白秋芳，鄒 明，張繼志，劉 卓，樸豐源

(1. 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116001；2. 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 大連 116001；3. 錦州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，遼寧 錦州 121001；4. 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116001)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種來源于骨髓間充質(zhì)的多能干細(xì)胞，在特定條件下可分化為多種細(xì)胞系，因此可以成為替代體內(nèi)受損組織的細(xì)胞來源[1-3]。據(jù)報(bào)道，BMSCs移植可用于治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變[4]，并具有促進(jìn)受損脊髓功能恢復(fù)[5]，改善梗死后心功能[6]以及修復(fù)腎臟損傷[7]等功效。但在實(shí)踐應(yīng)用中，BMSCs在機(jī)體內(nèi)的嫁接效率始終不高，只有小部分移植的BMSCs能夠在受損的宿主組織中存活[8]，大部分干細(xì)胞在移植后第1周內(nèi)就會(huì)死亡[9-10]，這嚴(yán)重影響到了干細(xì)胞治療的作用時(shí)間，并極大地限制了BMSCs移植療法的應(yīng)用和推廣[11]。研究提示，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致移植BMSCs死亡的主要原因[12]。因此，找尋提高BMSCs存活率和/或減少凋亡的方法可能會(huì)大大提高BMSCs移植的療效。

研究發(fā)現(xiàn)，通過給予保護(hù)劑可增強(qiáng)干細(xì)胞在宿主環(huán)境中的抵抗力，提高移植細(xì)胞的存活[9,13]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)屬于多肽類生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞存活和增殖中起著重要作用[14-16]。體外研究表明，IGF-1可抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡[17]。Yan等[18]報(bào)道，IGF-1可保護(hù)來源于大鼠坐骨神經(jīng)組織的雪旺細(xì)胞，避免高糖所致的細(xì)胞凋亡。Liao等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1可保護(hù)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受胺碘酮誘導(dǎo)的凋亡。Gooch等[20]研究表明，IGF-1可保護(hù)MCF-7細(xì)胞免受化療藥物阿霉素的促凋亡影響。以上這些研究表明，IGF-1具有抗細(xì)胞凋亡的作用。由此，IGF-1對(duì)BMSCs凋亡的拮抗作用及其相關(guān)機(jī)制，引發(fā)了我們的關(guān)注。

本研究應(yīng)用2,5-己二酮(HD)作凋亡誘導(dǎo)劑，構(gòu)建BMSCs凋亡體外模型；應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)BMSCs的凋亡；應(yīng)用試劑盒檢測(cè)caspase-3活性；應(yīng)用western blot技術(shù)檢測(cè)了Akt和Bad的表達(dá)及其磷酸化水平；擬探討IGF-1對(duì)HD誘導(dǎo)所致的BMSCs凋亡的拮抗作用及相關(guān)機(jī)制，為篩選增強(qiáng)移植BMSCs在宿主體內(nèi)存活的有效保護(hù)劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

藥物及試劑：HD(Sigma，美國(guó)，純度≥ 99%)；p-Akt/Akt抗體(cell signaling，美國(guó))；p-Bad/Bad抗體(cell signaling，美國(guó))；β-actin抗體(中杉金橋)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(KeyGEN BioTECH，中國(guó))；caspase-3活性試劑盒(Beyotime，中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)：選取出生2～3周的健康SD大鼠幼鼠，脫臼處死。無菌條件下取出幼鼠的股骨和脛骨，用無菌PBS緩沖液沖洗并收集骨髓，經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過濾后，1000 r/min離心3 min，棄上清。在低糖BMSCs培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)15 h后，吸出培養(yǎng)基，PASA潤(rùn)洗3次后，更換新鮮培養(yǎng)基。隔天重復(fù)上述潤(rùn)洗操作1次。1周后，可見貼壁的單層成纖維細(xì)胞樣BMSCs，記為原代(P0)。當(dāng)P0代細(xì)胞融合達(dá)60%左右時(shí)，以1∶3的比例傳代，記為一代細(xì)胞(P1)。繼續(xù)培養(yǎng)2～3天后，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%左右時(shí)，重復(fù)上述傳代操作，至P5代。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記CD44、CD29，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.2.2 細(xì)胞處理：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P5代BMSCs，隨機(jī)分為對(duì)照組，染毒組以及干預(yù)組。其中，對(duì)照組細(xì)胞用生理鹽水(Control組)或50 ng/L IGF-1(IGF組)處理24 h；染毒組細(xì)胞需在40 mmol/L HD中暴露24 h，建立體外凋亡模型(HD組)；干預(yù)組細(xì)胞則用40 mmol/L HD和不同濃度(50，75和100 ng/L)IGF-1共同處理24 h。按IGF-1的劑量不同，干預(yù)組可分為：50 IGF+HD組，75 IGF+HD組以及100 IGF+HD組。

