趙珊，仲伶俐，周虹，李曦，雷欣宇，黃世群，鄭幸果，馮俊彥，雷紹榮，郭靈安

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定和分析稻米中酚酸類化合物的組成及分布

趙珊1，仲伶俐1，周虹1，李曦1，雷欣宇1，黃世群1，鄭幸果1，馮俊彥2，雷紹榮1，郭靈安1

（1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（成都），成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所， 成都 610061）

【目的】水稻是世界上最重要的作物之一，也是人們飲食中酚酸類營養(yǎng)成分的重要來源。建立稻米中酚酸類化合物鑒定與分析的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測方法，以深入了解和挖掘稻米的功能性營養(yǎng)?！痉椒ā坎捎肬PLC-MS/MS法對四川收集的白米、紅米、紫米和黑米等14份材料中的19種酚酸進(jìn)行定性和定量分析。優(yōu)化堿水解、酸水解和凈化萃取方法等前處理條件，同時優(yōu)化色譜柱、流動相條件和質(zhì)譜條件，并采用電噴霧電離和多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。最后利用優(yōu)化的分析方法分別測定糙米樣品中的游離型、可溶性酯型、可溶性糖苷型、不溶性結(jié)合型和不溶性糖苷型酚酸的含量?！窘Y(jié)果】通過對前處理條件的比對優(yōu)化，獲得的最優(yōu)條件為：在含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA的2 mol·L-1NaOH濃度下堿水解4 h，在1 mol·L-1HCl溶液下酸水解1 h；所有凈化萃取都使用含0.2% BHA的乙酸乙酯；采用HSS T3色譜柱，乙腈-0.01%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫；除反式肉桂酸采用正離子模式，其余均為負(fù)離子模式，各化合物峰形好、分離度和靈敏度高。19種酚酸的線性范圍良好（2≥0.9997），檢出限在0.023—4.728 μg·L-1，定量限在0.076—15.759 μg·L-1。19種酚酸游離型酚酸提取回收率為55.3%—98.0%，18種酚酸（綠原酸除外）的堿水解和酸水解回收率分別為90.8%—103.1%、51.7%—100.3%。該方法測定的14份稻米中共鑒定出14種酚酸，定量的有12種，酚酸總含量范圍為356.3—1 234.5 mg·kg-1，含量較高的有阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、4-香豆酸、芥子酸和對羥基苯甲酸，其中原兒茶酸和香草酸主要存在于紫米和黑米中，主要為不溶性結(jié)合型、可溶性酯型和可溶性糖苷型酚酸?！窘Y(jié)論】該方法準(zhǔn)確且靈敏度高。在提取和測定過程中保護(hù)劑的加入能有效抑制酚酸的降解，增加游離型和糖苷型酚酸的鑒定與定量分析，能更精確、全面地呈現(xiàn)出稻米中酚酸的分布情況。

