李炎桂，臧埔，曲正義，王玉方，王凱，李滋睿，郜玉鋼，徐超※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.遼寧千山旅游集團(tuán)有限公司，遼寧 鞍山 114001）

熊膽為熊科動(dòng)物黑熊的膽汁干燥品，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴動(dòng)物藥材，有1 300 多年的醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用歷史，歷代中醫(yī)古籍中含熊膽的方劑多達(dá)396 首[1]。熊膽初次記載于《新修本草》，氣味苦寒、無(wú)毒，入肝膽心經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，熊膽具有保肝利膽、抗腫瘤和抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用[2-4]。但是熊膽的資源極其短缺，其研究和應(yīng)用受到嚴(yán)重障礙。因此，尋找熊膽替代品中藥材新資源，開展其臨床前研究具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)意義。由于熊膽粉來(lái)源的限制，因此尋找替代品首先要考慮其來(lái)源是否廣泛和充足。貉是皮毛動(dòng)物養(yǎng)殖品種中最容易飼養(yǎng)的品種。我國(guó)2017年產(chǎn)貉皮1 240萬(wàn)張[5]，打皮后的尸體多被整只廢棄，就是說(shuō)每年都有1 240萬(wàn)個(gè)貉膽膽囊被丟棄。貉和黑熊都是雜食性動(dòng)物[6-7]，二者的親緣關(guān)系較近、食性接近，能否將貉膽變廢為寶，代替熊膽，有待于進(jìn)一步研究。本文通過(guò)來(lái)源鑒定、性狀鑒定[8]、顯微鑒定[9-10]、理化鑒定[8,11-12]等方法對(duì)貉膽進(jìn)行鑒別，比較貉膽和熊膽之間的異同點(diǎn)；通過(guò)對(duì)比分析貉膽粉和熊膽粉的異同，以期為貉膽質(zhì)量制定標(biāo)準(zhǔn)，為貉膽的藥用提供理論依據(jù)，也為貉膽粉替代熊膽粉是否可行提供理論依據(jù)和參考。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 樣品來(lái)源

貉膽取自犬科動(dòng)物貉（Nyctereutes procyonoids）的新鮮膽囊、膽汁及其干燥品，貉選自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。熊膽購(gòu)于四川養(yǎng)麝所，為熊科動(dòng)物黑熊（Selenarctors thibetanus）的引流膽汁干燥品。

1.2 試驗(yàn)儀器

DZF-6050 真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；顯微鏡及顯微成像系統(tǒng)（奧林巴斯株式會(huì)社），載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；XP504 梅特勒精密天平〔梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司〕；ZF-20D暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；HI-9124 便攜式防水型酸度測(cè)量?jī)x〔哈納沃德儀器（北京）有限公司〕；UP400S立式超聲波處理器（上海桂寧實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；S22H 超聲波清洗機(jī)（廈門致微儀器有限公司）；GZX-9146MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；層析硅膠（G）-薄板（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.3 試驗(yàn)材料與試劑

膽酸標(biāo)準(zhǔn)品（AC，E612BA0018）、去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品（DCA，DA24BA0024，含量為99%）、熊去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品（UDCA，BB07BA0324）、鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品（CDCA，E222BA0006）〔生物工程（上海）股份有限公司〕；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、氫氧化鈉、乙醇、硫酸、冰醋酸、氯仿、甲苯（分析純，北京化工廠）；乙酸乙酯（分析純，太倉(cāng)滬試試劑有限公司）；異辛烷（分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司）；無(wú)水乙醚（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；正丁醇（分析純，天津新通精細(xì)化工有限公司）；丙酮（分析純，長(zhǎng)春市化學(xué)試劑廠）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 來(lái)源鑒定

分別對(duì)2 種動(dòng)物膽基源進(jìn)行考察，確定源頭。

2.2 性狀鑒定

分別對(duì)兩種動(dòng)物膽進(jìn)行感官鑒定，通過(guò)眼看、口嘗、鼻聞、水試、火試等方法，比較貉膽和熊膽的差異。

2.3 顯微鑒定

分別取少量貉膽粉末及熊膽粉末，放置在載玻片中央，滴加2～3 滴甲苯，使用解剖針攪拌均勻，自然揮干。

2.4 理化鑒定

2.4.1 熒光反應(yīng) 分別取貉膽粉末和熊膽粉末少許，將其置于載玻片上，移載玻片至暗箱式紫外分析儀中，于紫外光362 nm 下觀察。

2.4.2 薄層層析

標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液制備 分別精準(zhǔn)稱取膽酸、去氧膽酸、熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品3 mg，移至10 mL 離心管，分別添加6 mL 乙醇，制成濃度為0.5 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

