謝騰飛，張華通，何旭君，賴增哲，李慧釵，趙靜

（廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬類植物，種類繁多，廣泛分布在亞洲、歐洲、澳洲等地區(qū)[1]，在我國主要分布于廣西、廣東、福建、四川、浙江、云南和貴州等西南和華南地區(qū)。野生鐵皮石斛為附生性多年生蘭科植物，主要生長在溫度濕潤、半陰濕的巖石上或者疏林中的樹干上，對生態(tài)環(huán)境要求苛刻，生長溫度為20～26℃，空氣濕度要求需要達到70%～85%。據(jù)《中國藥典》版記載，鐵皮石斛歸胃、腎經(jīng)；益胃生津，滋陰清熱。鐵皮石斛用于治療不明發(fā)熱、口干舌燥、目暗不明、陰虛火旺、陰傷津虧、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、筋骨無力等病癥，是傳統(tǒng)的保健中藥材之一[2-3]。

由于野生鐵皮石斛資源較為稀缺，加上人們對野生資源的過度采挖，從而導(dǎo)致有些品種已瀕臨滅絕。[4-6]目前，鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)都注重于種植技術(shù)的研發(fā)和規(guī)模的擴大，而組織培養(yǎng)工廠化育苗是一種人工栽培非常重要的育苗方式[7]。研究結(jié)果表明，種齡、滅菌方式、外植體選擇、接種密度、繼代周期、培養(yǎng)基配方、移苗方式等諸多關(guān)鍵技術(shù)對鐵皮石斛組織培養(yǎng)快繁效果影響很大[8-9]。據(jù)宋爽等[10]報道，不同的栽培技術(shù)對鐵皮石斛的質(zhì)量具有明顯的影響，其中以野生資源的鐵皮石斛質(zhì)量最佳。因此，大力開展原生態(tài)栽培技術(shù)研究與推廣是提高鐵皮石斛質(zhì)量的一種有效途徑。

本研究基于鐵皮石斛的組織培養(yǎng)工廠化育苗關(guān)鍵技術(shù)研究，對工廠化生產(chǎn)育苗工藝流程進行優(yōu)化，探索試管苗移植栽培管理技術(shù)，以求建立適用于生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛種苗快速繁育體系，并通過原生態(tài)栽培種植，探索仿野生鐵皮石斛適宜生長條件，為提高鐵皮石斛仿野生種植效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用鐵皮石斛由廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)綜合實訓(xùn)基地提供的組織培養(yǎng)苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛無菌播種工廠化生產(chǎn)育苗簡易工藝流程 外植體主要采用優(yōu)質(zhì)種果，無菌條件下取種子進行培養(yǎng)；采用MS 培養(yǎng)基，附加細胞生長素NAA0.1～0.6mg/L 和馬鈴薯 20～50g/L 及蘋果泥 20～50g/L。并在無菌條件下，進行鐵皮石斛的無菌播種及組織培養(yǎng)繼代增殖。無菌播種發(fā)芽培養(yǎng)及初代培養(yǎng)其培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時間為10～12h，強度控制在2000～3 000lx。經(jīng)90 d 左右培養(yǎng)即可萌發(fā)出大量的小苗。以后均采用同一培養(yǎng)基，每90 d 轉(zhuǎn)接1 次，連續(xù)轉(zhuǎn)接2 次，小苗嫩莖長到3 cm 左右，根系完整即可進行煉苗移栽。

1.2.2 試管生根苗處理 經(jīng)培養(yǎng)室壯苗生根培養(yǎng)約30 d 的小苗置于塑料大棚進行煉苗，經(jīng)生根煉苗60 d 后，選擇苗高3～5cm、生長正常、長勢較好的試管生根苗。用鑷子輕輕地夾出煉好的試管生根苗，置于裝有干凈自來水的塑料盆里，清洗2 遍，以洗凈培養(yǎng)基。并用0.01%的高錳酸鉀溶液浸泡5min，自來水清洗，甲基托布津水溶液浸泡2 min。

