趙雯宇 司富春

中圖分類號 R73 5.1;R965

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）03-0314-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.03.12

摘要 目的：研究瓜蒂水提物和醇提物對食管癌TE-1、EC-1細胞增殖、遷移、克隆形成的影響及作用機制。方法：體外培養(yǎng)TE-1、EC-1細胞，分別加入質量濃度均為0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL的瓜蒂水提物或醇提物（以提取物粉末計）進行培養(yǎng)，采用MTT法檢測細胞的生長抑制率并計算半數(shù)抑制濃度（IC⁵⁰）。將TE-1、EC-1細胞分為TE-1/EC-1空白組、TE-1/EC-1瓜蒂水提物組（藥液濃度均為ICso）、TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組（藥液濃度均為ICso），采用實時無標記細胞分析（RTCA）法檢測各組細胞的增殖與遷移，繪制細胞增殖、遷移曲線;采用顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)學的變化;采用軟瓊脂克隆形成試驗分析各組細胞克隆形成能力的變化，并計算細胞克隆形成率;采用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期、凋亡率;采用Western blotting檢測各組細胞表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶C-a（PKC-a）的相對表達量。結果：瓜蒂水提物作用于TE-1、EC-1細胞的ICso分別為49.24、76.38μg/mL，瓜蒂醇提物作用于TE-1、EC-1細胞ICs。分別為9.08、14.53μg/mL;瓜蒂水提物和醇提物加藥后30h內對細胞有增殖抑制作用;瓜蒂水提物和醇提物加藥后60 h內對細胞有遷移抑制作用。與TE-1/EC-1空白組比較，各加藥組細胞數(shù)量明顯減少，細胞結構松散，多數(shù)細胞輪廓消失、變圓等;細胞克隆形成率顯著下降（P<0.Ol）;G²期細胞百分率顯著升高（ P<0.01），G¹期、S期細胞百分率顯著降低（P<0.05）;早、晚期凋亡率均顯著增加（P<0.05）;EGFR、PKC-a蛋白相對表達量顯著降低（P<0.01）。與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組細胞克隆形成率顯著下降（P<0.05）;G²期細胞率顯著升高（P<0.05）;EGFR、PKC-a蛋白相對表達量顯著降低（P<0.01）;TE-1瓜蒂醇提物組早、晚期細胞凋亡率顯著降低（JP<0.05）;EC-1瓜蒂醇提物組早、晚期細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。結論：瓜蒂水提物和醇提物可影響TE-1、EC-1細胞增殖、遷移、克隆形成的能力，促進細胞凋亡，其作用機制可能與下調EGFR、PKC-a蛋白有關。關鍵詞瓜蒂;食管癌;水提物;醇提物;細胞增殖;細胞遷移;克隆形成;作用機制

食管癌是全球十大癌癥之一，2018年新增病例572000例，死亡率居全球第6位，5年生存率低于20% [1-2]，其中亞洲是食管癌的高發(fā)區(qū)[3]。由于對食管癌發(fā)病機制的認識有限，目前缺乏特異性的臨床診斷指標，加之其早期癥狀不典型，故大部分患者確診時已處于中晚期，錯失了手術機會;而且臨床化療副作用較大，化療耐藥不斷出現(xiàn)，致使化療效果欠佳[4]。雖然近幾年出現(xiàn)了針對表皮生長因子受體（EGFR）、程序性細胞死亡蛋白1通路（PDl-PDL1）等的靶向治療方法[5-6]，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多階段、多個基因及多條信號通路的異常，機制復雜，致使靶向藥物的研發(fā)和應用也受到限制，大部分食管癌患者仍然不能得到有效的治療[7]。

