中心進(jìn)行。

1.1 供試菌株及處理

靈芝[(Leyss. ex Fr. ) Karst]由福建師范大學(xué)國(guó)家教育部工業(yè)微生物研究工程中心提供。液體振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)靈芝，具體培養(yǎng)方法與步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]，將SAHA（上海藍(lán)木化工有限公司）溶解在DMSO（北京鼎國(guó)昌盛有限公司）中，配置為200 mmol?L-1的母液，用MillporeExpress膜針頭式過(guò)濾器過(guò)濾除菌。靜置培養(yǎng)階段，在發(fā)酵液中加入不同體積的SAHA母液，使其終濃度分別為0（空白對(duì)照組）、0.6、60、120和180mmol?L-1，并設(shè)置溶劑對(duì)照組（0.09% DMSO）。試驗(yàn)組與對(duì)照組各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2 靈芝菌絲表型特征分析

觀察記錄不同培養(yǎng)時(shí)間、不同處理的靈芝白色菌絲膜形成過(guò)程，通過(guò)顯微鏡觀察靈芝菌絲體形態(tài)及靈芝孢子。按照Z(yǔ)HANG等[28]的方法收集靈芝孢子，使用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子數(shù)目。

1.3 生物量及殘?zhí)橇繙y(cè)定

收取不同培養(yǎng)時(shí)間的靈芝白色菌絲膜細(xì)胞，于50℃烘箱中烘干至恒重，稱量生物量，同時(shí)收集發(fā)酵液12 000×條件下離心15 min，取上清液采用DNS法測(cè)定殘?zhí)橇?。靈芝細(xì)胞平均生長(zhǎng)速率（g?L-1?d-1）=最大生物量（g?L-1）/達(dá)到最大生物量的天數(shù)（d）。

1.4 靈芝酸、靈芝多糖產(chǎn)量及靈芝組蛋白乙?；綔y(cè)定

參照TANG等[33]的方法測(cè)定靈芝胞外多糖產(chǎn)量和胞內(nèi)多糖含量。參照藍(lán)麗雯[34]的方法提取并測(cè)定總靈芝酸含量。按照胡彬彬等[35]的方法提取靈芝菌絲體蛋白，使用蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定靈芝組蛋白H3、H4乙?；?，一抗：Histone H3ac (pan-acetyl) antibody，Histone H4ac (pan-acetyl) antibody（active motif），內(nèi)參抗體：Histone H3 antibody（ABclonal）；二抗：Hrp Goat anti-Rabbit IgG(H-L)（ABclonal），樣品送廈門(mén)泰京生物有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.5 靈芝多糖、靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶及全局調(diào)控因子相關(guān)基因表達(dá)水平

按照北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司TRigol試劑的說(shuō)明書(shū)提取靈芝總RNA，測(cè)定其OD260/280值，取1 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析提取的RNA純度及檢測(cè)其完整性。以此RNA為模板，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成靈芝cDNA。靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因、靈芝全局調(diào)控因子基因及內(nèi)參基因參考參考文獻(xiàn)[34]和ZHANG等[36]；靈芝多糖生物合成關(guān)鍵酶基因熒光定量PCR引物及內(nèi)參基因參考JI等[29]（表1）。使用美國(guó)ABI公司的Prism 7300定量PCR儀和DBI? Bioscience公司的Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix 定量PCR試劑盒進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定。熒光定量PCR的程序參考藍(lán)麗雯[34]的方法，表達(dá)量的計(jì)算分析采用LIVAK等[37]的方法。

表1 qRT-PCR引物

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 SAHA對(duì)靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)、葡萄糖消耗和組蛋白乙?；降挠绊?/h3>