1.2.3 試管生根苗種植及栽培管理 試管生根苗在清洗消毒后，栽植于遮陽網(wǎng)墊底，長 寬 高為50 40 7cm，排水良好的塑料篩中。種植時，用手輕捏，使試管生根苗的根部與基質(zhì)充分接觸。種植后，放在有遮陰的標準塑料大棚進行栽培管理。最初2 d 內(nèi)不用澆水，第3 天開始淋第1 次促根殺菌營養(yǎng)液（翠筠B1 營養(yǎng)劑+多菌靈+磷酸二氫鉀溶液），以后每10 d噴施該溶液1 次并保持種植基質(zhì)經(jīng)常處于濕潤狀態(tài)。與此同時，需要防治病蟲害。

1.2.4 不同方法處理鐵皮石斛試管苗移植對比試驗本試驗對試管苗消毒后進行2 個對比處理，分別為消毒后晾苗2 d 后種植（水珠干透、根系變白）和洗苗消毒后直接種植，并記錄移植60 d 后的生長情況。

1.2.5 移栽培養(yǎng)基質(zhì)篩選試驗 單一移栽基質(zhì)篩選：本試驗采用松樹皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5個處理，對移植60 d 后試管生根苗的生長情況進行觀察分析。

混合移栽基質(zhì)篩選：本試驗移栽基質(zhì)設(shè)計為J1（木屑∶松樹皮=3∶2）、J2（木屑∶陶粒=3∶2)、J3（苔蘚∶小石粒=3∶2）、J4（泥炭土∶陶粒 3∶2）、J5（紅火山巖∶小石粒3∶2）、J6（松樹皮∶紅火山巖3∶2）6 個處理，記錄移植60 d 后的生長情況。

1.2.6 不同季節(jié)栽培對比試驗 本試驗設(shè)計為春（3～5月）、夏（6～8 月）、秋（9～11 月）、冬（12～2 月）4 個季節(jié)對馴化苗移栽成活及生長情況的影響。栽培基質(zhì)為J6（松樹皮∶紅火山巖3∶2），采用3 寸盆種植。移栽后，記錄栽培苗的生長情況。

1.2.7 鐵皮石斛的原生態(tài)栽培方式對比試驗 本試驗采用枯立木附生種植、吊籃種植和活樹體附生種植3個對比處理。枯立木附生種植選擇直徑為15 cm 左右的原木，置于光線充足、遮陰樹下光照通透的位置，在原木皮層按株距20 cm 的密度種植，用少量苔蘚包裹后貼于樹皮上，再用麻繩綁緊固定，根系要求自然伸展；吊籃掛在樹枝上，保持吊籃處透光較足，且避免強光直接照射；活樹體附生種植選擇附生樹中光線充足、通透的枝干部位，按株距20 cm的密度種植，用少量苔蘚包裹后貼于樹皮上，再用麻繩綁緊固定，根系要求自然伸展；種苗規(guī)格為鐵皮石斛組織培養(yǎng)馴化苗達到主莖長6 cm 以上，輔莖長4 cm 以上；主莖粗0.4 cm 以上，輔莖粗0.1 cm以上。記錄附生及種植后的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 工廠化生產(chǎn)育苗簡易工藝流程獲得鐵皮石斛組培苗

本實驗室通過對種子消毒，嚴謹?shù)臒o菌操作及良好的誘導(dǎo)、壯苗培養(yǎng)基等技術(shù)的研究，探索出了鐵皮石斛無菌播種工廠化生產(chǎn)育苗簡易工藝流程：鐵皮石斛莢果外植體消毒→種子無菌發(fā)芽培養(yǎng)→無菌小苗轉(zhuǎn)接增殖培養(yǎng)→塑料大棚生根煉苗→試管生根苗種植。整個過程只采用一種培養(yǎng)基為MS+NAA（0.1～0.6 mg/L）+馬鈴薯泥（20～50g/L）+蘋果泥（20～50g/L）+蔗糖（30g/L）。利用這一技術(shù)培育出大量的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗，以滿足后續(xù)試驗及生產(chǎn)的需求（圖1）。