分別精密稱取貉膽粉和熊膽粉各50 mg，分別置于具塞試管中，加入10%NaOH 溶液5 mL，在冰水中進(jìn)行超聲溶解。將溶解的樣品，放入干燥箱120 ℃，加熱水解2h 后，取出放冷，滴加HCl 調(diào)節(jié)pH 值至2～3。所得樣品溶液分別用醋酸乙酯振搖萃取2次，每次10mL，分別合并上層醋酸乙酯液。置水浴鍋中55 ℃水浴揮發(fā)至干后，添加少量乙醇至蒸發(fā)皿中，溶解殘?jiān)?，移? mL容量瓶，添加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即獲得貉膽和熊膽供試品溶液。

展開劑的配制 按異辛烷∶無(wú)水乙醚∶冰醋酸∶正丁醇∶水=10∶5∶5∶3∶1 比例配置展開劑，混勻后，置于分液漏斗中，靜置60 min后，取上層溶液備用，作為展開劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

數(shù)據(jù)讀取與統(tǒng)計(jì) 使用毛細(xì)管吸取上述樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，分別點(diǎn)在同一硅膠（G）板上，揮干。重復(fù)1 次即可。以現(xiàn)配的展開劑展開，展開劑延伸至薄層板上端1 cm 處時(shí)取出，晾干。噴灑10%硫酸溶液，于105 ℃烘約1 min，顯色清晰即可取出，分別在自然光和紫外光365 nm 條件下觀察。記錄原點(diǎn)至各組分斑點(diǎn)中心的距離和原點(diǎn)至溶劑前沿的距離，計(jì)算比移值Rf。

3 結(jié)果與分析

3.1 來(lái)源鑒定結(jié)果與分析

貉膽膽囊和膽汁來(lái)源動(dòng)物經(jīng)鑒定為犬科動(dòng)物貉。

3.2 性狀鑒定結(jié)果與分析

貉膽膽囊干燥后呈扁卵形，上部狹細(xì)，下部膨大呈囊狀，中部半透明，呈黃棕色，下部顏色逐漸加深，黃棕色至黑色不透明，有光澤，褶皺，囊皮較薄、質(zhì)堅(jiān)。干燥膽囊長(zhǎng)2.9～5.5 cm，寬1.3～2.1 cm，重0.9～2.3 g，單個(gè)膽含膽汁3～5 mL，個(gè)別可達(dá)10 mL。如圖1A。

貉膽汁呈棕黃色，干燥后的貉膽片脆，有光澤，半透明，如圖1B；貉膽片斷面光滑，有光澤；粉末黃色或黃綠色，味苦回甜，有明顯腥氣，如圖2A；火試發(fā)現(xiàn)貉膽片起油泡較小，有腥氣；水試發(fā)現(xiàn)貉膽片在水面緩慢移動(dòng)，在水表面和器底均有明顯黃綠色擴(kuò)散跡象，溶解的貉膽呈黃色或黃綠色線狀下沉；貉膽片在水中溶解速度比熊膽片快。熊膽片較脆，半透明，粉末黃棕色，有清香味，腥氣較淡不明顯，熊膽斷面粗糙，光澤較貉膽弱，如圖2B；熊膽味極苦回甜；火試熊膽片有明顯油泡，有燒焦頭發(fā)的味道；水試發(fā)現(xiàn)熊膽片在水面移動(dòng)緩慢，在水面和器底均無(wú)明顯擴(kuò)散跡象，溶解的熊膽呈黃色線狀下沉。