為尋找抗腫瘤作用的有效新藥，本課題組前期以人食管癌細胞為模型，做了大量的中藥方劑篩選，發(fā)現(xiàn)《傷寒論》中瓜蒂散水提物能夠明顯抑制食管癌細胞增殖[8]。瓜蒂是葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo L）的果蒂，其性味苦寒有毒，歸足陽明胃經，具有涌吐痰食、祛濕退黃的功效[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，瓜蒂水提物、醇提物對人胃腺癌SGC-7901細胞、人肺癌NCI-H460細胞、人肝癌SMMC-7721細胞、人白血病K562細胞及小鼠成纖維細胞L929的增殖有明顯抑制作用[10]。其主要成分葫蘆素類成分，也具有強大的抗腫瘤作用，同時可以降壓、抑制心肌收縮力、減慢心律及抗炎[11-13]。

為了進一步明確瓜蒂抗食管癌細胞的主要成分及機制，筆者研究瓜蒂水提物和醇提物對人食管癌TE-1、EC-1細胞的增殖、遷移、克隆形成、細胞周期、細胞凋亡的影響;同時考察其對細胞EGFR及其下游的中心分子蛋白激酶C-a（PKC-a）蛋白表達的影響，進行初步的分子機制研究，以期為瓜蒂臨床應用及新藥研發(fā)提供參考。

l 材料

1，1 儀器

xCElligence型實時無標記細胞功能分析（RTCA）儀（美國ACEA生物公司）;ELx800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）;RE5299FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）;BPN-80CW型細胞培養(yǎng)箱（美國Kendro公司）;Ax-iovert20型倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品與試劑

瓜蒂藥材（批號：20103112）購自河南本草國藥館，經河南中醫(yī)藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為真品;RP-MI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：1877236）;胎牛血清（澳大利亞AusGenex公司，批號：FBSSA00518-2）;MTT（批號：511C023）、胰蛋白酶（批號：20326B）均購自美國Sigma公司;乙二胺四乙酸（EDTA，批號：0105-1KG）、二甲基亞砜（DMSO，批號：821D036）均購自美國Amresco公司;青霉素干粉（華北制藥股份有限公司，批號：H20013036，規(guī)格：80萬單位）;鏈霉素干粉（山東魯抗股份有限公司，批號：120913，規(guī)格：100萬單位）;流式細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA511-KGA512）;流式細胞凋亡檢測試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，批號：AP101）;兔抗EGFR單克隆抗體（批號：GR320346-9）、兔抗PKC-a單克隆抗體（批號：GR316444-6）、兔抗人肌動蛋白β（β-actin）單克隆抗體（批號：GR3176819-2）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：00051405）;水為超純水。

1.3 細胞

人食管癌細胞株TE-1、EC-1為河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)方證信號傳導重點實驗室保存。

2 方法與結果

2.1 瓜蒂提取物的制備

2.1.1 瓜蒂水提物稱取瓜蒂藥材20g，加入350mL水浸泡1h，武火煮沸，文火煎煮約1h，放至室溫后過濾，55℃旋蒸至藥液濃稠，50℃真空干燥48h后刮取藥物粉末、稱質量，得率為141.2mg/g;取適量瓜蒂水提物粉末用DMSO適量溶解，加水制成質量濃度為300mg/mL的瓜蒂水提物母液（以提取物粉末計，下同），再用培養(yǎng)基稀釋成4mg/mL藥液，0.22μm濾頭過濾除菌，-20℃冰箱保存，備用。

2.1.2 瓜蒂醇提物取瓜蒂藥材100g于粉碎機中粉碎，按照1：7（m/V）加入95%乙醇700mL，混勻，避光浸泡7d，每日振蕩2次，5min/次;7d后過濾，55℃旋蒸至藥液濃稠，50℃真空干燥48h后刮取藥物粉末、稱質量，得率為52.4mg/g;取適量瓜蒂醇提物粉末按“2.1.1”項下“DMSO溶解……備用”處理，即得。

2.2 細胞培養(yǎng)