圖1 鐵皮石斛工廠化組培苗Fig.1 Tissue culture seedlings of D.otticinale

2.2 不同方法處理鐵皮石斛試管苗移植結(jié)果

對比試管苗消毒后晾苗2 d 后種植（使附苗上無水珠、根系變白）和洗苗消毒后直接種植〔移栽基質(zhì)均采用J1（木屑∶松樹皮=3∶2）〕，移植于標準塑料大棚進行栽培管理，期間對移植后試管苗根、苗的生長狀況及移植成活率進行觀察記錄，并在60 d 后統(tǒng)計其移栽成活率。從表1 中可得出，鐵皮石斛試管苗經(jīng)晾苗處理后，平均移栽成活率達到95.0%，明顯優(yōu)于試管苗直接種植的72%成活率；根和苗生長比較結(jié)果，試管苗經(jīng)晾苗處理后8 d 左右可以長出新根，而直接種植的試管苗要在14 d 后才能長新根，新根長度較短，較為嚴重的是，有些根出現(xiàn)腐爛情況；經(jīng)晾苗處理后的試管苗在大概10 d能長出新葉，而直接種植的試管苗長勢較差，并部分苗出現(xiàn)腐爛。因此，可以得出晾苗處理有利于鐵皮石斛試管苗移植生長。

2.3 移栽培養(yǎng)基質(zhì)篩選試驗結(jié)果

為了解單一移栽基質(zhì)在鐵皮石斛試管苗移植培養(yǎng)中的效果，通過采用松樹皮、木屑、苔蘚、泥炭土、紅火山巖等5 種基質(zhì)進行栽培，期間對移栽后試管苗的生長狀況及移植成活率進行觀察記錄，并統(tǒng)計其移栽成活率，結(jié)果（見表2）顯示，單一基質(zhì)的培養(yǎng)中，松樹皮基質(zhì)培養(yǎng)的效果最好，成活率達到89.5%，而在泥炭土中，培養(yǎng)成活率只有32.1%；試管苗在松樹皮、木屑中生根較為理想，在苔蘚、泥炭土及紅火山巖基質(zhì)中，根長勢很差，根細且短，還出現(xiàn)部分腐爛現(xiàn)象。

表1 鐵皮石斛試管苗移植中不同處理方法的對比試驗Table 1 Different treatment methods in D.otticinaletube seedling transplantation

在采用不同混合基質(zhì)培養(yǎng)鐵皮石斛試管苗移栽的結(jié)果顯示，在J1、J2 和J6 這三種混合基質(zhì)中，成活率達到90%以上，在J4 和J5 中的成活率較低，分別為68.0%、76.0%。在成活率較高的三種混合基質(zhì)中，我們也發(fā)現(xiàn)在一個星期內(nèi)可以長出新根，根系發(fā)達，根長且較粗壯。而J4 和J5 基質(zhì)根長勢差，很細弱。苗的新芽萌發(fā)及葉片增加的速度在J1、J2 和J6 混合基質(zhì)中明顯優(yōu)于成活率較低的混合基質(zhì)。本試驗結(jié)果表明，以J6 為基質(zhì)栽培效果最好，而且也符合經(jīng)濟原則（見表3）。

表2 鐵皮石斛試管苗移植中不同單一移栽基質(zhì)中的種植對比試驗Table 2 Different single transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

表3 鐵皮石斛試管苗移植中不同混合移栽基質(zhì)中的種植對比試驗Table 3 Different mixed transplanting substrates in D .otticinaletube seedling transplantation

2.4 鐵皮石斛不同季節(jié)栽培對比試驗結(jié)果

為了解鐵皮石斛試管苗在不同季節(jié)移植栽培的效果，我們進行了春夏秋冬的移植對比，結(jié)果（見表4）顯示，春季和秋季的栽培效果最好，成活率高達92.0%和96.0%，而夏季和冬季栽培效果不理想。雖然秋季成活率較高，但試驗發(fā)現(xiàn)，其根系發(fā)育速度明顯落后于春季（長根時間分別為20 d 和58 d）。在冬季，鐵皮石斛移栽成活率僅為26.5%，未見新根有明顯變化。苗的生長情況也存在相同趨勢，春天移栽的試管苗生長快。其次為秋季、夏季。而冬季苗未見長高，只是莖稍有長粗。試驗結(jié)果表明春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳選擇，秋冬季時生長緩慢，尤其是冬季，不適宜栽培種植鐵皮石斛。