酚酸；超高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜；稻米

0 引言

【研究意義】水稻（L.）作為最重要的糧食作物之一，為世界上近一半的人口提供了口糧。隨著社會的發(fā)展和生活水平的提高，消費者除了追求口感品質(zhì)外，對功能性品質(zhì)的需求也日益迫切。稻米中除富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)和各種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、纖維素等外，還含有對人類健康非常重要的功能性營養(yǎng)成分，如谷維素、生育酚、花色苷、類黃酮、酚酸等，它們主要存在于種皮和胚中[1-2]。早在2000年，Hudson等[3]發(fā)現(xiàn)亞洲人群長期食用大米的方式與較低的癌癥和冠心病發(fā)病率之間呈正相關(guān)關(guān)系，證明糙米和麩皮中含有預(yù)防癌癥的成分。此后便掀起了水稻功能性成分研究的熱潮，到目前為止，已發(fā)表的相關(guān)研究論文累計超過1 000篇[4]，水稻也逐漸成為動物和人類臨床試驗和食品功能強(qiáng)化研究中最多的谷物之一[5]。酚酸是指結(jié)構(gòu)中帶有酚類基團(tuán)和有機(jī)羧酸官能團(tuán)的物質(zhì)[6]，多為C6-C1骨架的羥基苯甲酸衍生物和C6-C3骨架的羥基肉桂酸衍生物（表1）。它們中一小部分以“游離態(tài)”形式存在，大多數(shù)通過酯鍵、醚鍵或縮醛鍵與植物的結(jié)構(gòu)組分（如纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素），較大的多酚（類黃酮），有機(jī)小分子（如葡萄糖、奎尼酸、馬來酸、酒石酸）或其他天然產(chǎn)物（萜烯）相連[7-9][7, 8]。酚酸廣泛存在于水果、蔬菜、糧食、豆類等植物中，具有提高免疫力、預(yù)防疾病、輔助藥物治療等積極作用[10]。稻米中酚酸的含量與品種、環(huán)境和加工方式等存在一定關(guān)系，主要包括羥基苯甲酸類的對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸、丁香酸等，羥基肉桂酸類的咖啡酸、芥子酸、對香豆酸、阿魏酸等[11-20]。四川是水稻消費大省，90%以上的人口以大米為主食，常年消費量在1.4×107t以上[21]，掌握稻米中酚酸的種類及分布，深入挖掘稻米的功能營養(yǎng)價值，對豐富我國食品營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫和育種資源提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，酚酸的分析方法主要有分光光度法[22-24]、高效液相色譜法[25-27]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[28-29]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）[30-33]等。超高效液相色譜比高效液相色譜的分離效果和靈敏度有很大的提高，但是對分離化學(xué)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)相近的化合物以及含量較低的游離酚酸分離效果和靈敏度還存在不足。采用UPLC-MS/MS的多重反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）進(jìn)行定性定量分析，具有分離效率高、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等特點，更適用于多種酚酸的分離和測定。張娜等[34]通過超高效液相色譜法分析稻米中14種結(jié)合型酚酸化合物的組成及其含量，對比了糙米和精米中結(jié)合酚酸組成和含量，該方法簡便、快速。Gruz等[30]采用UPLC-MS/MS法快速定量不同飲料中的17種酚酸，該方法不需要對樣品進(jìn)行濃縮/純化，且色譜分離時間不超過12 min。馬帥等[33]利用UPLC-MS/MS法同時測定了花椰菜和西蘭花中的23種酚酸類化合物，采用MRM模式進(jìn)行定性和定量，該方法分析時間短、靈敏度高且重復(fù)性好。【本研究切入點】目前，水稻籽粒酚酸化合物的分析主要集中在含量較高的結(jié)合型酚酸中，如阿魏酸、對香豆酸等，還沒有系統(tǒng)地對游離型、酯型、結(jié)合型、糖苷型的酚酸進(jìn)行鑒定和分析，特別是糖苷型酚酸，國內(nèi)報道極少，植物中酚酸的復(fù)雜存在形式是對其難以深入研究的主要原因。此外，目前對四川主栽稻米品種酚酸的相關(guān)檢測與鑒定研究也未見報道，雖然有色稻品種中黃酮類成分如花色苷、原花青素的報道較多，但是對其酚酸類成分的研究仍然較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選取四川地區(qū)主栽優(yōu)質(zhì)稻、常規(guī)稻以及有色稻為材料，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立稻米中19種酚酸類化合物的分析方法，探討游離酚酸、可溶性酯型酚酸、不溶性結(jié)合酚酸、可溶和不溶性糖苷型酚酸在糙米中的存在形式、組成分布及含量，深入挖掘稻米產(chǎn)品營養(yǎng)功能優(yōu)勢，從品質(zhì)角度為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支持，為實現(xiàn)稻米產(chǎn)業(yè)的供給側(cè)改革提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。

表1 酚酸類化合物基本信息匯總表[9]

續(xù)表1 Continued table 1

1 材料與方法

1.1 材料

本研究14個樣品材料收集于四川生產(chǎn)基地，均種植于2017年，采樣于當(dāng)年9—10月，其中包括秈稻、粳稻、黑米稻、紅米稻以及紫米稻。材料具體信息見表2，脫殼后的糙米見圖1。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-XS超高效液相色譜儀-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1工作站（美國Waters公司）；AutoEVA-20Plus氮吹儀（廈門?？苾x器有限公司）；D3204R高速離心機(jī)（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；FSJ-II型錘片式糧食粉粹機(jī)（中儲糧成都糧食科學(xué)研究所）；KQ5200DE超聲波清洗機(jī)（昆明市超聲儀器有限公司）；ZD-85空氣浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；AUY220型電子天平（日本島津公司）；UPH-1-20L實驗室超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；BLH3250實驗礱谷機(jī)（浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司）。

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、2-羥基肉桂酸、3-羥基肉桂酸、反式肉桂酸、水楊酸、3,5-二羥基苯甲酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、龍膽酸、綠原酸、焦兒茶酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、芥子酸，純度均大于97%，購自美國Sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純），購自美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純）、正己烷（色譜純），上海安譜實驗科技公司；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 cc），美國Waters公司；0.22 μm微孔過濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；水為超純水，氫氧化鈉（優(yōu)級純）、鹽酸（優(yōu)級純）、抗壞血酸（分析純）、乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，分析純），購自廣東西隴化工；叔丁基對羥基茴香醚（butylated hydroxy toluene，BHA，≥98%），購自上海阿拉丁生化科技公司。

1.3 樣品制備

稻谷樣品儲存于裝有生石灰的密封桶中，于2019年3月用礱谷機(jī)進(jìn)行脫殼，分別將脫殼后的糙米用旋風(fēng)磨粉機(jī)磨成粉并過80目篩，之后貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 不同稻米材料

表2 材料信息

1.4 前處理方法

1.4.1 游離型酚酸的提取 稱取0.4 g（精確到0.0001 g）樣品于10 mL離心管中加入5 mL正己烷超聲30 min脫脂，棄去正己烷，溶劑揮發(fā)干后加入4 mL提取液（含有1%抗壞血酸的80%甲醇溶液），渦旋震蕩混勻后室溫超聲30 min，5 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL試管中，重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液，于氮吹儀上濃縮至1.5 mL左右，調(diào)節(jié)溶液pH=2左右，即為溶液A。

乙酸乙酯萃取法：溶液A用2 mL乙酸乙酯（含0.2% BHA）渦旋萃取，重復(fù)一次，合并萃取液，氮氣吹干后用50%甲醇溶液溶解并定容至2 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。

