張 帆， 劉 嘯， 阿迪力·麥木提敏， 安尼卡爾·安尼瓦爾，帕麗黛姆·圖爾迪， 吳佩玲

（新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)診療中心，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊 830000）

腮腺多形性腺瘤是由腫瘤上皮性組織和黏液樣或軟骨樣間質(zhì)所組成的一種唾液腺腫瘤，WHO根據(jù)其組織病理學(xué)及生物學(xué)特性，將其界定為臨界瘤。該疾病手術(shù)治療后易復(fù)發(fā)，腫瘤浸潤(rùn)包膜或多次復(fù)發(fā)后可導(dǎo)致腫瘤惡變[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞遺傳學(xué)改變、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、癌基因、抑癌基因及黏附分子，均在腮腺多形性腺瘤的發(fā)生、惡變過程中發(fā)揮了一定的作用[2]。谷胱甘肽過氧化物酶-3（GPX-3）是已知GPX家族中唯一的細(xì)胞外亞型，是體內(nèi)重要的過氧化物分解酶之一，在清除過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，GPX-3可以通過傳遞電子體使體內(nèi)的磷脂、脂肪酸過氧化氫減少。過氧化氫可參與腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)行為過程，如腫瘤細(xì)胞的增殖、移動(dòng)及侵襲[4]。多種因素可導(dǎo)致GPX-3表達(dá)變化，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，已有研究表明GPX-3在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)[5]。但國(guó)內(nèi)外有關(guān)GPX-3在腮腺多形性腺瘤中表達(dá)的報(bào)道較為罕見。本研究通過熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法檢測(cè)腮腺多形性腺瘤及瘤旁組織中GPX-3基因和蛋白的表達(dá)水平，來(lái)探討GPX-3的表達(dá)與腮腺多形性腺瘤發(fā)生與惡變的相關(guān)性，為腮腺多形性腺瘤的基因預(yù)測(cè)及治療提供新思路。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

本研究隨機(jī)選取2017-06—2019-04期間，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，以及新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院收集的標(biāo)本（腮腺良性多形性腺瘤30例、腮腺多形性腺瘤瘤旁2 cm腺體組織30例、腮腺惡性多形性腺瘤10例）。其中男性42例，女性28例；50歲以上46例，50歲以下24例；腫瘤平均大小3.2 cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床病理診斷為腮腺良、惡性多形性腺瘤（圖1）及瘤旁2 cm腺體組織的手術(shù)樣本，且均未行任何輔助治療；患者同意并簽訂樣本留取知情同意書，并記錄患者臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：曾接受術(shù)前放療或化療患者的樣本組織。30例腮腺良性多形性腺瘤組織為良性組，30例腫瘤邊緣2 cm腮腺組織為正常組，10例腮腺惡性多形性腺瘤組織為惡性組。所有樣本均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的主治醫(yī)師及以上級(jí)別的病理醫(yī)師診斷。根據(jù)腫瘤大小從腫瘤中心至邊緣分別取多個(gè)樣本，分別分成2份，1份放置液氮罐中凍存，另1份送病理檢查，經(jīng)病理證實(shí)后納入樣本。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑和儀器包括：Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，美國(guó)）、熒光定量PCR試劑盒（QIAGEN公司，德國(guó)）、GPX-3羊抗人多克隆抗體 （Abcam公司，英國(guó)）、兔抗人βactin多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）、聚偏二氟乙烯膜（羅氏公司，德國(guó)）、Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）、凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）、酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）；GPX-3及β-actin引物均由上海生工基因合成。

圖1 腮腺良性多形性腺瘤（A）和腮腺惡性多形性腺瘤（B）的組織病理學(xué)表現(xiàn)（×100）Figure 1 Histopathological findings of benign pleomorphic adenoma of parotid gland (A)and malignant pleomorphic adenoma of parotid gland(B) （×100）

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)GPX-3的mRNA表達(dá)

取100 mg組織，用眼科剪剪成小塊，置于組織勻漿機(jī)中研成粉末，加入1 mL Trizol試劑，靜置15 min；加入1/5體積的氯仿，混勻于冰上放置5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新的EP管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃下放置0.5 h，4℃下12 000 r/min離心10 min。加入75%乙醇溶液1 mL，抽吸使沉淀物懸浮，4℃下12 000 r/min離心5 min，棄上清液，再次加入75%乙醇溶液；重復(fù)此步驟，后置于冰上待乙醇揮發(fā)；再加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水，4℃12 000 r/min離心1 min，所得溶液即為總RNA。利用Nandrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及A260/A280比值。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用相對(duì)定量法，以β-actin作為內(nèi)參基因，相關(guān)目的基因及內(nèi)參基因序列如表1所示。PCR體系為 20 μL，具體包括 2×SYBR Green PCR Master Mix、QN ROX Reference Dye 2 μL，上游、下游引物各 1.4 μL，RNase-free water 3.2 μL，cDNA 2 μL。并且每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 2 min；95℃變性5 s，60℃ 退火10 s，35個(gè)循環(huán)。在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀器中進(jìn)行，用 2-ΔΔCt法計(jì)算各組相對(duì)表達(dá)量，比較3組表達(dá)量的差異，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)GPX-3的蛋白表達(dá)

