施鵬飛，程悅寧，馮二凱，羅國良，王振軍，易立

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

犬細小病毒?。–anine parvovirus disease）是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染所引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征，主要感染幼犬消化道[1]。美國科學(xué)家Eugstet等1977年首次通過電鏡在患病犬腹瀉物中發(fā)現(xiàn)CPV 顆粒[2]。我國于1982年由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所首次分離出CPV。目前，CPV 在我國東北、華北、華中等地區(qū)廣泛流行[3-4]。CPV 基因組全長約5 300 bp，其中包含2 個開放閱讀框，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP1 和 VP2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1 和 NS2），其中衣殼蛋白VP2 主要影響CPV 的抗原性和宿主范圍[5]。根據(jù) CPV 中 VP2 基因出現(xiàn)的氨基酸替換，分為CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b等基因型。目前，CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，New CPV-2a、New CPV-2b 等新基因型已經(jīng)取代了CPV-2，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[6-8]。2014年，我國分離和鑒定出CPV-2c 病毒，同時發(fā)現(xiàn)該病毒已經(jīng)發(fā)生新的突變，證實了CPV 在我國繼續(xù)發(fā)展[9]。本研究從疑似CPV 感染的犬糞便病料中分離出了CPV，并且對其VP2 序列進行基因推導(dǎo)氨基酸分析，然后進行進化樹分析，旨在豐富新型CPV-2c 變異體的遺傳數(shù)據(jù)，為后續(xù)流行病學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株及細胞株

F81 細胞、犬細小病毒陽性毒株、CPV鑒定引物均保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫實驗室。

1.2 主要試劑與儀器

1.3 病料來源及處理

糞便樣品采集于武漢寵物醫(yī)院的患病犬只，主要臨床癥狀為腹瀉、精神抑郁等。取采集的糞便樣品0.6 g置于1.5 mL EP管中，用PBS按1∶8 的比例進行稀釋混勻，于4 ℃下12 000 r/min 離心3 min；取上清液經(jīng)0.22m濾膜過濾，將處理后的上清液樣本置于 80 ℃下保存?zhèn)溆?。最后取出部分病料溶解液，使用犬瘟熱、犬細小、犬冠狀病毒試紙條進行鑒定。

1.4 病毒分離

1.5 VP2全基因擴增及序列分析

根據(jù)NCBI 網(wǎng)站上已發(fā)表的CPV-2 株（GenBank登錄號為M38245）基因序列，設(shè)計擴增VP2 基因全長的引物，引物序列 VP2-F 為 5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTC-3',VP2-R 引物序列為 5'-AATATAATTTTCTAGGTGCTAG-3'，預(yù)期擴增片段大小為1 750 bp。PCR 條件為 95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共 30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，條帶大小正確后，膠回收連接pMD-18T 載體，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，并送交吉林省庫美生物科技有限公司測序，查找GenBank上已發(fā)表的國內(nèi)外不同基因型的CPV毒株VP2 基因序列，使用MEGA 7.0 軟件進行基因序列及氨基酸序列同源性分析，并繪制進化樹。使用DNAMAN 軟件對序列數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換、分析和比較。進化樹的繪制使用MEGA 7.0 軟件，系統(tǒng)種系發(fā)生樹的構(gòu)建基于Neighbor-joining 程序，驗證采用Bootstrap=500 trails。本研究選取18 株犬細小病毒參考毒株進行了分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離

經(jīng)試紙條鑒定可知，犬細小病毒試紙條檢測結(jié)果為陽性，犬瘟熱和犬冠狀病毒試紙條檢測結(jié)果皆為陰性。2c-I 樣品接種單層培養(yǎng)的F81 細胞，并觀察細胞病變。從圖1 可以看出，2c-I 樣品接毒后48～72 h 細胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落典型的細胞病變，少部分細胞死亡聚集在一起。對照組細胞正常；接毒組細胞連續(xù)盲傳3代，觀察到比較穩(wěn)定的細胞病變現(xiàn)象，證明成功分離到1 株病毒，暫命名為 2c-I。

圖1 接毒后細胞病變Fig.1 Cytopathic effect after intoxication

2.2 VP2基因擴增結(jié)果

用VP2 全基因引物對CPV分離株2c-I的VP2 基因進行PCR 擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在1 750 bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。將 PCR 產(chǎn)物回收并克隆到 pMD18-T 載體（TaKaRa 公司）上，具體步驟均參照試劑盒說明書操作。連接成功后，DH5感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落至試管中培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR 鑒定陽性的，再提取質(zhì)粒進行測序。

2.3 測序結(jié)果分析

將此次分離的1 株犬細小病毒和來自 GenBank數(shù)據(jù)庫中具有地域代表性的10 株 CPV 毒株 VP2 基因所推導(dǎo)的氨基酸序列，采用Clustal W方法進行相互比對，結(jié)果見表1。由表1 可知，本研究中的2c-I 株犬細小病毒流行株屬于CPV-2c亞型（Glu426），2c-I毒株序列呈現(xiàn)獨特的變異：Phe267 至Tyr267 出現(xiàn)變異。VP2 測序結(jié)果已經(jīng)上傳至 NCBI 網(wǎng)站，登錄號為MN686018。