HLB固相萃取法：將固相萃取小柱依次用3 mL甲醇和3 mL含1%甲酸的水溶液預(yù)淋洗、活化，將溶液A加入到固相萃取小柱中，緩慢抽濾，棄去濾液，用5 mL甲醇清洗試管后加入到固相萃取小柱中，收集濾液，氮氣吹干后用50%甲醇溶液溶解并定容至2 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。

1.4.2 可溶性酯型酚酸的提?。▔A水解） 稱取50 mg（精確到0.0001 g）樣品于10 mL離心管中，加入2 mL提取液（80%甲醇溶液），渦旋震蕩混勻后室溫超聲30 min，5 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL試管中，重復(fù)上述提取步驟一次，合并上清液（殘渣留做結(jié)合型酚酸的提?。?，于氮吹儀上濃縮至0.8 mL以內(nèi)，將濃縮液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入一定量的4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA），使其濃度為2 mol·L-1，充入氮氣密封。40℃氣浴避光振蕩水解4 h。然后用6 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH=2左右，加入2 mL乙酸乙酯（含0.2% BHA）渦旋萃取2—3次，合并萃取液于20 mL試管中，氮氣吹干后用5 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。萃取后的水相為溶液B。

試驗中通過對比保護(hù)劑在堿水解過程中對不同酚酸的影響來優(yōu)化其條件，分別使用4 mol·L-1NaOH溶液、4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸）和4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA）進(jìn)行對比，通過比較不同酚酸的添加回收率來確定最優(yōu)的堿水解條件。

1.4.3 可溶性糖苷型酚酸的提?。ㄋ崴猓?向溶液B中加入一定量的6 mol·L-1HCl溶液使其濃度為1 mol·L-1，85℃水浴水解1 h，再用4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA）調(diào)pH=2左右，加入2 mL乙酸乙酯（含0.2% BHA）渦旋萃取2—3次，合并萃取液于20 mL試管中，氮氣吹干后用5 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。

參照文獻(xiàn)[35-36]，選擇1 mol·L-1和2 mol·L-1的鹽酸濃度來分別水解1 h和2 h。通過比較不同酚酸的添加回收率，了解不同酚酸在不同鹽酸濃度和水解時間下的穩(wěn)定性來確定較優(yōu)的酸水解條件。

1.4.4 不溶性結(jié)合型酚酸的提?。▔A水解） 向1.4.2步驟離心后的殘渣中加入2 mL水和2 mL 4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA）[37]，立即渦旋混勻后充入氮氣密封。40℃氣浴避光振蕩水解4 h。然后用6 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)pH=2左右，加入2 mL乙酸乙酯（含0.2% BHA）渦旋萃取2—3次，合并萃取液于20 mL試管中，氮氣吹干后用5 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。萃取后的水相為溶液C。

1.4.5 不溶性糖苷型酚酸的提?。ㄋ崴猓?向溶液C中加入一定量的6 mol·L-1HCl溶液使其濃度為1 mol·L-1，85℃水浴水解1 h，再用4 mol·L-1NaOH溶液（含1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA）調(diào)節(jié)pH=2左右，加入2 mL乙酸乙酯（含0.2% BHA）渦旋萃取2—3次，合并萃取液于20 mL試管中，氮吹干后用5 mL 50%甲醇溶液溶解，混勻后過0.22 μm濾膜，備用。

1.5 UPLC-MS/MS分析條件

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取19種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即為1 mg·mL-1的單標(biāo)儲備液，于-20℃下，貯存于密封的棕色玻璃瓶中。酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液采用梯度稀釋法現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40℃；樣品室溫度10℃；進(jìn)樣量：2.0 μL；流動相A：0.01%甲酸水溶液，過0.2 μm有機(jī)相微孔過濾膜；流動相B：乙腈；流速：0.3 mL·min-1；梯度洗脫程序：0—0.5 min，5% B；0.5—3 min，5%—10% B；3—9 min，10%—13% B；9—12 min，13%—18% B；12—12.5 min，18% B；12.5—13.5 min，18%—50% B；13.5—14 min，50%— 90% B；14—14.5 min，90% B；14.5—15 min，90%—5% B；后運行2.5 min。

1.5.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子和負(fù)離子模式；監(jiān)測模式：MRM；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1；碰撞氣流速：0.15 mL·min-1；錐孔氣流速：150 L·h-1。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 對酚酸類化合物進(jìn)行分離的流動相體系主要有甲醇-水、乙腈-水。本研究考察不同流動相體系及在流動相中添加不同濃度的甲酸對酚酸類化合物分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入一定濃度的酸可以改善峰形，提高分離效果。但是酸含量達(dá)到一定濃度后又會抑制負(fù)離子模式化合物的電離，降低靈敏度，如異阿魏酸。另外，考察不同色譜柱對19種酚酸的分離效果及峰形的影響，通過對比發(fā)現(xiàn)，HSS T3 C18色譜柱和BEH C18色譜柱均能實現(xiàn)19種酚酸的分離，但HSS T3 C18色譜柱在峰形、分離度上略優(yōu)于BEH C18色譜柱。經(jīng)過優(yōu)化，本試驗采用HSS T3 C18色譜柱，乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，19種酚酸化合物能得到較好的峰形、分離度和較高的響應(yīng)值（圖2）。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化 在正/負(fù)離子模式下分別對19種酚酸化合物進(jìn)行掃描，確定準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間等參數(shù)，使分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大，確定豐度較高的兩個分子離子作為定性離子，并選擇其中豐度最高的作為定量離子，具體質(zhì)譜參數(shù)見表3。