取100 mg組織，用眼科剪剪成小塊，置于組織勻漿機(jī)中研成粉末，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL的苯甲基磺酰氟超聲處理。處理完后置冰上裂解0.5 h，10 000 g/min離心10 min，取中層溶液即為所提蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)蛋白濃度。取20 μL蛋白在12%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗孵育過夜。用1×TBST洗膜3次，每次15 min，加入二抗室溫孵育2 h。用 1×TBST洗膜 3次，每次15 min，之后在暗室中加入ECT發(fā)光劑進(jìn)行顯影，Image Lab軟件分析各條帶灰度值，以GPX-3蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的比值作為GPX-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，比較3組表達(dá)量的差異，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用K-S檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布,Levene檢驗(yàn)方差齊性，GPX-3 mRNA及蛋白表達(dá)量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，不符合正態(tài)分布則使用秩和檢驗(yàn),多組組間差異性檢驗(yàn)采用ANOVA方差分析,兩兩比較以對(duì)照組為參照進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn),GPX-3在不同年齡、性別及腫瘤大小中的表達(dá)陽(yáng)性率運(yùn)用獨(dú)立四格表χ2檢驗(yàn)，均以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPX-3 mRNA的表達(dá)

腮腺良性多形性腺瘤、腮腺惡性多形性腺瘤中mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于瘤旁組織，且腮腺惡性多形性腺瘤中mRNA的相對(duì)表達(dá)量最低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表 2、圖 2、圖 3）。

表2GPX-3 mRNA在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)結(jié)果（例）Table 2 Expression of GPX-3 mRNA in para-tumor glandular tissue and benign and malignant parotid pleomorphic adenoma（case）

圖2 熒光定量PCR分析GPX-3基因在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Quantitative PCR analysis of GPX-3 gene in paraneoplastic glandular tissue，benign and malignant parotid pleomorphic adenoma

2.2 GPX-3蛋白在瘤旁組織與腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)

腮腺多形性腺瘤瘤旁腺體組織、腮腺良性多形性腺瘤、腮腺惡性多形性腺瘤中蛋白的表達(dá)量分別為 0.94±0.01、0.35±0.02、0.11±0.01（表 3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。GPX-3 蛋白在腮腺良、惡性多形性腺瘤中的表達(dá)明顯低于瘤旁組織（P＜0.01，表3、圖4、圖 5）。

圖3 腮腺良惡性多形性腺瘤中GPX-3基因相對(duì)瘤旁腺體組織的表達(dá)分布Figure 3 Expression distribution of GPX-3 gene in benign and malignant pleomorphic adenomas of the parotid gland relative to adjacent tumor tissue

表3 GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織、腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)結(jié)果（例）Table 3 Expression of GPX-3 protein in paraneoplastic glandular tissue,benign parotid pleomorphic adenoma,malignant parotid pleomorphic adenoma（case）

圖4 蛋白免疫印跡法分析GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)Figure4 Western blot analysis of GPX-3 protein expression in para-glandularglandulartissue,benignparotidpleomorphicadenoma,malignantparotidpleomorphicadenoma

2.3 GPX-3 mRNA和蛋白的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系

如表4、表5所示：GPX-3 mRNA和蛋白在腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)及分化程度無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但與腮腺惡性多形性腺瘤的TNM分期、惡性成分比例有關(guān)（均P＜0.05）。

圖5 GPX-3蛋白在瘤旁腺體組織及腮腺良惡性多形性腺瘤中的表達(dá)分布Figure 5 GPX-3 protein expression and distribution in benign and malignant pleomorphic adenomas of the parotid glands and parotid glands

3 討論

腮腺多形性腺瘤的發(fā)生起源于腺管和肌上皮細(xì)胞，是名副其實(shí)的“混合瘤”，其病理學(xué)表現(xiàn)多樣，可見腫瘤性上皮組織和黏液樣或軟骨樣間質(zhì)，根據(jù)其成分比例，可分為細(xì)胞豐富型和間質(zhì)豐富型。一般認(rèn)為，細(xì)胞豐富型相對(duì)較易惡變，間質(zhì)豐富型相對(duì)較易復(fù)發(fā)。若處理不當(dāng)，則易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[6]。如何減少術(shù)后復(fù)發(fā)是腮腺多形性腺瘤的一大挑戰(zhàn)。許多學(xué)者認(rèn)為，術(shù)中腫瘤切除不完全易導(dǎo)致復(fù)發(fā)[7]，故腮腺多形性腺瘤的切除范圍一直是研究的熱點(diǎn)。程晗菲等[8]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在惡性腮腺多形性腺瘤中呈高表達(dá)，相比瘤旁1 cm組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)瘤旁1 cm是腮腺多形性腺瘤切除的安全界限。而劉志明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome then，PTEN）在腮腺多形性腺瘤及瘤旁0.5～1.0 cm組織中表達(dá)均低于正常腺體組織（P＜0.05），而PTEN在瘤旁2 cm組織與正常腺體組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），這為本實(shí)驗(yàn)采取瘤旁2 cm組織為正常對(duì)照組提供了理論依據(jù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPX-3在腮腺多形性腺瘤與瘤旁組織中的表達(dá)有顯著差異 （P＜0.05），在基因和蛋白的表達(dá)量上支持臨床病理診斷。