將細胞置于37℃、5% CO²培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。試驗時，細胞用含EDTA胰蛋白酶進行消化，接種于直徑10cm培養(yǎng)皿或96孔培養(yǎng)板中。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.O軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以 ±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用f檢驗。以概率法[16]計算半數(shù)抑制濃度（IC⁵⁰）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.4 MTT法檢測瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞生長的抑制作用

將TE-1、EC-1細胞以5×10₄個/mL的細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5% C0²條件下貼壁培養(yǎng)24h后加入含有瓜蒂水提物和醇提物的含血清培養(yǎng)基，藥液濃度分別為O（空白組）、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL（每個濃度平行3孔），繼續(xù)培養(yǎng)48h;去除培養(yǎng)上清，每孔加入0.5mg/mL MTT溶液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄MTT溶液，然后加入150μL DMSO。用酶標儀于570、630nm波長處分別測定各孔吸光度（OD值），計算兩種細胞的生長抑制率（%），細胞生長抑制率=（1-加藥組平均OD值）/空白組平均OD值×100%。兩種細胞生長抑制率及IC。。測定結果見表1。

2，5 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞增殖、遷移的影響

2.5.1 增殖試驗在E-Plate View 16孔板中加入50μL無血清培養(yǎng)基，于RTCA DP監(jiān)測臺檢測基線后，在每孔中分別加入100μL TE-1細胞或EC-1細胞懸液（1Xl05個/mL），于超凈臺中室溫沉降30min后，放回RTCA DP監(jiān)測臺檢測各孔細胞指數(shù)。持續(xù)檢測24h后，將細胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組4個復孔。各加藥組每孔加入5μL瓜蒂相應的水提物或醇提物IC⁵⁰。濃度的藥液（空白組不加）后繼續(xù)檢測各組細胞指數(shù)變化，共檢測60h，記錄細胞增殖曲線。各組細胞的增殖曲線見圖1。

由圖1可知，與TE-1/EC-1空白組比較，瓜蒂水提物或醇提物均能明顯抑制TE-1細胞或EC-1細胞的增殖，且瓜蒂醇提物對細胞的抑制作用更明顯，兩種提取物在加藥后30h內有增殖抑制作用。

2.5.2 遷移試驗將細胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組4個復孔。在CIM-Plate16下室空廣1組每孔中加入165μL含血清培養(yǎng)基，加藥組每孔加入165μL含有瓜蒂水提物或醇提物IC。o濃度的含血清培養(yǎng)基;CIM-Plate16上室中空門組和各加藥組分別加入30μL無血清培養(yǎng)基，將CIM-Plate16置于培養(yǎng)箱中平衡1h。在平衡期間制備兩種細胞懸液，調整細胞懸液濃度均為6xl0₅個/mL。CIM-Plate16平衡th后，于RTCA DP監(jiān)測臺上檢測基線，后在CIM-Plate16上室中加入100μL細胞懸液，室溫沉降30min后，將CIM-Plate16放回RTCA DP監(jiān)測臺繼續(xù)檢測各組細胞指數(shù)，共檢測48h，記錄細胞遷移曲線。各組細胞的遷移曲線見圖2。

由圖2可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細胞遷移緩慢，抑制作用主要集中在加藥后60h內，約60h后TE-1、EC-1細胞遷移進入平臺期。

2.6 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞形態(tài)學的影響

將TE-1、EC-1細胞于直徑10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組。各加藥組加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度的含血清培養(yǎng)基，空白組加入等體積的空白含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后采用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)。各組細胞形態(tài)學觀察結果見圖3。

由圖3可知，TE-1/EC-1空白組細胞輪廓清晰，形態(tài)規(guī)則;與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細胞數(shù)量明顯減少，細胞結構松散，且可見少量細胞碎片，多數(shù)細胞細胞輪廓消失、變圓，甚至呈不規(guī)則形，細胞膜皺縮、發(fā)泡。