圖1顯示了不同濃度SAHA 處理與溶劑對(duì)照中靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)和葡萄糖消耗的動(dòng)態(tài)過(guò)程。由圖可知，隨著發(fā)酵的開(kāi)始，各試驗(yàn)組的靈芝細(xì)胞生物量均先升高而后降低。SAHA處理后細(xì)胞最高生物量（干重，DW）在20.0—20.8 g?L-1，均低于對(duì)照組（如無(wú)特殊說(shuō)明均指空白對(duì)照組，下同）（（22.3±0.30）g?L-1，6 d）和DMSO組（（21.2±0.30）g?L-1，6 d）；處理組的平均生長(zhǎng)速率在3.42—2.22 g?L-1?d-1，低于對(duì)照組（（3.71±0.04）g?L-1?d-1）和DMSO組（（3.54±0.04）g?L-1?d-1）3.3%—39.6%。靈芝細(xì)胞對(duì)葡萄糖消耗與靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)情況相吻合（圖1），隨著SAHA濃度的升高，靈芝細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗越來(lái)越慢，進(jìn)而影響了靈芝細(xì)胞生物量。對(duì)照組靈芝細(xì)胞的葡萄糖消耗在第3—6天時(shí)最快，第9天時(shí)葡萄糖消耗殆盡；處理組中靈芝細(xì)胞糖耗速率均低于對(duì)照組，其中180 μmol·L-1SAHA處理組在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，葡萄糖消耗速率較為平緩。圖2比較了靈芝細(xì)胞的對(duì)照組和SAHA處理組（60 μmol·L-1和180 μmol·L-1）在靜置培養(yǎng)1 d和12 d的生長(zhǎng)情況，由圖可見(jiàn)，培養(yǎng)1 d可在平板表面觀察到一層白色菌絲體膜（圖2），對(duì)照組的白色菌絲體膜更早出現(xiàn)且更致密，培養(yǎng)12 d的對(duì)照組已有明顯的色素出現(xiàn)，而處理組尚不明顯?？梢?jiàn)，SAHA處理對(duì)培養(yǎng)前期白色菌絲體膜的形成和培養(yǎng)后期靈芝細(xì)胞色素的產(chǎn)生有一定抑制作用，且濃度越高效果越明顯。

通過(guò)蛋白免疫印跡（western blotting，WB）分析培養(yǎng)9 d時(shí)0、60和180 μmol·L-1SAHA處理下靈芝細(xì)胞組蛋白乙?；降牟町?，結(jié)果如圖3-A所示。SAHA添加導(dǎo)致組蛋白H4乙?；降奶岣?，利用Image J軟件對(duì)免疫印跡條帶灰度分析，結(jié)果如圖3-B所示，60和180 μmol·L-1SAHA處理組組蛋白H4乙?；椒謩e是對(duì)照組的1.4、1.6倍，而組蛋白H3乙?；?jīng)]有差異?？梢?jiàn)，組蛋白乙?；揎棇?duì)靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞色素的生產(chǎn)起重要作用。

圖1 SAHA對(duì)靈芝生物量及糖消耗的影響

圖2 SAHA對(duì)靈芝白色菌絲膜生長(zhǎng)的影響

2.2 SAHA對(duì)靈芝菌絲和孢子數(shù)的影響

對(duì)不同SAHA濃度處理的靈芝細(xì)胞的氣生菌絲進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖4。SAHA處理后，菌絲體形態(tài)發(fā)生改變，如圖4-A（Ⅰ—Ⅲ）所示：對(duì)照組靈芝菌絲體整體呈直線分支狀，而在SAHA濃度為120和180 μmol·L-1時(shí)，呈無(wú)規(guī)則卷曲狀。在靜置培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)照組（0 μmol·L-1SAHA組和DMSO組）與試驗(yàn)組均能夠分化出孢子（圖4-A（Ⅳ—Ⅸ），通過(guò)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組靈芝孢子數(shù)目減少。由圖4-B可知，靈芝細(xì)胞的產(chǎn)孢量隨著靜置培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。但相對(duì)于對(duì)照組來(lái)看，靈芝細(xì)胞的產(chǎn)孢量隨著抑制劑濃度的增加而減少。第12天時(shí)，對(duì)照組的產(chǎn)孢量分別是0.6、60、120和180 μmol·L-1SAHA處理組的1.49、1.75、1.9和2.9倍?？梢?jiàn)，SAHA添加改變靈芝組蛋白乙?；剑M(jìn)而影響了靈芝菌絲體發(fā)育。