表4 GPX-3 mRNA與腮腺多形性腺瘤臨床病理特征的關(guān)系（例）Table 4 Relationship between GPX-3 mRNA and clinicopathological features of parotid pleomorphic adenoma（case）

表5 GPX-3蛋白與腮腺多形性腺瘤臨床病理特征的關(guān)系（例）Table 5 Relationship between GPX-3 protein and clinicopathological features of parotid pleomorphic adenoma（case）

GPX家族有8個(gè)成員 （GPX1-GPX8），其主要功能是催化谷胱甘肽 （GSH）轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽（GSSG）[10-11]。GPX-3是目前已知唯一含有細(xì)胞外抗氧化異構(gòu)體的硒半胱氨酸，它能消除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，阻斷活性氧自由基對(duì)機(jī)體的損害。GPX-3異常失活可能導(dǎo)致組織細(xì)胞中ROS的過度產(chǎn)生和積累，引起上皮細(xì)胞DNA損傷，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。多種報(bào)道顯示GPX-3是一種有效抑制腫瘤發(fā)展的基因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GPX-3在乳腺癌中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織，GPX-3的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度及預(yù)后有關(guān)[13]。Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化導(dǎo)致GPX-3在胃癌中表達(dá)下調(diào)。而關(guān)于GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)少有報(bào)道。本研究通過熒光定量PCR和蛋白印跡法，檢測(cè)了GPX-3mRNA及其蛋白在腮腺良、惡性多形性腺瘤及瘤旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GPX-3 mRNA及蛋白的表達(dá)在腮腺良惡性多形性腺瘤中較瘤旁正常組織中明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），提示GPX-3參與了腮腺多形性腺瘤的發(fā)生及惡變。本研究結(jié)果與GPX-3在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)一致，包括肺癌[15]、甲狀腺癌[16]、結(jié)腸癌[17]、黑色素瘤[18]、食管腺癌[19]、胃癌[14]等。而在臨床病理特征上，GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)及分化程度無(wú)明顯關(guān)系，但與腮腺惡性多形性腺瘤的TNM分期、侵襲性、惡性成分比例有關(guān)，這與在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果提示，GPX-3的低表達(dá)與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡變密切相關(guān)，為GPX-3作為一種輔助因子來(lái)預(yù)測(cè)腮腺多形性腺瘤是否惡變，并評(píng)估預(yù)后提供了理論基礎(chǔ)。但因腮腺惡性多形性腺瘤較為少見，故本研究惡性組樣本較少，可能使本研究中GPX-3與腮腺多形性腺瘤惡性程度的關(guān)系，與其他惡性腫瘤的相關(guān)研究結(jié)果略有差異。后期值得在更大樣本中，進(jìn)一步研究GPX-3與腮腺多形性腺瘤復(fù)發(fā)及惡變的關(guān)系。

關(guān)于GPX-3的表達(dá)機(jī)制，有研究顯示DNA甲基化是導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的常見機(jī)制之一[19]，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化可能導(dǎo)致GPX-3在腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)[20]，且Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)GPX-3高甲基化可能是老年胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)。本研究探討了GPX-3的表達(dá)與腮腺多形性腺瘤發(fā)生及惡變的相關(guān)性，但GPX-3高甲基化與其表達(dá)下降的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。最新研究通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中的GPX-3水平來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及更新，進(jìn)一步為GPX-3對(duì)腫瘤的靶向治療提供了潛在可能[21]。本研究發(fā)現(xiàn)GPX-3在腮腺多形性腺瘤中的表達(dá)下降，且GPX-3的低表達(dá)與腮腺多形性腺瘤的發(fā)生及惡變密切相關(guān)，故GPX-3有望成為腮腺多形性腺瘤惡變及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。目前GPX-3對(duì)腫瘤的作用機(jī)制尚不明確，在臨床的靶向治療上仍需進(jìn)一步研究。隨著GPX-3作用機(jī)制研究的深入，它終將在腫瘤基因靶向治療上進(jìn)一步被突破，為腮腺多形性腺瘤復(fù)發(fā)及惡變的治療提供新思路，從而減少反復(fù)手術(shù)對(duì)患者造成的創(chuàng)傷。