吳雄飛,陳艷

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染在全球仍是一個嚴(yán)重公共健康問題。我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，約有7 800萬HBV慢性感染者，約占全國人口的7%，形勢嚴(yán)峻[1]。乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是在慢性HBV肝炎基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝臟功能失代償，在我國肝衰竭患者中占80%～90%，病情兇險(xiǎn)，若未得到及時(shí)有效治療，病死率>70%[2]。現(xiàn)階段內(nèi)科綜合治療、肝移植、人工肝支持系統(tǒng)是治療HBV-ACLF常用方法，其中單用內(nèi)科綜合治療，病死率仍高達(dá)60%～70%，肝移植治療有效率較高，但常受供肝不足限制，而人工肝支持系統(tǒng)可為患者進(jìn)行肝移植或肝細(xì)胞再生贏得時(shí)間，從而提高患者生存率[3]。血漿置換(plasma exchange，PE)、血漿吸附灌流(plasma perfusion，PP)是兩種常用非生物型人工肝支持療法，高萌等[4]研究證實(shí)，PE優(yōu)于單純內(nèi)科治療，但可能誘發(fā)過敏反應(yīng)、代謝性堿中毒，且實(shí)踐中各醫(yī)院血液供應(yīng)普遍緊張； 研究證實(shí)，PP可吸附血液中不良因子，但對纖溶功能有一定影響[5]，因此如何優(yōu)化治療方案成為臨床研究熱點(diǎn)。本研究選取64例HBV-ACLF患者，探討人工肝血漿置換+膽紅素吸附的臨床療效及其對患者機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，為臨床提供基礎(chǔ)性資料。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2019年1月我院收治的64例HBV-ACLF患者，隨機(jī)分為PE組和聯(lián)合組，各32例。兩組合并肝硬化、性別、年齡、并發(fā)癥、肝衰竭分期等均衡可比(P>0.05)，見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：認(rèn)知功能正常；肝衰竭診斷及分期均參考《肝衰竭診治指南》[6]中標(biāo)準(zhǔn)；無精神病史；有乙肝病史，急性起病(病程<4周)；本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬自愿簽署知情同意書。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：肝外梗阻引起的肝損害；妊娠期患者；其他嗜肝病毒重疊感染者；存在人類免疫缺陷病毒感染者；合并惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)科綜合治療 兩組均接受內(nèi)科綜合治療，包括抗HBV治療、臥床休息、退黃、保護(hù)肝細(xì)胞、促肝細(xì)胞生長素等，并酌情給予凝血酶原符合物、人血白蛋白等支持治療，人工肝治療全程密切觀察動靜脈壓、跨膜壓，進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，每次治療前、治療后1周均檢測血常規(guī)、凝血指標(biāo)。

表1 兩組一般資料比較

注：肝衰竭分期根據(jù)《肝衰竭診治指南》判斷

1.3.2 PE組 給予血漿置換。治療前給予葡糖糖酸鈣、地塞米松預(yù)防過敏反應(yīng)，采用血液凈化人工肝支持系統(tǒng)(WLEGX-888，北京偉力公司)，血流量100 mL/min，血漿分離速度20～30 mU/min，每次置換血漿2 500 mL，補(bǔ)充液為新鮮冰凍血漿2 000 mL及4%人血白蛋白林格液500 mL，抗凝方式為體外肝素化，每周治療2次，治療1周。

1.3.3 聯(lián)合組 給予人工肝血漿置換+膽紅素吸附。每次治療前先進(jìn)行2.5 h PP，吸附前低分子肝素抗凝，血漿分離速度20～30 mL/min，血流量110～150 mL/min，血漿灌注量達(dá)目標(biāo)值(4.5～6.5 L)后撤掉膽紅素吸附器，再進(jìn)行PE。置換廢棄血漿1 500 mL，置換液為新鮮冰凍血漿1 000 mL及4%人血白蛋白林格液500 mL，每周治療2次，治療1周。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)比較兩組近期療效(治療1周后好轉(zhuǎn)率)與遠(yuǎn)期療效(治療后3個月生存率)：治療后1周好轉(zhuǎn)評估標(biāo)準(zhǔn)為腹水、黃疸、腹脹、乏力等癥狀體征明顯好轉(zhuǎn)，總膽紅素降至5倍正常值以下，國際標(biāo)準(zhǔn)化比值<1.6。

(2)比較兩組治療前、治療1周后肝功能指標(biāo)：血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、膽汁酸(TBA)、白蛋白(ALB)水平，通過全自動生化分析儀檢測。

(3)比較兩組治療前、治療1周后凝血酶原活動度(PTA)、血小板(PLT)、白細(xì)胞(WBC)水平，PTA通過凝固法測定凝血酶原時(shí)間計(jì)算，PLT、WBC通過全自動生化分析儀檢測。