2.3 SAHA對(duì)靈芝酸和靈芝多糖合成的影響

SAHA處理提高了靈芝組蛋白乙?；?，對(duì)靈芝代謝產(chǎn)生不同影響。圖5為不同處理對(duì)總靈芝酸產(chǎn)量的影響，由圖可知，培養(yǎng)12 d時(shí)，對(duì)照組的總靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為（0.77±0.05）g?L-1。試驗(yàn)組（0.6、60、120和180 μmol·L-1SAHA）中總靈芝酸產(chǎn)量最大值分別為（0.58±0.03）（9 d）、（0.67±0.01）（9 d）、（0.56±0.05）（9 d）、（0.56±0.04）（12 d）g?L-1，分別比對(duì)照組降低25%、13%、27%和27%。同時(shí)也測(cè)定了靈芝多糖產(chǎn)量（9 d），胞外多糖（EPS）和胞內(nèi)多糖（IPS）產(chǎn)量在SAHA的作用下都有所增加，結(jié)果如圖6所示。0.6、60、120和180 μmol·L-1SAHA試驗(yàn)組的靈芝多糖產(chǎn)量（EPS+IPS）分別比對(duì)照組（（4.91±0.13）g?L-1）增加了約33%、44%、47%和50%。

A：靈芝組蛋白免疫印跡；B：靈芝組蛋白乙酰化水平比較。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

圖5 SAHA對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響

圖6 SAHA對(duì)靈芝多糖總產(chǎn)量的影響

2.4 SAHA對(duì)靈芝多糖和靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

圖7為SAHA對(duì)靈芝多糖生物合成關(guān)鍵酶基因（）的影響，由圖可知，SAHA處理后靈芝多糖的3個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量均有所提高，當(dāng)SAHA濃度為60 μmol·L-1時(shí)，3個(gè)基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.6倍、3.5倍和2.5倍，180 μmol·L-1處理時(shí)為2.1倍、3.2倍和1.5倍。圖8為靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因（）的表達(dá)情況，由圖可知SAHA的處理提高了靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，當(dāng)SAHA濃度為60 μmol·L-1時(shí)，4個(gè)基因的表達(dá)量分別為對(duì)照組的5.8倍、2.0倍、8.8倍和2.1倍，180 μmol·L-1處理時(shí)分別為對(duì)照的4.2倍、2.1倍、12.1倍和1.8倍。

2.5 SAHA對(duì)靈芝vet和LaeA表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探究SAHA對(duì)靈芝生長(zhǎng)發(fā)育和代謝的影響，測(cè)定了和轉(zhuǎn)錄水平。從圖9可以看出，60和180 μmol·L-1SAHA處理組培養(yǎng)至第9天時(shí)，靈芝和表達(dá)量均有不同程度降低，其中表達(dá)量分別為對(duì)照的62.4%和11.3%，表達(dá)量分別為對(duì)照的45.5%和24.2%。和表達(dá)量的降低，表明SAHA誘導(dǎo)的靈芝細(xì)胞形態(tài)、孢子數(shù)量和GA產(chǎn)量的變化可能受及轉(zhuǎn)錄水平變化的影響。

