王 堯，覃有振， 彭慧敏， 王慧深，巴宏軍

1)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤中心 廣州 510080 2)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部心血管兒科 廣州 510080

高脂血癥與心血管疾病密切相關(guān)。研究[1]表明，家族性高膽固醇血癥的后代在出生時(shí)或兒童早期已開(kāi)始形成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，到青春期已較明顯。 已有研究[2]表明，妊娠期婦女普遍存在高脂血癥，妊娠期高脂血癥可導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)發(fā)育異常并可持續(xù)至兒童期甚至成人期。妊娠期高脂血癥與新生兒高血糖及低出生體重等密切相關(guān)[3-4]，也可能是先天性心臟病發(fā)病的高危因素之一[5]。然而，妊娠期婦女脂代謝異常是否引起子代心肌異常尚不明確。本研究擬通過(guò)孕期高脂喂養(yǎng)誘發(fā)SD大鼠妊娠期高脂血癥，觀察妊娠期高脂血癥對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的影響，探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源與分組鼠齡96～103 d、體重240～260 g的清潔級(jí)SD大鼠30只，雌鼠20只，雄鼠10只, 購(gòu)于廣州市中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究中心[SCXK(粵) 2013-0034]。先置于濕度60%～70%、室溫18～25 ℃的環(huán)境中予普通飼料行適應(yīng)性喂養(yǎng)。3 d后雌雄按2∶1比例合籠,次日清晨陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子為受孕，記為妊娠第0天。孕鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，妊娠第21天為喂養(yǎng)終點(diǎn)。普通飼料及高脂飼料均購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。普通飼料由粗蛋白(20.7%)、粗纖維(38%)、粗灰分(26.6%)、粗脂肪(4.2%)、水分(8.2%)、礦物質(zhì)(2.3%)組成。高脂飼料由膽固醇(1%)、膽鹽(0.2%)、豬油(10%)、蛋黃粉(10%)、普通飼料(78.8%)組成。

1.2標(biāo)本采集和處理所有大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天下午2：00開(kāi)始禁食，禁食16 h后尾部采血，3 000 r/min離心10 min，于低溫冰箱凍存?zhèn)洳檠?。妊娠?1天再次留取血樣；剖宮取胎， 每只母鼠隨機(jī)選取一只胎鼠，取大小約1 mm×1 mm×1 mm的胎鼠心尖部組織置于多聚甲醛溶液中固定，備行組織學(xué)觀察。

1.3母鼠血脂檢測(cè)血脂檢測(cè)包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)。試劑盒由雅培公司提供。

1.4胎鼠心肌組織學(xué)表現(xiàn)取胎鼠心尖部心肌組織，于多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋后切片(厚度5～6 μm)，然后行HE染色。每只胎鼠隨機(jī)選擇3張切片于400倍鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變并計(jì)算病變積分[6]。心肌病變包括脂肪顆粒沉積、胞核染色加深、細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊等。計(jì)分規(guī)則：無(wú)病變?yōu)? 分, 病變范圍<25%、25%～50%、51%～75%、>75%分別記為1、2、3、4分。每張切片選取5個(gè)視野,計(jì)算平均得分。試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.5胎鼠心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)采用TBA方法檢測(cè)胎鼠心肌組織中丙二醛(MDA)水平，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶總活力(T-superoxide dismutase,T-SOD)。試劑盒購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物工程研究所。

1.6胎鼠心肌組織中磷酸化P38(p-P38)、P53蛋白的檢測(cè)分離胎鼠心尖部心肌組織，用RIPA裂解液裂解，4 ℃高速離心提取組織蛋白,使用BCA 法進(jìn)行定量,煮沸后行SDS-PAGE分離蛋白(美國(guó)Bio-Rad公司,恒壓80～110 V,1.5 h)。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，分別加入p-P38、P53抗體(均1∶500稀釋)、GAPDH 抗體(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3 次后加入二抗于室溫下孵育1 h?？贵w均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。ECL發(fā)光液顯色(A液和B液按1∶1混合)。利用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性、MDA水平、p-P38、P53 蛋白表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較見(jiàn)表1。孕前、孕第21天A組母鼠血脂水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組孕第21天TC、TD、LDL-c較孕前顯著升高，HDL-c顯著降低。