(4)比較兩組治療前、治療1周后電解質(zhì)變化：Na+、K+水平，通過電解質(zhì)分析儀檢測。

(5)比較兩組治療前、治療1周后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78、GRP94、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)婚蛋白同源蛋白(CHOP)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)mRNA水平。采集外周血標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，GRP78上下游引物分別為5′-GAACACAGTGGTGCCTACCAAGAA-3′、5′-TCCA-GTCAGATCAAATGTACCCAGA-3′，GRP94上下游引物分別為5′-ACTGTTGAGGAGCCCATGGAGG-3′、5′-GCTGAAGAGTCTC-GCGGGAAAC-3′，CHOP上下游引物分別為5′-TGGCACCCA-GCACAATGAA-3′、5′-TGCTTTCAGGTGTGGTGATGTATG-3′，CyclinD1上下游引物分別為5′-GCTGCTCCTGGTGAACAAGC-3′、5′-CACAGAGGGCAACGAAGGTC-3′，Caspase-12上下游引物分別為5′-CTAACTGTCCGAGTCTGAGAA-3′、5′-AAGGTAG-AAGTAGCGTGTCAT-3′，反應(yīng)體系共20 μL，反應(yīng)條件第一步95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火45 s，共40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 近期與遠(yuǎn)期療效

2.2 肝功能指標(biāo)

兩組治療前AST、ALT、TBIL、TBA、ALB比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；聯(lián)合組治療1周后AST、ALT、TBIL、TBA低于PE組(P<0.05)；兩組治療1周后ALB比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 PTA、PLT、WBC

兩組治療前、治療1周后PTA、PLT、WBC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 電解質(zhì)變化

治療1周后聯(lián)合組Na+水平高于PE組(P<0.05)；兩組治療1周后K+水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

聯(lián)合組治療1周后GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12 mRNA低于PE組，CyclinD1 mRNA高于PE組(P<0.05),見圖1-2。

3 討論

HBV-ACLF是一種病死率較高疾病。雖然肝移植是治療HBV-ACLF最優(yōu)選擇，但受治療費(fèi)用昂貴、供體肝源緊張等因素限制難以廣泛應(yīng)用，以血液凈化為基礎(chǔ)非生物型人工肝能為肝細(xì)胞再生及肝功能恢復(fù)或肝移植創(chuàng)造機(jī)會。PE作為中間型人工肝，通過膜式血漿分離方法從全血中分離出血漿棄去，并補(bǔ)充等量新鮮冰凍血漿，可清除毒素，補(bǔ)充凝血因子、白蛋白等生物活性物質(zhì)。但PE對水溶性毒素清除效果欠佳，當(dāng)患者伴有肝腎綜合征、肝性腦病等并發(fā)癥時(shí)，單純依賴PE難以阻止嚴(yán)重肝功能衰竭患者昏迷進(jìn)展及逆轉(zhuǎn)肝昏迷，大量中、小分子量物質(zhì)可在PE時(shí)逃逸至組織間隙，分布于血管外毒性物質(zhì)清除率低，故需聯(lián)合其他方法，以最大程度清除有害物質(zhì)。

表2 兩組治療前后肝功能指標(biāo)比較

表3 比較兩組

表4 比較兩組電解質(zhì)變化

圖1 治療前兩組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)

實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，HBV-ACLF患者常伴有明顯黃疸，而過高TBIL、TBA可引起肝細(xì)胞凋亡、多臟器損害，故清除TBIL、TBA對治療HBV-ACLF至關(guān)重要[7]。PP將血液直接送入血液灌流器，通過接觸樹脂等吸附劑，清除血液中某些內(nèi)源性與外源性毒素，對TBIL、TBA清除效果較好，但不能補(bǔ)充HBV-ACLF患者所需凝血因子、ALB等物質(zhì)，反而因吸附蛋白結(jié)合毒素能力強(qiáng)，損耗大量ALB，且對凝血因子也有部分吸附作用。因此，本研究采用人工肝血漿置換+膽紅素吸附，以實(shí)現(xiàn)治療優(yōu)化。結(jié)果顯示，聯(lián)合組治療后3個月生存率(75.86%)與PE組(66.67%)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但聯(lián)合組治療后1周好轉(zhuǎn)率(75.00%)高于PE組(50.00%)，AST、ALT、TBIL、TBA低于PE組(P<0.05)，提示人工肝血漿置換+膽紅素吸附可改善肝功能，提高TBIL、TBA清除率，在短期內(nèi)使患者病情得到有效控制。分析原因發(fā)現(xiàn)，膽紅素吸附技術(shù)可特異性清除TBIL、TBA等毒素，有利于控制患者病情，穩(wěn)定患者內(nèi)環(huán)境，為再生能力較強(qiáng)的肝細(xì)胞創(chuàng)造恢復(fù)時(shí)機(jī)，而人工肝血漿置換能及時(shí)補(bǔ)充膽紅素吸附技術(shù)后凝血因子、ALB的丟失，糾正凝血酶原時(shí)間延長等問題，故能取得滿意治療效果。鐘珊等[8]研究指出，單純PE治療后好轉(zhuǎn)率為55.6%，低于人工肝血漿置換+膽紅素吸附的83.7%，本研究結(jié)果與其相符，表明人工肝血漿置換+膽紅素吸附能提高患者的近期療效。但本研究遠(yuǎn)期療效未得到顯著改善，可能與納入病例數(shù)量較少、疾病分期存在差異有關(guān)，下一步研究將進(jìn)一步增加病例數(shù)進(jìn)行探討。