圖7 SAHA對(duì)ugp、gls和pgm表達(dá)的影響

圖8 SAHA對(duì)hmgr、sqs、se和ls表達(dá)的影響

3 討論

組蛋白乙酰化修飾在真核生物生長(zhǎng)周期中扮演著重要角色，其動(dòng)態(tài)平衡控制著染色體狀態(tài)，與基因的沉默和抑制密切相關(guān)。SAHA屬于異羥肟酸類修飾劑，可抑制Ⅰ、Ⅱ類HDACs，提高組蛋白乙?；?，從而影響生物體的生命過(guò)程。研究表明，組蛋白乙?；c真菌的生長(zhǎng)和發(fā)育息息相關(guān)，通過(guò)添加SAHA抑制HDAC，橘青霉菌落顏色加深，同時(shí)分生孢子梗和分生孢子數(shù)目也增加，孢子聚集密實(shí)，周邊的孢子部分有出芽現(xiàn)象[38]；而黃曲霉氣生菌絲變成毛絨狀，有較小的分生孢子頭，隨著SAHA濃度增加（2—50 μmol·L-1），孢子數(shù)目越來(lái)越少，且菌落顏色變淺[18]。在本研究中，靜置培養(yǎng)時(shí)，SAHA的處理提高了靈芝組蛋白H4乙?；?，導(dǎo)致靈芝生長(zhǎng)延遲且抑制了糖耗速率和細(xì)胞生長(zhǎng)速率；隨著SAHA濃度增加，其生物量逐漸降低，孢子數(shù)目減少。同時(shí)顯微鏡觀察SAHA處理后靈芝氣生菌絲形態(tài)發(fā)生變化，在生長(zhǎng)后期抑制了上層白色菌絲體膜色素產(chǎn)生。

組蛋白乙?；谡婢渭?jí)代謝產(chǎn)物調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[13-15]，通過(guò)曲古抑菌素A（TSA，一種HDAC抑制劑）[39]抑制黃曲霉HDAC，黃曲霉毒素生物合成受到抑制，檢測(cè)黃曲霉產(chǎn)毒基因，除外，、和轉(zhuǎn)錄下調(diào)。LEE等[40]通過(guò)敲除煙曲霉（Ⅱ類HDAC基因）提高了幾種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，而膠霉毒素的合成則受到抑制，測(cè)定非核糖體多肽合成途徑14個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)9個(gè)上調(diào)。本研究中，通過(guò)抑制HDAC，增加了組蛋白H4乙?；?，對(duì)靈芝的代謝產(chǎn)物也產(chǎn)生了不同的影響，其中靈芝多糖合成增加，其關(guān)鍵酶基因表達(dá)上調(diào)；靈芝酸生物合成則受到抑制，但其關(guān)鍵酶基因表達(dá)上調(diào)?，F(xiàn)有信息表明靈芝酸生物合成途徑上游過(guò)程基本清楚，但從羊毛甾醇之后靈芝酸合成的下游過(guò)程仍不清楚，且羊毛甾醇作為靈芝酸前體外，還用于合成麥角固醇[41]。本研究中測(cè)定的靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因均位于上游過(guò)程，且試驗(yàn)組靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)處于旺盛期（圖1），推測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量增加，產(chǎn)生的羊毛甾醇可能更多的合成用于細(xì)胞膜組成成分的麥角固醇。大量研究表明，真菌次級(jí)代謝與靈芝發(fā)育緊密相連，真菌孢子的分化與次級(jí)代謝表現(xiàn)出共調(diào)節(jié)[42-43]，且在ZHANG等[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，上層菌絲體膜孢子中靈芝酸含量顯著高于菌絲，是其20倍。本研究中SAHA處理影響了靈芝菌絲體形態(tài)以及抑制孢子生產(chǎn)，這也可能是靈芝酸生物合成降低的原因。在絲狀真菌的研究中，全局調(diào)控因子蛋白Vet蛋白和LaeA蛋白在調(diào)控真菌生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝中發(fā)揮重要作用[44-46]。本研究發(fā)現(xiàn)SAHA處理后，和的轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào)，這可能是SAHA通過(guò)抑制組蛋白去?；富钚?，改變了組蛋白乙?；綄?dǎo)致靈芝染色質(zhì)重塑和相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)變，從而影響了靈芝菌絲的生長(zhǎng)，孢子分化和次級(jí)代謝。