2.7 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞克隆能力的影響

制備TE-1、EC-1單細胞懸液，調整細胞濃度為8x10₃個/mL。將細胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組，EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組3個復孔，進行軟瓊脂克隆形成試驗。分別配制0.6%、1.2%的低熔點瓊脂糖溶液，80 0C水浴完全溶解后高壓滅菌，備用;將1.2%低熔點瓊脂溶液與2xRMPI 1640含血清培養(yǎng)基以1：1（V/V）制成0.6%底層瓊脂液，再以0.8mL/孔鋪滿24孔板（TE-1、EC-1細胞各1個），室溫靜置凝固;將0.6%低熔點瓊脂液與2xRMPI 1640含血清培養(yǎng)基以1：1（V/V）制成0.3%的上層瓊脂液，每孔加0.8mL上層瓊脂液和100μLTE-1細胞或EC-1單細胞懸液。各加藥組分別加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度藥液10μL（空白組不加），室溫靜置凝固，再于37℃、5%C0²的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。顯微鏡下肉眼觀察細胞克隆球并計數(shù)，計算細胞克隆數(shù)和克隆形成率，細胞克隆形成率=平均細胞克隆數(shù)/每孔接種細胞數(shù)×100%[8]。各組細胞的軟瓊脂克隆球觀察結果見圖4，細胞克隆形成率見表2。

由圖4可知，TE-1/EC-1空白組在不同的軟瓊脂層有多個圓形和類圓形細胞克隆形成，細胞輪廓清晰、結構緊密、排列整齊、形態(tài)規(guī)則，TE-1/EC-1各加藥組細胞克隆數(shù)明顯減少、變小，且克隆球呈現(xiàn)不規(guī)則的多邊形、棍棒形，邊緣不光滑，結構松散，皺縮變小，輪廓不清晰。

由表2可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1瓜蒂各加藥組的細胞克隆形成率顯著降低（P<0.01）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組細胞克隆形成率顯著降低（P<0.05）。

2.8 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞周期的影響

將TE-1、EC-1細胞以lXl0₅個/mL的濃度接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%C02條件下貼壁培養(yǎng)24h后，將細胞分為TE-1空白組、TE-1瓜蒂水提物組、TE-1瓜蒂醇提物組、EC-1空白組、EC-1瓜蒂水提物組、EC-1瓜蒂醇提物組，每組3個平行。各加藥組分別加入含有瓜蒂水提物或醇提物IC⁵⁰濃度的藥液，空白組加入RMPI 1640含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，用15mL離心管收集細胞，2000 r/min離心3min或棄上清，1mLPBS重懸細胞，加入乙醇固定細胞（終體積分數(shù)為70%），于4℃下過夜。棄掉乙醇，PBS洗去固定液，加入500μL PI/RNase A染色工作液，室溫避光孵育30min后，用400目篩網過濾細胞。用流式細胞儀分析各組細胞的周期，并用Modifit LT軟件分析不同細胞周期的百分率。各組細胞周期的檢測結果見表3。

與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組G²期細胞百分率顯著升高（P<0.01），G¹期、S期細胞百分率顯著降低（P<0.05）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組G²期細胞百分率顯著升高（P<0.05）。

2.9 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞凋亡的影響

按“2.8”項下方法“將TE-1、EC-1細胞以……培養(yǎng)48h后”操作，收集細胞，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明處理細胞。用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況，并用CellQuest軟件分析細胞凋亡率。各組細胞凋亡率檢測結果見表4。

由表4可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組細胞的早、晚期凋亡率均顯著升高（P<0.05）;與TE-1瓜蒂水提物組比較，TE-1瓜蒂醇提物組早、晚期細胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）;與EC-1瓜蒂水提物組比較，EC-1瓜蒂醇提物組早、晚期細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。