表1 兩組母鼠孕前及孕第21天血脂水平的比較(n=10) mmol/L

2.2兩組胎鼠心肌組織學(xué)表現(xiàn)光鏡下觀察，A組胎鼠心肌細(xì)胞呈橢圓形,胞核形態(tài)規(guī)則,位于細(xì)胞中央, 呈圓形或橢圓形，核染色均勻,且胞漿豐富(圖1A )。B組胎鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰, 可見(jiàn)較多脂肪樣顆粒,胞核形態(tài)不規(guī)則且染色較深(圖1B)。A組胎鼠心肌組織病變積分為(0.60±0.11),B組為(1.26±0.65)， B組大于A組(t=3.166，P=0.005)。

左上、左下：A組100倍、400倍；右上、右下：B組100倍、400倍

2.3兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性與MDA水平的比較B組胎鼠心肌組織中T-SOD活性及T-SOD/MDA比值較A組降低，MDA水平較A組升高，見(jiàn)表2。

表2 兩組胎鼠心肌組織中T-SOD活性及MDA水平的比較

2.4兩組胎鼠心肌組織中p-P38、P53蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)圖2及表3。與A組比較，B組胎鼠心肌組織中p-P38、P53 蛋白表達(dá)上調(diào)。

圖2 兩組胎鼠心肌組織中p-P38 和P53蛋白的表達(dá)

表3 兩組胎鼠心肌組織中P53和p-P38蛋白表達(dá)的比較

3 討論

妊娠是女性特殊的生理過(guò)程，在妊娠期，機(jī)體的組織器官會(huì)產(chǎn)生一系列生理功能的變化以適應(yīng)母體代謝及胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的需要，這其中包括血脂代謝狀態(tài)的改變。從生理角度講，孕期一定程度的血脂水平升高是保障胎兒正常發(fā)育所必需的，但是如果血脂水平超過(guò)一定程度，易導(dǎo)致機(jī)體損害，就屬于病理現(xiàn)象。既往研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，妊娠期高脂血癥可導(dǎo)致嚴(yán)重的妊娠期并發(fā)癥，如妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、急性胰腺炎等。康瑋等[9]的研究表明，大鼠妊娠期高脂血癥可影響子代成年期的血脂代謝并導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，孕期高脂喂養(yǎng)的母鼠存在嚴(yán)重的脂代謝紊亂，其胎鼠心肌細(xì)胞受損，提示孕期高脂血癥與胎鼠心肌細(xì)胞的損害有關(guān)。目前關(guān)于高脂血癥對(duì)心肌細(xì)胞損害的機(jī)制尚不明確。既往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，高脂血癥可造成胎盤(pán)動(dòng)脈粥樣硬化，并進(jìn)一步影響胎盤(pán)功能，可能與胎盤(pán)功能障礙所致遺傳物質(zhì)異常有關(guān)，然而具體的機(jī)制尚不清楚。也有研究[12]認(rèn)為，高脂血癥易致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，氧化應(yīng)激水平升高可致機(jī)體器官結(jié)構(gòu)及功能損傷。因此，有必要進(jìn)一步探討母鼠高脂血癥對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞損害的具體分子機(jī)制，尤其是與氧化應(yīng)激的關(guān)系。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí),體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由族和活性氮自由族產(chǎn)生過(guò)多,引起炎性細(xì)胞的侵入，造成組織損傷[13]。脂代謝異常是機(jī)體重要的代謝異常，高脂血癥與冠心病、糖尿病、代謝綜合征等密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激參與了糖尿病、多囊卵巢綜合征、神經(jīng)病變等的發(fā)生發(fā)展[14-16]。高脂血癥是氧化應(yīng)激的主要誘因之一[12]。本研究結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)母鼠的胎鼠心肌組織中T-SOD水平較對(duì)照組下降，而MDA水平升高；同時(shí)心肌組織中p-P38、P53 蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)。本研究結(jié)果提示孕期血脂代謝紊亂的母鼠體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的一致。氧化應(yīng)激水平升高容易啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，而細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激物質(zhì)可導(dǎo)致核酸損傷，進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子P53，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。因此，高脂血癥母鼠其胎鼠心肌損害可能與氧化應(yīng)激誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，母鼠高脂血癥會(huì)對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞造成一定的損害，并且這種心肌損害可能與氧化應(yīng)激增強(qiáng)有關(guān)。因此，妊娠期合理安排營(yíng)養(yǎng)及定期監(jiān)測(cè)血脂水平對(duì)維持胎兒健康具有十分重要的意義。