圖1 貉膽干燥品Fig.1 Dried bile of raccoon dog

圖2 膽粉Fig.2 Bile powder

3.3 顯微鑒定結(jié)果與分析

在顯微鏡下觀察，貉膽粉末有結(jié)晶存在，多呈無(wú)色或黃色，透明或半透明晶體，棱角分明，有明顯條紋，少數(shù)為黑色不透明，粉末聚集處有團(tuán)塊，可能是貉膽粉末分散不徹底導(dǎo)致的，稀釋后，團(tuán)塊減少，如圖3A。熊膽粉末多呈黃棕色半透明晶體或黑色不透明，有時(shí)可見條紋，不清晰，如圖3B。

3.4 理化鑒定結(jié)果與分析

3.4.1 熒光反應(yīng) 發(fā)現(xiàn)貉膽粉末在紫外光下有明亮黃綠色熒光，熊膽粉末在紫外光下有黃白色熒光，如圖4所示。

圖3 粉末顯微鑒定Fig.3 Powder microscopic Identification

3.4.2 薄層層析 展開劑展開并顯色后，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品膽酸（CA）、去氧膽酸（DCA）、熊去氧膽酸（UDCA）、鵝去氧膽酸（CDCA）對(duì)應(yīng)的比移值Rf，分別是Rf1=0.24，Rf2=0.47，Rf3=0.36，Rf4=0.41。

圖4 紫外光條件下的膽粉Fig.4 Bile powder under ultraviolet light

如圖5，自然光條件下可觀察到，貉膽樣品（欄5）中分別對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品1、2、4 的位置有物質(zhì)存在，明顯含有大量的物質(zhì)1，即膽酸，貉膽樣品中對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品2 和4 位置的物質(zhì)相連，未分開，但是自然光下貉膽樣品對(duì)應(yīng)位置上下顏色差異明顯，上部分顏色同標(biāo)準(zhǔn)品2 接近，下部分顏色同4 接近，可用確定貉膽粉應(yīng)含有2 和4，即去氧膽酸和鵝去氧膽酸。熊膽樣品（欄6）中分別對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品1、3、4 的位置有物質(zhì)存在，其中對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品1 的物質(zhì)已分離，可以確定含有少量的膽酸，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品3 或者4 的位置未分離，且顏色相似，即可能代表熊去氧膽酸，也可能代表鵝去氧膽酸。紫外光燈365nm條件下，可以發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品2 對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品1 的位置有相應(yīng)微弱熒光，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)品不純，含有少量的膽酸。

上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明貉膽和熊膽均存在相同物質(zhì)膽酸，可能含有相同物質(zhì)鵝去氧膽酸。

圖5 TLC 圖譜Fig.5 TLC graph

4 討論與結(jié)論

現(xiàn)今，未見關(guān)于貉膽的生藥學(xué)鑒定研究，也未見貉膽粉替代熊膽粉相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)傳統(tǒng)鑒定方法明確貉膽粉和熊膽粉的異同。為以后貉膽粉應(yīng)用確立標(biāo)準(zhǔn)，為替代熊膽粉研究提供理論基礎(chǔ)。

貉膽粉來(lái)源于犬科動(dòng)物貉的干燥膽汁，極容易獲取。貉膽干燥膽囊上部狹細(xì)，下部膨大呈囊狀，黃棕色至黑色，囊皮較薄褶皺，質(zhì)堅(jiān)；貉膽汁黑綠色或黃綠色，有泡沫；貉膽膽仁脆，半透明，表面有光澤，斷面光滑，光澤明顯；粉末黃色、黃綠色，有腥氣。顯微鏡下貉膽粉末存在結(jié)晶，無(wú)色至黃色，半透明或透明，有明顯棱角，條紋明顯，紫外光下，貉膽粉末有明亮黃綠色熒光。熊膽膽仁較脆，半透明，斷面較粗糙，光澤較弱，粉末黃棕色，腥氣不明顯，較淡。顯微鏡下熊膽粉末多呈黃棕色半透明或黑色不透明晶體，有時(shí)可見條紋，不清晰；紫外光下，熊膽粉末有黃白色熒光。此外，貉膽片較熊膽片更容易溶于水，貉膽中水溶性成分含量應(yīng)較熊膽中多。通過(guò)TLC 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)貉膽粉含有CA，可能含有DCA 和CDCA?？梢源_定貉膽粉含有熊膽粉中功效性成分CA，具體所含膽汁酸種類有待進(jìn)一步研究。功效上是否具有一定相似性，是否能替代熊膽粉入藥，有待進(jìn)一步研究。