2，10 瓜蒂水提物和醇提物對兩種細胞中EGFR、PKC-a，蛋白表達的影響

按“2.8”項下方法“將TE-1、EC-1細胞以……培養(yǎng)48h后”操作，收集細胞。采用Western blotting法檢測各組細胞中EGFR、PKC-a蛋白的表達情況。將所收集的各組細胞處理后上樣，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉膜，封閉，洗滌，加入EGFR、PKC-a-抗（1：2000）孵育，洗滌，加入二抗（1：1000）反應，洗滌后，以ECL試劑盒進行曝光、顯影、定影，洗片。采用Image圖像分析軟件對蛋白的相對表達量進行分析，以目標蛋白與內參蛋白（β-actin）的灰度比值表示。各組細胞中EGFR、PKC-a蛋白表達的電泳圖見圖5，相對表達量的測定結果見表5。

由表5可知，與TE-1/EC-1空白組比較，TE-1/EC-1各加藥組EGFR、PKC-a蛋白相對表達量均顯著降低（P<0.01）;與TE-1/EC-1瓜蒂水提物組比較，TE-1/EC-1瓜蒂醇提物組EGFR、PKC-a蛋白相對表達量均顯著降低（P<0.01）。

3 討論

食管癌為常見的消化系統(tǒng)腫瘤，東南亞、東亞地區(qū)發(fā)病率最高，中國的食管癌發(fā)病率也在全球排名前5位[3]。目前植物源藥物如紫杉類、長春堿類、鬼臼素類等藥物的出現(xiàn)給腫瘤治療帶來了新的希望，且具有毒副作用小、不易耐藥等優(yōu)點[14]。近年來對瓜蒂的主要成分葫蘆素的研究較多，結果發(fā)現(xiàn)葫蘆素A、B、D、E均具有廣泛的抗腫瘤作用[15-19]，提示瓜蒂提取物可能具有良好的抗腫瘤活性?；诖?，筆者推測瓜蒂提取物也可能對食管癌具有抗腫瘤活性。

食管癌細胞的轉移和侵襲是影響其預后的主要因素[20]。本試驗結果證實了瓜蒂水提物和醇提物均能夠顯著抑制人食管癌TE-1、EC-1細胞的增殖，且存在一定的劑量、時間依賴關系;其也能夠顯著抑制兩種細胞遷移，藥物作用時間主要集中在加藥后60h內。細胞克隆試驗結果證實瓜蒂水提物和醇提物作用后細胞克隆球較相應空白組明顯減小，數(shù)量明顯減少，提示瓜蒂兩種提取物均能有效降低食管癌細胞克隆形成能力。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞分裂增殖必須通過兩個關鍵的周期調控點，即G¹和G²期調控點。腫瘤細胞周期調控點失調、凋亡受到抑制，造成腫瘤細胞過度增殖，病情進一步發(fā)展和惡化。幾乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效應均與細胞周期機制有關，腫瘤可歸屬于一類細胞周期疾病[21-22]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，以瓜蒂水提物和醇提物作用后，兩種細胞分裂被明顯阻滯在G²期且細胞早期和晚期凋亡率明顯上升，其中晚期凋亡率高于早期凋亡率。對于不同細胞，瓜蒂提取物誘導凋亡的效果不同：在TE-1細胞中，瓜蒂水提物誘導凋亡的效果強于醇提物;而在EC-1細胞中，則是瓜蒂醇提物誘導凋亡效果強于水提物。流式細胞周期和凋亡試驗結果提示瓜蒂水提物和醇提取物均可通過阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡，以此來達到抑制兩種食管癌細胞的目的。