2.5 鐵皮石斛的原生態(tài)栽培方式對比試驗結(jié)果

由于鐵皮石斛主要在野外附生性生長，為保證鐵皮石斛的價值，需要采用原生態(tài)的栽培方式（圖2）。本試驗中，我們采用了枯立木附生種植、吊籃種植和活樹體附生種植這三種原生態(tài)的栽培方式。結(jié)果顯示吊籃種植的成活率最高，高達95.0%，其次為活樹體附生種植（89.5%），枯立木附生種植（85.5%）。而且吊籃種植的根系生長也是最快的，但活樹體附生種植的根系最為發(fā)達，可以和活體樹皮相互緊密纏繞。苗的生長速度差別不大。本試驗表明，在原生態(tài)栽培過程中，吊籃種植的生長情況最好，但也發(fā)現(xiàn)活樹體附生種植鐵皮石斛的效果也不錯（表5）。

圖2 鐵皮石斛的原生態(tài)栽培Fig.2 Ecological cultivation of D.otticinale

3 討論與結(jié)論

鐵皮石斛為多年生附生蘭的草本植物，在野外狀態(tài)下，鐵皮石斛種子繁殖力低，在發(fā)芽率、萌發(fā)、生長，及開花的鐵皮石斛結(jié)實率也很低[11]，這些原因?qū)е缕溆行陨车淖匀环敝陈实?。而需求量的快速增加，加急了鐵皮石斛的稀缺。因此，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，利用組織培養(yǎng)的種苗，并采用人工大規(guī)模種植的鐵皮石斛是市場上產(chǎn)品的主要來源[12]。本實訓(xùn)中心主要以組織培養(yǎng)技術(shù)研究為主，培養(yǎng)了菊花、金叉石斛和迷迭香等多種經(jīng)濟植物[13-14]，有一套非常完善的組織培養(yǎng)及工廠化育苗的技術(shù)。通過不斷摸索，已經(jīng)建立了一套成熟的鐵皮石斛組培方法，并能進行工廠化生產(chǎn)育苗，該技術(shù)成活率高、可產(chǎn)出高質(zhì)量苗。在此期間，我們發(fā)現(xiàn)試管生根苗移栽過程處理是鐵皮石斛組培成功運用于生產(chǎn)的重要步驟，因此對此進行了詳細的研究。與此同時，本研究還嘗試了不同的原生態(tài)種植方法，以求獲得高質(zhì)量的鐵皮石斛鮮條，滿足市場需求。

獲得能夠移栽到田間的鐵皮石斛苗是繁育技術(shù)的核心問題，因此需要保證移栽的成活率。楊大贊報道認為在試管苗清洗時，根莖都很脆弱，易受到真菌感染，最好進行根系的脫水處理[15]。本試驗結(jié)果證明了這個觀點，通過比較晾苗2 d后種植和直接種植處理，晾苗后成活率明顯較高；根的生長良好，苗長葉及發(fā)育也快，而直接種植的試管苗的根會出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，這應(yīng)該是跟真菌感染有關(guān)，而芽的長勢也比較差。本研究表明采用洗苗消毒后晾苗2 d的處理方法，有助于鐵皮石斛試管苗的移植生長。

培養(yǎng)基質(zhì)對植物的影響是顯而易見的，在選擇植物培養(yǎng)基質(zhì)時，需要結(jié)合實際生長情況，從而保證成活率和生長態(tài)勢。一般認為，不同種類的微生物會附生在野生的鐵皮石斛根系中，從而分解土壤中的有機物。因此，人工基質(zhì)很難達到自然的效果。因此，會選擇碎石子、泥炭土、火山巖和木屑等作為培養(yǎng)基質(zhì)。有研究報道木屑、泥炭土的保水能力較好質(zhì)，椰子絲、松樹皮可以增加基質(zhì)的透氣性，不同基質(zhì)的混合使用不僅可以滿足基質(zhì)保水需求，還可以改善基質(zhì)的透氣[16]。本試驗顯示單一基質(zhì)最高的成活率僅為 89.5%（松樹皮），大部分單一基質(zhì)中的成活率都較低。松樹皮+紅火山巖（3∶2）為混合基質(zhì)栽培時，成活率最高，根的長勢也是最好。在單一基質(zhì)如泥炭土、紅火山巖中，鐵皮石斛根系還發(fā)生了部分腐爛現(xiàn)象。由此，本研究得出的試管生根苗最佳移栽基質(zhì)為木屑+松樹皮，既有較好的保水能力，還能透氣。