2.2 前處理條件優(yōu)化

稻米中含有蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、色素等干擾物質(zhì)，目前去除這些干擾物質(zhì)的方法主要有乙酸乙酯萃取法和固相萃取法。本研究通過比較發(fā)現(xiàn)，HLB固相萃取法對游離酚酸的凈化效果和回收率略優(yōu)于乙酸乙酯萃取法（表4），但在不溶性結(jié)合型酚酸的提取過程中，稻米殘渣樣品因含有大量淀粉經(jīng)堿水解后發(fā)生糊化，不適合進(jìn)行固相萃取，通過離心等途徑又會使回收率降低。另外，本研究要經(jīng)過多次水解和萃取，固相萃取法無法進(jìn)行操作。因此，選擇乙酸乙酯萃取法進(jìn)行稻米中酚酸的提取，同時添加0.2% BHA防止萃取過程中酚酸類化合物發(fā)生降解。

本研究對比了不同酚酸在NaOH溶液中和在添加保護(hù)劑的NaOH溶液中進(jìn)行水解后的回收情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分酚酸在2 mol·L-1NaOH溶液中水解4 h后發(fā)生不同程度的降解，其中沒食子酸、原兒茶酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、龍膽酸、咖啡酸、焦兒茶酸和芥子酸降解最明顯，回收率低于6.9%；綠原酸除外，綠原酸在堿性條件下水解成咖啡酸和奎寧酸。而在相同條件下，含有1%抗壞血酸的NaOH溶液和含有1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA的NaOH溶液中19種酚酸的回收率較好，范圍分別為85.5%—110.5%、92.1%— 104.8%，RSD分別為0.12%—5.88%、0.24%—4.20%（表4）?？梢?，抗壞血酸和EDTA能有效防止酚酸在堿溶液中發(fā)生降解。綜合考慮，選擇NaOH溶液中添加1%抗壞血酸和10 mmol·L-1EDTA作為堿水解條件。

圖2 19種酚酸的離子色譜圖

表3 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)

*為定量離子*Represents quantitative ions in the table

大部分羥基肉桂酸類酚酸在酸水解條件下不穩(wěn)定，如4-香豆酸、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸和反式肉桂酸等。隨著酸濃度的增加和水解時間的增加，2,3,4-三羥基苯甲酸、沒食子酸、4-香豆酸、芥子酸、咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸和反式肉桂酸降解越來越嚴(yán)重，相反的是，龍膽酸和焦兒茶酸呈上升的趨勢（圖3）。嘗試添加不同的抗氧化劑，如抗壞血酸、BHA、亞硫酸氫鈉等都沒有明顯的改善。綜合考慮，本研究酸水解條件選擇1 mol·L-1HCl溶液水解1 h。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性、檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性 配制不同濃度梯度的酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照已建立的方法進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，19種酚酸在一定濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（2）在0.99973—0.99999，可以滿足定量分析的要求。以3倍信噪比（RS/N）計算，19種酚酸的檢出限（LOD）濃度范圍為0.023—4.728 μg·L-1；以10倍信噪比（RS/N）計算，19種酚酸的的定量限（LOQ）濃度范圍為0.076—15.759 μg·L-1，具體結(jié)果見表5。

取100 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算19種目標(biāo)成分峰面積的相對偏差（relative standard deviation，RSD），考察其精密度。取同一樣品供試品溶液，分別在0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣6次，測定目標(biāo)化合物峰面積的RSD，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，19種酚酸精密度的RSD范圍為0.20%— 4.10%，穩(wěn)定性的RSD范圍為0.68%—9.21%，其中焦兒茶酸、龍膽酸、反式肉桂酸穩(wěn)定性的RSD高于5%。

表4 稻米樣品在不同試驗方法中添加酚酸的回收率結(jié)果（n=6）

“-”：無數(shù)據(jù)No data

1：1 mol·L-1 HCl溶液水解1 h；2：1 mol·L-1 HCl溶液水解2 h；3：2 mol·L-1 HCl溶液水解1 h；4：2 mol·L-1 HCl溶液水解2 h

2.3.2 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果 按照1.4.1的試驗方法稱取試樣并進(jìn)行樣品制備，添加1.25 μg·g-1的19種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液到已知含量的樣品中；按照1.4.2的試驗方法稱取試樣和樣品制備，添加10 μg·g-1的18種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（綠原酸除外）到已知含量的樣品中；按照1.4.2方法制備完后向溶液B中加入10 μg·g-1的18種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（綠原酸除外），再按照1.4.3進(jìn)行樣品制備，所有樣品均按照1.5方法進(jìn)行測定并計算目標(biāo)化合物的回收率及RSD，結(jié)果見表4。從結(jié)果中可以看出，19種酚酸類化合物在游離型酚酸的提取中，HLB固相萃取法的回收率范圍為85.3%—111.4%，RSD為0.20%—4.08%；乙酸乙酯萃取法為55.3%—98.0%，RSD為0.01%—4.67%。18種酚酸類化合物在優(yōu)化后的堿水解處理中的回收率為92.1%—104.8%，RSD為0.24%—4.20%；優(yōu)化后的酸水解回收率為51.7%—100.3%，RSD為0.43% —3.87%。