EGFR是原癌基因Cerb B-l的表達產物，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，與相應配體結合后，其信號通路可調控細胞的增殖、凋亡、血管形成及侵襲轉移等生命活動[23]。多種惡性腫瘤中均可檢測到EGFR的過度表達，研究發(fā)現(xiàn)EGFR在食管癌組織存在高表達[14]。EGFR高表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關[24-25]。PKC是一類富含絲、蘇氨基酸的激酶[27]，PKC-a是其中重要的一種亞型，有促進神經遞質的釋放、突觸塑形、細胞增生、基因表達等作用?；罨蟮腜KC-a可催化各種蛋白質底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基，使其磷酸化，通過原癌基因絲蘇氨酸蛋門激酶/絲裂原活化蛋白激酶/激活蛋白1（raf-MAPK-APl）、B淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）、細胞周期蛋門依賴性激酶抑制蛋白（p27）、小G蛋白超家族激酶A（RhoA）等通路，發(fā)揮其調節(jié)細胞生長、分化、周期、遷移、凋亡、基因表達等多種功能[28-29]，是信號通路的中心分子之一。EGFR可通過活化PLC-yl從而激活下游PKC-a。本研究顯示，TE-1/EC-1空門組細胞中EGFR、PKC-a均高表達，而瓜蒂水提物和醇提物作用后均下調了EGFR、PKC-a的表達，提示瓜蒂兩種提取物可能通過部分阻斷EGFR信號通路發(fā)揮抑制食管癌細胞增殖與遷移、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡的作用。

綜上所述，瓜蒂水提物和醇提物能有效抑制人食管癌TE-1、EC-1細胞的增殖、遷移，降低細胞的克隆形成能力，阻滯細胞周期與誘導細胞凋亡，其機制可能與下調EGFR、PKC-a蛋白表達有關。在后續(xù)研究中，可對瓜蒂提取物中抗食管癌的主要成分、藥理作用及進一步的分子機制進行深入挖掘，以期為瓜蒂治療食管癌的臨床應用提供參考。

參考文獻

[1]ZHANG HF，ALSHAREEF A，WU C，et al.Loss of miR-200b promotes in vasion via activating the Kindlin-2/inte-grin β l/AKT pathway in esophageal squamous cell carci-noma： an E-cadherin-independent mechanism[J]. Oncotar-get，2015，6（30）：28949-28960

[2]MILLER KD， SIEGEL RL， LIN CC. Cancer treatment and sur-vivorship statistics[J]. CA Cancer，Clin， 2016， 66 （4）：271-289.

[3]BRAY F，F(xiàn)ERLAY J， SOERJOMATARAM I，et al Glob-al cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of inci-dence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 coun-tries[J]. CA Cancer，Clin，2018，68（6）：394-4 24

[4]李道娟，梁迪，靳晶，等，上消化道惡性腫瘤流行病學趨勢[J]腫瘤預防與治療，2018，31（1）：62-68

[5] BURTNESS B，GOLDWASSER MA，F(xiàn)LOOD W，et alPhaseⅢrandomized trial of cisplatin plus placebo com-pared with cisplatin plus cetuximab in metastatic/recurrenthead and neck cancer： an Eastern Cooperative OncologyGroup study[J].L， Clin Oncol， 2005， 23（ 34）：864 6-8654

[6]SHARMA P，ALLISON JP. The future ofimmune check-point therapy[J]. Science， 2015.DOI： 10.1126/science.aaa8172.

[7]SONG Y， LI L， QU Y， et al Identiflcation of genomic al-terations ln oesophageal squamous cell cancer[J]. Nature，2014，509（7498）：91-95

[8]劉鋒.《傷寒論》方劑對人食管癌TE-1 .EC-1、EC109.EC9706細胞株生物學活性的影響[D]鄭州：河南中醫(yī)藥大學，2018.

[9]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會中華本草：第五冊[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?999：515-519.

[10]王露，陶遵威甜瓜蒂3種提取物體外抗腫瘤活性的比較研究[J]天津醫(yī)藥，2017，45（4）：359-363.

[11]李瑾，劉炯活性氧與腫瘤關系的研究進展[J]東南國防醫(yī)藥，2019，21（3）：297-301

[12]張洪亮，葫蘆素B在體內外對肝癌細胞的生長抑制作用[D]沈陽：中國醫(yī)科大學，2008.