1.2.3 TUNEL檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，先用多聚甲醛將BMSCs在室溫下固定20 min。然后，用PBS沖洗3次，并在1% Triton X-100中孵育3～5 min。接下來，將TUNEL反應(yīng)液加入培養(yǎng)皿中，并在37 ℃，濕盒中避光孵育1 h。待反應(yīng)結(jié)束后，用DAPI處理5 min。在免疫熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。AI = (TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量) × 100%。

1.2.4 Caspase-3活性檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞，并用PBS清洗1次。然后將細(xì)胞在冰上裂解15 min。收集上清液4 ℃，16000 g離心10 min。在96孔板的每個(gè)孔中加入50 μL反應(yīng)液，40 μL細(xì)胞蛋白裂解液以及10 μL caspase-3 反應(yīng)底物。37 ℃下孵育2 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下讀取各孔反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Western blot：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后加入含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液300 μL，在冰上裂解15 min。按配方配制12 %或10%濃度的分離膠。靜置30 min后，配制4%濃縮膠。每個(gè)蛋白樣品上樣30 mg，60 V恒壓電泳。30 min后轉(zhuǎn)為120 V恒壓電泳，運(yùn)行至溴酚藍(lán)抵達(dá)玻璃板底端為止。電泳結(jié)束后，取出凝膠，冰浴中濕轉(zhuǎn)，60 V，120 min。待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于5%的牛奶中。搖床封閉1 h后，按比例加入一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜4次，每次8 min，加入二抗(1∶5000)，室溫下?lián)u床孵育1 h。TBST洗膜4次，每次8 min。應(yīng)用ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，各組所測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=所測(cè)蛋白的灰密度值/β-actin的灰密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 IGF-1對(duì)HD暴露BMSCs的凋亡抑制作用

各組BMSCs的凋亡檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，HD組BMSCs的TUNEL陽性細(xì)胞的比例顯著高于Control組(P<0.05)；經(jīng)不同濃度(50，75，100 ng/L)IGF-1干預(yù)后，TUNEL陽性細(xì)胞的比例顯著減少，且該作用具有劑量依賴性，表現(xiàn)為隨IGF-1劑量的增加，TUNEL陽性細(xì)胞下降的比例也隨之增加(P<0.05)；而IGF組與Control組間的TUNEL陽性細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

a:與Control組比較，P<0.05；b:與HD組比較，P<0.05；c:與50 IGF+HD組比較，P<0.05；d:與75 IGF+HD組比較，P<0.05圖1 各組BMSCs的凋亡檢測(cè)結(jié)果(×400)Fig 1 Apoptosis index of BMSCs in each group (×400)

2.2 IGF-1對(duì)HD暴露BMSCs中caspase-3活性的影響

各組BMSCs的caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，HD組BMSCs的caspase-3活性顯著高于Control組(P<0.05)；經(jīng)不同濃度(50，75，100 ng/L)IGF-1干預(yù)后，BMSCs的caspase-3活性呈現(xiàn)IGF-1劑量依賴性地降低(P<0.05)；而IGF組與Control組間的caspase-3活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3 IGF-1對(duì)HD暴露BMSCs中Akt蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響