2.4 稻米樣品中酚酸的測定結(jié)果

2.4.1 不同稻米在5種類型酚酸的分布情況 14個稻米共鑒定出14種酚酸化合物，其中12種能夠進(jìn)行定量（表6）。綠原酸在部分材料的游離型中檢出微量，焦兒茶酸在有色米的游離型和可溶性糖苷型中微量檢出，其他酚酸的情況如下：

游離型酚酸：白米材料中檢測到的主要酚酸種類和含量高低依次為阿魏酸＞4-香豆酸＞咖啡酸＞香草酸＞對羥基苯甲酸＞芥子酸；紅米中為原兒茶酸＞阿魏酸＞4-香豆酸＞咖啡酸＞香草酸＞水楊酸；紫米和黑米中為原兒茶酸＞香草酸＞阿魏酸＞2,3,4-三羥基苯甲酸。其中所有材料的原兒茶酸的含量范圍為0.05—27.37 mg·kg-1，香草酸為0.27—19.63 mg·kg-1，阿魏酸1.81—7.31 mg·kg-1，4-香豆酸為0.30—2.95 mg·kg-1。

表5 19種酚酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

可溶性酯型酚酸：白米材料中檢測到的主要酚酸種類和含量高低依次為芥子酸＞阿魏酸＞對羥基苯甲酸＞4-香豆酸＞咖啡酸＞香草酸＞丁香酸；紅米中為芥子酸＞阿魏酸＞原兒茶酸＞4-香豆酸＞對羥基苯甲酸＞咖啡酸；紫米和黑米中為原兒茶酸＞香草酸＞芥子酸＞阿魏酸＞咖啡酸＞4-香豆酸＞對羥基苯甲酸＞丁香酸。其中所有材料的原兒茶酸的含量范圍為0.00—168.73 mg·kg-1，香草酸為1.37— 107.81 mg·kg-1，芥子酸為28.22—71.36 mg·kg-1，阿魏酸17.59—49.66 mg·kg-1，對羥基苯甲酸為2.52—23.36 mg·kg-1，咖啡酸為3.27—13.08 mg·kg-1，4-香豆酸為3.51—13.01 mg·kg-1。

可溶性糖苷型酚酸：白米材料中檢測到的主要酚酸種類和含量高低依次為對羥基苯甲酸＞阿魏酸＞水楊酸＞芥子酸＞香草酸＞咖啡酸＞4-香豆酸；紅米中為對羥基苯甲酸＞阿魏酸＞水楊酸＞香草酸＞芥子酸＞咖啡酸＞原兒茶酸；紫米和黑米中為香草酸＞原兒茶酸＞對羥基苯甲酸＞阿魏酸＞水楊酸＞咖啡酸。所有材料中對羥基苯甲酸的含量范圍為5.72—52.23 mg·kg-1，香草酸為2.52—23.96 mg·kg-1，原兒茶酸為0.00—23.08 mg·kg-1，阿魏酸4.78—12.95 mg·kg-1。

不溶性結(jié)合型酚酸：白米材料中檢測到的主要酚酸種類和含量高低依次為阿魏酸＞4-香豆酸＞咖啡酸＞芥子酸＞對羥基苯甲酸；紅米中為阿魏酸＞4-香豆酸＞原兒茶酸＞芥子酸＞咖啡酸；紫米和黑米中為阿魏酸＞原兒茶酸＞香草酸＞4-香豆酸＞咖啡酸＞芥子酸＞對羥基苯甲酸。所有材料中原兒茶酸的含量范圍為0.00—280.32 mg·kg-1，阿魏酸152.52—274.44 mg·kg-1，香草酸為0.69—139.94 mg·kg-1，4-香豆酸為17.71—91.74 mg·kg-1。

不溶性糖苷型酚酸：白米材料中檢測到的主要酚酸種類和含量高低依次為阿魏酸＞對羥基苯甲酸＞香草酸＞4-香豆酸＞水楊酸＞芥子酸；紅米中為阿魏酸＞對羥基苯甲酸＞原兒茶酸＞4-香豆酸＞香草酸；紫米和黑米中為原兒茶酸＞香草酸＞阿魏酸＞對羥基苯甲酸。其中所有材料的原兒茶酸的含量范圍為0.00—24.32 mg·kg-1，香草酸為0.81—10.72 mg·kg-1，對羥基苯甲酸為0.99—6.10 mg·kg-1，阿魏酸3.16—5.21 mg·kg-1。

表6 四川稻米樣品中不同類型酚酸的含量及分布情況（n=3）

續(xù)表6 Continued table 6

TD：有檢出，但低于定量限；ND：未檢出；1：游離型；2：可溶性酯型；3：可溶性糖苷型；4：不溶性結(jié)合型；5：不溶性糖苷型

TD: it is detected but below the LOQ; ND: not detected; 1: free type; 2: soluble esters; 3: soluble glycosides; 4: insoluble bound complexes; 5: insoluble glycosides