[13]陳永獻.治療肝炎、肝癌新藥葫蘆素片[J]中草藥，1987，18（10）：21.

[14]馮陽陽，黑忠林，拜周蘭，等，食管鱗癌組織中HIF-la、VEGF和EGFR蛋白的表達與預后的關系[J]國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2018，24（3）：297-307.

[15]崔姍姍，邵雷，高小玲，等，半夏瀉心湯對食管癌Eca9706細胞周期、凋亡及STAT3蛋白的影響[J]中國實驗方劑學雜志，2016，22（4）：142-145

[16]SIKANDER M，HAFEEZ BB，MALIK S，et al.Cucurbita-cin D exhibits potent anti-cancer activity ln cervical cancer[J]. Sci Rep，2016.DOI： 10.103 8/srep36594

[17]張萌，邊志剛，何平葫蘆素B對人胃癌BGC-823細胞增殖及凋亡的影響[J]實用藥物與臨床，2016，19（5）：548-552

[18]CHEN W， LEITER A， YIN D， et al.Cucurbitacin B inhi-bits growth， arrests the cell cycle， and potentiates anti-pro-liferative efficacy of cisplatin in cutaneous squamous cellcarcmoma cell lines[J]. Int‘，Oncol， 2010， 37 （3）：737-743

[19]沈杭，陳宗科，錢葉本，等.葫蘆素E誘導肝癌細胞凋亡及其機制[J]臨床與實驗病理學雜志，2015， 31（12）：1339-1343

[20]JAFARGHOLIZADEH N， ZARGAR SJ，YASSA N， et alPurification of Cucurbitacins D， E， and I from Ecballiumelaterium （L.）A Rich fruits and study of their cytotoxiceffects on the AGS cell Iine[J]. APJCP， 2016， 17（ 10）：4631-4635

[21]11 YL， ZHANG XY， LENG Y， et al Global protein ex-pression analysis of molecular markers of DS-1 -47，a com-ponent of implantation-promoting traditional Chinesemedicine[J].L，Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2016，36（6）：910-915

[22]HARTWELL LH， KASTAN MB. Cell cycle control andcancer[J]. Science， 1994， 266（5 192）： 1821-1828.

[23]YARDEN Y，SLIWKOWSKI M. Untangling the ErbB sig-naling network[J]. Nat Rev MoI Cell Biol， 2001，2（2）：127-137

[24]WANG KL，WU TT，CHOIIS，et al Expression of epider-mal growth factor receptor in esophageal and esophago-gastric junction on adenocarcinomas： association withpoor outcorue[J]. Cancer， 2007， 109（4）：658-667

[25]姚型鋒，黃俊星，趙坤，等EGFR.HER2在食管鱗癌中的狀態(tài)及臨床意義研究[J]現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014， 22（4）：819-822.

[26]孫文澤，蘇進，施瑤，等EGFR與VEGF在食管鱗癌組織中的表達及其與療效的關系[J]現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2019，27（6）：981-985.

[27]ADAMS JM，CORY S The bcl-2 family： arbiters of cellsurvival[J]. Science， 1998， 281（ 5381）： 1322-1326

[28]MICHIE AM， NAKAGAWA R.The link between PKCoregulation and cellular transforruation[J]. Immunol Lett，2005，96（2）：155-162.

[29]BALBOA MA， FIRESTEIN BL， GODSON C， et al.Pro-tein kinase C alpha mediates phospholipase D activationby nucleotides and phorbolester in Madin-Darby caninekidney cells. Stimulation of phospholipase D is indepen-dent of activation of polyphosphoinositide-specitlc phos-pholipase C and phospholipase A2 [J].L， Biol Chem， 1994，269（14）：10511-10516

（收稿日期：2019-08-27修回日期：2019-10-24）

（編輯：唐曉蓮）