圖2 CPV 分離株VP2 基因擴增結(jié)果Fig.2 The amplification result of VP2 gene from CPV isolated strain

表1 CPV VP2 基因推導(dǎo)氨基酸分析Table 1 The deduced amino acid analysis of VP2 gene of CPV

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA7.0 軟件，對2c-I 株犬細小病毒以及GenBank 數(shù)據(jù)庫中6 株國內(nèi)和15 株國外細小病毒參考毒株的VP2 蛋白氨基酸序列建立了系統(tǒng)進化樹（圖3）。從圖3 可以看出，CPV分離株2c-I與國內(nèi)的LZ-2、HRB-A6、SH1516 等同屬于CPV-2c 亞型。本研究建立的進化樹在選取CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c在內(nèi)的多株細小病毒的基礎(chǔ)上，重點選取6 株國內(nèi)2016—2018年分離的CPV-2c 亞型毒株，并重點分析了CPV-2c 亞型在國內(nèi)的遺傳變異情況。從拓撲分類上，CPV 分離株2c-I 與所選的6 株國內(nèi)毒株同源性都很接近，但又不在同一分支上，結(jié)合其267 位氨基酸突變?yōu)槔野彼幔═yr）情況來看，則暗示著在未來我國境內(nèi)可能出現(xiàn)新的CPV-2c 亞型變異，需要重點監(jiān)測。本研究中的CPV分離株2c-I 與2016年四川分離株CPV-2c 非常接近，同源率為99.8%。根據(jù)進化樹分析可知，目前我國流行的犬細小毒株有 New CPV-2a、New CPV-2b、CPV-2c，其中CPV-2b 和CPV-2c 主要在南方流行，而北方地區(qū)則較少。

圖3 CPV VP2 核苷酸序列遺傳進化樹Fig.3 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

3 討論

犬細小病毒的主要宿主是幼犬，幼犬感染CPV后發(fā)病率高達90%，致死率為35%左右。不同生長期的幼犬感染犬細小病毒后出現(xiàn)不同的臨床癥狀，子宮內(nèi)胎兒或8 周齡以下幼犬感染多表現(xiàn)為心肌炎型，2～6 月齡幼犬感染多表現(xiàn)為腸炎型[10]。目前，世界范圍內(nèi)主要流行的毒株為CPV-2a 與CPV-2b 亞型，但在阿根廷等國家流行毒株則以CPV-2c 亞型為主[11]。據(jù)報道，我國目前流行的毒株主要為 CPV-2a 亞型，其次是CPV-2b亞型，2010年報道我國有CPV-2c亞型的發(fā)生，但未形成大規(guī)模流行[12]。本研究中的犬細小病毒為細小病毒 Type2c 亞型。從分離株（MN686018）VP2 基因推導(dǎo)的氨基酸序列顯示，與我國境內(nèi)流行的CPV-2c型相比，此次分離的細小病毒分離株雖然在分型的關(guān)鍵位點第426 位沒有突變，但在第267 位點出現(xiàn)變異，推測其原因是由于265～267 位點并沒有展示在細小病毒衣殼表面；同時，此次分離的細小病毒分離株與經(jīng)典的CPV-2c型的VP2 氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，2c-I的324位點突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）成為2C亞型中的新突變位點，這將對今后新亞型的出現(xiàn)產(chǎn)生一定的影響。值得注意的是，VP2 蛋白的324 位點氨基酸在蛋白和犬的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Trf）結(jié)合中起重要作用，所以2c-I 毒株中VP2 蛋白的Trf結(jié)合能力是否隨突變而改變需要進一步研究驗證。324 位點的突變（Tyr→Ile）于 2004年在我國首次被發(fā)現(xiàn)，并在日本、韓國等亞洲地區(qū)都檢測到該位點的突變[13]。以上2 個非關(guān)鍵位點的氨基酸變異對病毒的毒力、蛋白的表達以及宿主范圍是否有直接的影響則有待進一步研究。依據(jù)本研究對犬細小病毒VP2 核苷酸序列進化樹分析結(jié)果，此次分離的2c-I細小病毒野毒序列屬于CPV-2c 亞型，與南美洲國家、意大利、美國的2c 亞型是有區(qū)別的，但與四川CPV08比較接近，據(jù)此推測，犬細小病毒的流行具有一定的地域性。由于新的突變位點的發(fā)現(xiàn)，所以應(yīng)該加強對我國CPV-2c 亞型的監(jiān)測，同時也要對可能出現(xiàn)的抗原表位改變和宿主范圍擴增做出相應(yīng)的預(yù)測。

本研究成功分離并鑒定出1 株CPV-2c，并進行了犬細小病毒2c型的分子流行病學(xué)調(diào)查，這不僅可為寵物疾病的防控提供有力依據(jù)，而且可以為特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖行業(yè)和野生動物保護奠定理論基礎(chǔ)。