2.4.2不同酚酸在四川稻米材料中的分布情況 通過分析發(fā)現(xiàn)，四川稻米中存在含量較高的酚酸有阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、4-香豆酸、芥子酸、對羥基苯甲酸和咖啡酸，其中原兒茶酸和香草酸主要存在于有色稻米中，特別是在紫米和黑米中含量最高（圖4）。

在白米材料中，阿魏酸的總含量（以干基計）為200.2—325.0 mg·kg-1，占該材料酚酸總含量的52.4%— 57.1%；4-香豆酸總含量為48.4—98.0 mg·kg-1，占12.9%—20.6%；芥子酸總含量為36.3—83.3 mg·kg-1，占9.9%—18.8%；對羥基苯甲酸總含量為14.4—95.6 mg·kg-1，占4.0%—15.4%。在紅米材料中，阿魏酸的總含量為213.2—296.7 mg·kg-1，占總量的百分比為46.1%—49.8%；4-香豆酸總含量為100.7—112.4 mg·kg-1，占16.9%—24.3%；芥子酸總含量為48.2—89.1 mg·kg-1，占9.3%—15.0%；原兒茶酸總含量為29.6—54.3 mg·kg-1，占5.0%—10.5%。在紫米和黑米材料中，原兒茶酸總含量為356.3—564.3 mg·kg-1，占總量的百分比為32.6%—45.7%；阿魏酸的總含量為209.7—376.0 mg·kg-1，占17.0%—34.4%；香草酸總含量為170.3—316.4 mg·kg-1，占15.6%—25.6%；芥子酸總含量為50.3—76.4 mg·kg-1，占4.1%—7.0%。

2.4.3 稻米材料中不同類型酚酸的含量及分布情況 從不同材料的所有酚酸總量來看（以干基計，圖5），含量由高到低依次是：黑米＞紅米＞白米，白米的酚酸總含量為356.3—620.6 mg·kg-1，含量最高的材料是德粳6號；紅米的酚酸總含量為462.4— 595.6 mg·kg-1，含量最高的材料是螺髻山紅米；紫米、黑米的范圍為1 093.5—1 234.5 mg·kg-1，含量最高的材料是廣漢黑米。從總量組成來看（圖5），白米和紅米的5種類型酚酸含量高低依次為：不溶性結(jié)合型＞可溶性酯型＞可溶性糖苷型＞不溶性糖苷型＞游離型；紫米和黑米酚酸含量由高到低依次為：不溶性結(jié)合型＞可溶性酯型＞可溶性糖苷型＞游離型＞不溶性糖苷型。所有材料中，不溶性結(jié)合型酚酸的總含量為222.2—662.3 mg·kg-1，占其酚酸總含量的百分比為51.4%—69.7%；可溶性酯型為66.0—440.1 mg·kg-1，占19.2%—35.6%；可溶性糖苷型為28.6—95.1 mg·kg-1，占5.7%—15.3%；游離型為5.1—72.3 mg·kg-1，占1.2%—6.6%；不溶性糖苷為8.3—46.3 mg·kg-1，占2.1%—3.7%。

1：五山絲苗，2：德優(yōu)4727，3：德粳6號，4：德香4103，5：川綠優(yōu)188，6：桂潮2號，7：川香優(yōu)37，8：螺髻山紅米，9：紅寶石，10：廣漢紅米，11：紫米，12：黑香糯，13：廣漢黑米，14：黑稻2號

1：五山絲苗，2：德優(yōu)4727，3：德粳6號，4：德香4103，5：川綠優(yōu)188，6：桂潮2號，7：川香優(yōu)37，8：螺髻山紅米，9：紅寶石，10：廣漢紅米，11：紫米，12：黑香糯，13：廣漢黑米，14：黑稻2號

3 討論

3.1 稻米中酚酸提取方法及其優(yōu)化

酚酸在植物中以不同形式存在，如游離酚酸、酯型、糖苷型和結(jié)合型。這些復(fù)雜的存在形式導(dǎo)致酚酸類化合物的含量在不同提取條件和不同降解敏感性下產(chǎn)生不同的結(jié)果[25]。因此，為了在植物酚酸測定中找到有效產(chǎn)生和不斷降解之間相對折衷的方法，主要通過設(shè)計提取過程，有序地、系統(tǒng)地釋放酚酸各種存在形式來實現(xiàn)。目前典型的提取步驟是首先使用含水有機(jī)溶劑萃取可溶性或可萃取的酚酸（游離、可溶性酯和可溶性糖苷），再使用堿水解、酸水解或兩者同時進(jìn)行來釋放結(jié)合的酚酸[25,38-39]。另外，酶水解如-淀粉酶和纖維素酶也被用于酚酸的水解[40]。本研究選擇先進(jìn)行堿水解，再進(jìn)行酸水解的方法來測定稻米樣品中的酚酸，可溶性和不可溶性酚酸分別進(jìn)行水解，能更全面、準(zhǔn)確地獲得稻米中酚酸的組成和分布情況。鑒于糙米中酯型和結(jié)合型酚酸的含量較高，以及UPLC-MS/MS高靈敏度的特點，使用較小的樣品量進(jìn)行分析有助于準(zhǔn)確定量，同時節(jié)約試劑且環(huán)保。以往研究表明[37,41-42]，酚酸水解過程會產(chǎn)生不同程度的損失。本研究通過對比不同堿水解條件，發(fā)現(xiàn)在未加保護(hù)劑的情況下，沒食子酸、原兒茶酸、2,3,4-三羥基苯甲酸、龍膽酸、咖啡酸和芥子酸降解明顯，而在提取過程中加入抗壞血酸和EDTA能有效防止酚酸的降解，這一結(jié)果與NARDINI等[37]的研究一致。目前國內(nèi)報道的酚酸類化合物的堿水解大部分都是采用2—4 mol·L-1NaOH溶液充氮水解[33-34,43]，其中張娜等[34]和邵雅芳[43]在稻米結(jié)合型酚酸的測定結(jié)果中都未檢測到咖啡酸，可能與咖啡酸在水解過程中的降解有關(guān)。本方法中有多步去溶劑的過程，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和氮吹是最常用的去溶劑方法，糙米樣品含有大量的干擾物質(zhì)，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去溶劑時樣品溶液容易發(fā)生爆沸，特別是在有色米樣品中，因此在稻米酚酸樣品的制備中最好使用氮吹儀。馬帥等[33]分離了23種酚酸類化合物的梯度洗脫時間不到10 min，本研究中的梯度洗脫時間為15 min，這是由于測定時發(fā)現(xiàn)異阿魏酸的離子色譜峰處存在干擾峰，且響應(yīng)較高，影響目標(biāo)化合物的定性與定量，因此調(diào)整了梯度洗脫條件，使異阿魏酸分離度達(dá)到了要求（圖2）。