圖2 治療后兩組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)

凝血功能、電解質(zhì)變化亦是反映人工肝治療過程中恢復(fù)程度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組治療前、治療1周后ALB、PTA、PLT、WBC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與兩組均輸入新鮮冰凍血漿有關(guān)。我們注意到，與治療前相比，兩組治療1周后ALB、PTA無明顯變化，表明肝功能恢復(fù)需一定時(shí)間，凝血因子產(chǎn)生少，蛋白合成能力尚未有效恢復(fù)，故人工肝治療后，仍應(yīng)重視患者凝血功能的治療。與治療前相比，兩組治療1周后PLT均降低，這與體外循環(huán)建立及抗凝劑應(yīng)用有關(guān)。根據(jù)長期臨床工作經(jīng)驗(yàn)，治療結(jié)束后1周內(nèi)患者PLT基本可恢復(fù)正常，由于研究資源有限，未進(jìn)行長期動態(tài)觀察，在下一步研究中將進(jìn)行上述指標(biāo)的動態(tài)觀察，以完善本研究的不足。此外，HBV-ACLF患者常因進(jìn)食減少、利尿劑應(yīng)用等出現(xiàn)低鈉血癥。本研究發(fā)現(xiàn)治療1周后兩組K+水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，聯(lián)合組Na+水平高于PE組(P<0.05)，與孫珂等[9]報(bào)道相符，提示人工肝血漿置換+膽紅素吸附可糾正低鈉現(xiàn)象，有助于保持患者電解質(zhì)平衡。與單純PP相比，人工肝血漿置換+膽紅素吸附另一優(yōu)點(diǎn)是，可減少血漿用量，這對普遍存在血源緊張的現(xiàn)狀具有一定緩解作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中重要膜性網(wǎng)狀細(xì)胞器，與蛋白質(zhì)合成修飾、脂類代謝等細(xì)胞功能息息相關(guān)。趙亞飛等[10]動物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可造成急性肝損傷，增加肝組織細(xì)胞凋亡，因此過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被視為肝炎、肝衰竭等肝病重要誘因。有證據(jù)顯示，肝細(xì)胞內(nèi)富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，HBV感染后，HNV病毒大量復(fù)制，蛋白合成量增多，可介導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且感染HBV后細(xì)胞丟失水分，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體脫落，造成蛋白質(zhì)合成場所缺失，無法正確折疊而堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，又可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。Torres等[12]研究施用?；切苋パ跄懰醽砜刂菩∈?，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可保護(hù)小鼠免于肝毒性。Han等[13]研究采用farnesoid X受體抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)CHOP表達(dá)降低，肝細(xì)胞死亡和肝損傷情況得到改善。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力感受器，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起重要調(diào)控作用，正常狀態(tài)下，GRP78與激活作用轉(zhuǎn)錄因子-6、跨膜蛋白激酶1等結(jié)合處于穩(wěn)態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中堆積大量未折疊蛋白或折疊錯誤蛋白時(shí)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78可發(fā)生解離，以重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，因此GRP78高表達(dá)可視為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物之一[14]。GRP94與GRP78相似，均為伴侶蛋白，兩者臨床表達(dá)意義基本等同[15]。謝宇曦[16]、Wang等[17]通過急性肝損傷小鼠模型發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，模型小鼠GRP78、GRP94表達(dá)增加，故GRP78、GRP94高表達(dá)可反映肝損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)GRP78途徑未能有效重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，可激活下游凋亡信號，作用于下游靶基因CHOP、Caspase-12等，激活凋亡啟動因子，促進(jìn)凋亡基因表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡[18]。房忠軍等[19]通過腹腔注射D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖建立小鼠急性肝衰竭模型，發(fā)現(xiàn)造模后肝損傷程度隨時(shí)間延長逐漸加重，且CHOP水平上升。肝細(xì)胞體外試驗(yàn)表明，降低Caspase-12、CHOP表達(dá)可減少脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[20]。CyclinD1系細(xì)胞周期家族成員之一，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此高表達(dá)時(shí)有利于肝細(xì)胞再生[21]。因此，本研究選取GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12作為反映機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者治療1周后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)均較治療前改善，且聯(lián)合組治療1周后GRP78、GRP94、CHOP、Caspase-12 mRNA低于PE組，CyclinD1 mRNA高于PE組(P<0.05)，提示人工肝血漿置換+膽紅素吸附可有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有利于保護(hù)肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，因此抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能成為治療HBV-ACLF潛在靶點(diǎn)。本研究不足之處在于，為單中心研究，納入樣本量較少，更可靠結(jié)果有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，人工肝血漿膽紅素吸附治療HBV-ACLF，可改善肝功能，提高TBIL、TBA清除率，糾正低鈉現(xiàn)象，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，近期療效良好。