4 結(jié)論

組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u肟酸（SAHA）處理，增加了靈芝組蛋白H4的乙?；剑瑢?dǎo)致靈芝生長(zhǎng)延遲且降低了糖耗速率和細(xì)胞生長(zhǎng)速率，同時(shí)降低了靈芝孢子產(chǎn)生。SAHA處理后靈芝氣生菌絲形態(tài)發(fā)生變化，在生長(zhǎng)后期抑制了上層白色菌絲體膜色素產(chǎn)生。次級(jí)代謝產(chǎn)物靈芝酸的合成與靈芝孢子的產(chǎn)生有較緊密聯(lián)系，SAHA可能通過(guò)影響組蛋白乙?；?，進(jìn)而下調(diào)全局性調(diào)控因子和的表達(dá)，抑制靈芝孢子生成，進(jìn)而降低靈芝酸的合成；同時(shí)影響靈芝多糖途徑關(guān)鍵基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)靈芝多糖生物合成。

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Effects of Histone Acetylation onGrowth, Polysaccharide and Ganoderic Acid Biosynthesis

ZHANG ZongYuan1, 2, JIANG YongMei1, ZHANG WenXian1

(1College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108;2Institute of Biology Co., Ltd., Henan Academy of Sciences, Zhengzhou 450008)

【Objective】Histone acetylation modification plays an important role in the growth, development and metabolic synthesis of fungi. Few epigenetic studies of higher medicinal fungi were reported at present. In this study, the effects of histone acetylation on the growth and development of() and the synthesis of its main metabolites were studied by adding chemical epigenetic inhibitor octanedianiline hydroxamic acid (SAHA), which provided a theoretical basis for improving the biosynthesis ofpolysaccharides and Ganoderma acid (GA) by epigenetic means.【Method】A two-stage cultivation, liquid fermentation combined with static cultivation, was applied to culture. The cell was treated with different concentration of SAHA (0, 0.6, 60, 120, and 180 μmol?L-1) during the liquid static cultivation of.Biomass, sugar consumption, mycelial mat formation, mycelial morphology, sporulation and biosynthesis of GA andpolysaccharides were measured or observed by conventional methods.Histone acetylation levels ofwere examined by Western blot, the relative expression levels ofpolysaccharides biosynthesis genes (.and), GA biosynthesis genes (and) andglobal regulator,gene were detected by qRT-PCR. 【Result】The acetylation level of histone H4intreated with SAHA increased to 1.6 times as much as that under control group. SAHA inhibited the growth ofmycelia and the production of pigments, and changed the morphology of mycelia. The formation of spores was also inhibited, and the higher the concentration of SAHA, the more obvious the inhibition degree. SAHA treatment significantly increased the yield ofpolysaccharides, up to 50%, and the biosynthesis of GA was inhibited, which decreased by 13%-27% compared with the control. The results of qRT-PCR analysis showed that the gene expression of the key enzymes inpolysaccharides and GA synthesis were up-regulated in different degrees under SAHA treatment. The gene expression of the key enzymes in polysaccharides synthesis were increased by 1.5-3.5 times and that of the key enzymes in GA synthesis by 1.8-12.1 times. The expression ofandgenes, the global regulators, were inhibited, which was 11.3%-62.4% of the control group.【Conclusion】Histone acetylation could regulate the growth and development ofthrough global regulatory factors, thus affecting the biosynthesis of GA, while histone acetylation also had an effect onpolysaccharides biosynthesis.

; histone acetylation; ganoderic acid;polysaccharide; SAHA

2019-05-21；

2019-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370099）、福建省自然科學(xué)基金（2017J01624）

張宗源，E-mail：xuanyizzy@163.com。通信作者章文賢，E-mail：huzx@fjnu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）