3.2 稻米中酚酸分布與影響因素

本研究測定的14個稻米中酚酸的含量范圍為356.3—1 234.5 mg·kg-1，不同材料間差異明顯，其中紫米和黑米中酚酸總量最高，比紅米和白米高近1—1.5倍，高出的部分主要是原兒茶酸和香草酸；從酚酸組成來看，白米和紅米中主要為阿魏酸、4-香豆酸和芥子酸，紫米和黑米中主要為原兒茶酸、阿魏酸和香草酸；所有種類稻米的酚酸類型主要是不溶性結(jié)合型和可溶性酯型。稻米中存在不同形式的酚酸，其含量也各不相同，不同形式酚酸的生物利用度及對健康的影響有較大的差異。BOURNE等[44-45]發(fā)現(xiàn)當(dāng)阿魏酸以游離形式存在于番茄或啤酒中時，它會被有效地吸收。MANACH等[46]比較了幾種羥基苯甲酸類酚酸在人體的生物利用度，得出沒食子酸的吸收利用率較好。此外，相關(guān)研究[47-49]得出游離酚酸的吸收利用率最高，而酯型、糖苷型和結(jié)合型等形式的酚酸必須經(jīng)胃腸道中的酶和大腸菌群水解后才能被吸收，吸收效率降低。因此，稻米中的酚酸不能完全被生物吸收利用，它們對健康的影響取決于各自的攝入量及生物利用度。DING等[20]認(rèn)為忽略種植環(huán)境的影響，粳稻的酚酸含量顯著高于秈稻。

本研究中只有一個粳稻品種即德粳6號，但在所有白米材料中其酚酸總含量最高，這與DING等[20]的結(jié)果一致，得出有可能粳稻的酚酸普遍高于秈稻。本研究發(fā)現(xiàn)白米、紅米和黑米材料中酚酸的組成和含量都存在差異。GOUFO等[4]通過總結(jié)316篇文章，綜述了水稻抗氧化物質(zhì)相關(guān)的研究內(nèi)容，并構(gòu)建了相關(guān)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，酚酸部分列出水稻中鑒定的12種酚酸，包括沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、肉桂酸、鞣花酸（只在稻殼中存在），并提出其含量取決于米粒的顏色；SHAO等[19]研究了15種不同顏色的全谷粒中酚酸類物質(zhì)，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，可溶性共軛酚酸與顏色參數(shù)相關(guān)，并認(rèn)為米粒的著色可能與可溶性共軛酚類物質(zhì)相關(guān)；SUMCZYNSKI等[50]分析了黑米和紅米中游離型和結(jié)合型的酚類組分，發(fā)現(xiàn)黑米中的主要游離酚類物質(zhì)是阿魏酸、原兒茶酸和反式香豆酸，而紅米中的主要游離酚類是兒茶素、原兒茶酸和咖啡酸。黑米中的主要結(jié)合酚類是阿魏酸、香草酸和槲皮素，紅米中主要是阿魏酸、丁香酸、反式香豆酸和槲皮素。綜上，推測水稻中酚類物質(zhì)的含量與品種和籽粒顏色有關(guān)。另外，研究證實精米中的酚酸類物質(zhì)含量明顯低于糙米[16,34]。LIU等[51]對粳稻和秈稻碾磨度與其游離和結(jié)合酚類含量之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著碾磨度的增加，9種酚類化合物的含量顯著降低，包括槲皮素、阿魏酸和香豆酸。BUTSAT等[52]分析了泰國水稻品種中米糠、稻殼、糙米及精米中的酚酸組成，發(fā)現(xiàn)酚酸在水稻的不同部位分布不同，稻殼中的酚酸含量最高，阿魏酸在米糠中最高，而香草酸和對香豆酸主要存在于稻殼中。ZHOU等[16]發(fā)現(xiàn)儲藏會導(dǎo)致糙米和精米中的總酚酸和結(jié)合酚酸的降低，且下降程度與儲藏溫度有關(guān)。因此，水稻中的酚酸含量與取材部位、加工程度及儲藏方式等息息相關(guān)。此外，谷物中的酚類物質(zhì)水平可能還取決于諸如栽培技術(shù)、水稻育種、生長條件（例如海拔和施肥）以及成熟過程等因素[53-54]。