由于光照、溫度和水分對鐵皮石斛的生長有重要作用[17-18]，因此，不同栽植季節(jié)對鐵皮石斛生長的影響也是顯而易見的。通過對福建地區(qū)鐵皮石斛種植的季節(jié)影響進行探索，結(jié)果顯示，鐵皮石斛在春、秋、夏季其單叢鮮重、萌芽數(shù)生長有極顯著差異，以春季栽植為優(yōu)，秋季則次之，秋季栽植則應(yīng)做好抗寒防凍工作[19]。在廣東，我們也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢。在夏季，可能由于溫度太高，鐵皮石斛的成活率和長勢都不好。而冬季是鐵皮石斛營養(yǎng)積累的時期，加之溫度過低，其栽培成活率非常低。本研究得出春季是鐵皮石斛栽培種植的最佳季節(jié)。

環(huán)境因子會使植物表型及生理生態(tài)特性產(chǎn)生不同的變化[20]。鐵皮石斛的組培苗、大棚栽培植株及野生植株營養(yǎng)成分比較發(fā)現(xiàn)，野生栽培鐵皮石斛的多糖含量高于人工栽培的鐵皮石斛，還有人工栽培鐵皮石斛所含微量元素低于野生栽培[21]。而且，采用樹皮等仿生基質(zhì)有助于提高鐵皮石斛的蛋白質(zhì)和多糖等營養(yǎng)物質(zhì)的積累。因此，原生態(tài)種植是鐵皮石斛栽培的重要方式。目前報道的原生態(tài)種植主要采用活樹體附生種植。崔之益等[22]分別采用降香黃檀、馬占相思、龍眼、楊桃等進行鐵皮石斛附生種植，結(jié)果顯示，其生長的莖粗細、長短及生物產(chǎn)量與其植株高度呈顯著性相關(guān)?？萘⒛靖缴N植和吊籃種植的研究較少，主要適用于樹木不多的林地種植。本研究發(fā)現(xiàn)吊籃種植中鐵皮石斛的成活率及根苗長勢最好，這可能與而其遠離地面種植，生長空間大，光環(huán)境和通風(fēng)環(huán)境均優(yōu)于其它原生態(tài)栽培方式，能有效促進鐵皮石斛生長。本試驗結(jié)果說明，除活樹體附生種植外，吊籃種植也是一種比較好的種植栽培模式選擇。枯立木附生種植雖比活立木種植、吊籃種植表現(xiàn)稍差，但采用活立木種植和吊籃種植結(jié)合進行，可以充分利用空間，大大提高了單位面積鐵皮石斛的鮮條產(chǎn)量。

試管苗的移栽是鐵皮石斛組織培養(yǎng)工廠化育苗中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于試管苗始終處于一個相對穩(wěn)定的無菌環(huán)境下，對外界自然環(huán)境的適應(yīng)性其是否移植成功決定影響試管苗移栽成敗因素包括馴化苗的選擇、栽培基質(zhì)的選擇和溫度濕度光照等。本研究以組培生根的鐵皮石斛試管苗為材料，通過試驗，證明了鐵皮石斛試管苗移植過程中，通過晾曬2 d 處理有助于提高移植是成活率；最優(yōu)的基質(zhì)為松樹皮+紅火山巖（3∶2）混合，是生產(chǎn)容易推廣的材料，具有潛在的經(jīng)濟效益。栽培試驗結(jié)果顯示，種植栽培的季節(jié)應(yīng)當以春季為優(yōu)，氣溫適宜，空氣濕度大。秋季應(yīng)做好抗寒防凍工作。夏季和冬季由于氣候，不利于鐵皮石斛生長。原生態(tài)栽培對比證明吊籃種植是除活樹體附生種植外的理想方式。這為尋找鐵皮石斛組培工廠化育苗尋找更為高效的移栽方法，及大面積推廣原生態(tài)鐵皮石斛栽培提供技術(shù)參考。