4 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定稻米中19種酚酸的方法，該方法具有準(zhǔn)確、靈敏度高和節(jié)省溶劑的特點。在提取、凈化過程中加入保護(hù)劑，大大提高了回收率。另外，在測定中增加了游離型和糖苷型酚酸的鑒定與分析，使稻米中酚酸的鑒定更加全面。

通過方法學(xué)驗證，證明采用該方法測定稻米19種酚酸線性關(guān)系良好，檢出限、定量限低，精密度較高，穩(wěn)定性較好，方法準(zhǔn)確度符合要求，適用于稻米中酚酸類化合物的鑒定和定量分析，同時可為其他作物該類化合物的測定提供有價值的參考。

本研究發(fā)現(xiàn)稻米中的酚酸組成主要有阿魏酸、原兒茶酸、香草酸、4-香豆酸、芥子酸、對羥基苯甲酸和咖啡酸，總含量范圍為356.3—1 234.5 mg·kg-1，白米、紅米和黑米中酚酸的組成和含量上都存在明顯的差異，其中原兒茶酸和香草酸主要存在于紫米和黑米中。這些酚酸從類型劃分，主要包括不溶性結(jié)合型、可溶性酯型和可溶性糖苷型酚酸等。

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Identification and Analysis of Phenolic Acids in Rice Using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Shan1, ZHONG LingLi1, ZHOU Hong1, LI Xi1, LEI XinYu1, HUANG ShiQun1, ZHENG XingGuo1, FENG JunYan2, LEI ShaoRong1, GUO LingAn1

(1Center of Analysis and Testing, Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Risk Assessment Laboratory of Agricultural Products Quality and Safety (Chengdu), Ministry of Agriculture, Chengdu 610066;2Institute of Biotechnology and Nuclear Technology, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610061)

【Objective】 Rice is one of the most important crops in the world, and it is also an important source of phenolic acids in people’s diet. To further understand and explore the functional nutrition of rice, an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for identification and analysis of rice phenolic acids in the present study. 【Method】The qualitative and quantitative analysis of 19 phenolic acids in 14 samples of white rice, red rice, purple rice and black rice from Sichuan province, was carried out by UPLC-MS/MS. The pretreatment conditions, including alkali hydrolysis, acid hydrolysis and purification extraction, were optimized, besides, the chromatographic column, mobile phase condition and mass spectrometry conditions were optimized too. Furthermore, all detection was carried out by electrospray ionization and multi reaction monitoring mode. Finally, the content of free ester, soluble ester, soluble glycoside, insoluble binding andinsoluble glycoside phenolic acid in brown rice samples was determined by using the optimized analytical method.【Result】The optimal conditions were obtained through the comparison and optimization of the pre-treatment conditions. It was as follows: alkaline hydrolysis was 4 hours at the concentration of 1% ascorbic acid and 10 mmol·L-1EDTA, and acid hydrolysis was 1 hour at the concentration of 1 mol·L-1HCl; all purification and extraction were carried out with ethylacetate containing 0.2% BHA; HSS T3 column was used, acetonitrile-0.01% formic acid aqueous solution was used as mobile phase for gradient elution; except trans-cinnamic acid adopts positive ion mode, the rest were negative ion mode. The compounds had good peak shape, high resolution and sensitivity. The linear range of 19 phenolic acids was good (2≥0.9997), the detection limit was 0.023-4.728 μg·L-1, and the quantitative limit was 0.076-15.759 μg·L-1. Recoveries of 19 phenolic acids in direct extraction were 55.3%-98.0%. Recoveries of 18 phenolic acids (except chlorogenic acid) in alkali hydrolysis and acid hydrolysis were 90.8%-103.1% and 51.7%-100.3%, respectively. In total, there were 14 phenolic acids in 14 rice samples determined using this method, 12 of which were quantitative. The total content range of phenolic acids was 356.3-1 234.5 mg·kg-1. Ferulic acid, protocatechuic acid, vanillic acid,-coumaric acid, sinapic acid and-hydroxybenzoic acid had higher content. Protocatechuic acid and vanillic acid could be mainly found in purple rice and black rice, most of which were insoluble binding type, soluble ester type and soluble glycosidic phenolic acid. 【Conclusion】 The method obtained in this study was accurate and sensitive. The addition of protectors effectively inhibited the degradation of phenolic acid and increased the identification and quantitative analysis of free and glycosidic phenolic acid during extraction and determination. Therefore, distribution of phenolic acid could be presented more accurately and comprehensively in rice.

phenolic acids; ultra-high performance liquid chromatography; tandem mass spectrometry; rice

2019-06-27；

2019-11-20

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估重大專項（GJFP201701502）、四川省財政創(chuàng)新工程（2017QNJJ-021，2017QNJJ-001）

趙珊，Tel：028-84504142；E-mail：zhaoshan11@126.com。通信作者郭靈安，Tel：028-84504149；E-mail：gla028@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）