各組BMSCs的Akt蛋白表達(dá)及磷酸化水平如圖3所示，HD組BMSCs的Akt蛋白磷酸化水平顯著低于Control組(P<0.05)；經(jīng)不同濃度(50，75，100 ng/L)IGF-1干預(yù)后，BMSCs的Akt蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)IGF-1劑量依賴性地增高(P<0.05)；而IGF組與Control組間的Akt蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。此外，各組之間的Akt蛋白表達(dá)水平也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

a:與Control組比較，P<0.05；b:與HD組比較，P<0.05；c:與50 IGF+HD組比較，P<0.05；d:與75 IGF+HD組比較，P<0.05圖2 各組BMSCs中caspase-3的活性檢測(cè)結(jié)果Fig 2 Caspase-3 activity of BMSCs in each group

a:與Control組比較，P<0.05；b:與HD組比較，P<0.05；c:與50 IGF+HD組比較，P<0.05；d:與75 IGF+HD組比較，P<0.05圖3 各組BMSCs的Akt蛋白表達(dá)及磷酸化水平Fig 3 Expression and phosphorylation of Akt in the BMSCs of each group

2.4 IGF-1對(duì)HD暴露BMSCs中Bad蛋白表達(dá)及磷酸化水平的影響

各組BMSCs的Bad蛋白表達(dá)及磷酸化水平如圖4所示，HD組BMSCs的Bad蛋白磷酸化水平顯著低于Control組(P<0.05)；經(jīng)不同濃度(50，75，100 ng/L)IGF-1干預(yù)后，BMSCs的Bad蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)IGF-1劑量依賴性地增高(P<0.05)；而IGF組與Control組間的Bad蛋白磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。此外，各組之間的Bad蛋白表達(dá)水平也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin growth factor, IGF)與胰島素高度同源，同屬于insulin/IGF家族，是一類結(jié)構(gòu)和功能類似于胰島素的多肽類物質(zhì)[21]，參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)。IGF-1是IGF家族中的一員，通過與IGF-1R結(jié)合，激活下游相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、功能的維持以及凋亡等發(fā)揮了重要的生物學(xué)調(diào)控作用[22]。Tsai等[23]報(bào)道，人來源IGF-1對(duì)tbx5缺陷斑馬魚胚胎具有潛在抗凋亡作用。研究顯示，IGF-1對(duì)β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡具有拮抗作用。在本研究中，HD組BMSCs細(xì)胞的凋亡率和caspase-3活性顯著高于Control組。然而添加IGF-1后，BMSCs細(xì)胞的凋亡率和caspase-3活性顯著低于HD組，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性降低[24]，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。這提示IGF-1對(duì)HD誘導(dǎo)的BMSCs凋亡具有明顯拮抗作用。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，該通路參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及自我更新等生理過程。研究顯示，PI3K/Akt是由IGF-1信號(hào)激活的主要通路[25]。Kim等[26]報(bào)道，1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)暴露可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，并抑制Akt磷酸化，添加IGF-1可拮抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并上調(diào)Akt磷酸化水平。然而，PI3K抑制劑可阻斷IGF-1的這些作用。Wang等[27]通過將人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞D407暴露于硝普鈉，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病細(xì)胞損傷模型，研究IGF-1對(duì)這種損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF-1以劑量依賴方式抑制硝普鈉對(duì)D407的凋亡誘導(dǎo)作用，而用阻斷劑干預(yù)PI3K/Akt通路后，IGF-1的保護(hù)作用被阻斷。高玉紅等[28]研究表明，添加50 μg/mL IGF-1的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)凋亡率顯著低于對(duì)照組。然而，加入PI3K抑制劑孵育細(xì)胞后，BMECs的凋亡率則顯著升高，提示IGF-1的保護(hù)作用受到明顯抑制。本研究也顯示，HD暴露BMSCs的Akt磷酸化水平顯著降低。然而添加IGF-1后，HD暴露BMSCs的Akt磷酸化水平得到顯著提升。這些結(jié)果提示，IGF-1可激活HD暴露BMSCs的PI3K/Akt信號(hào)通路。

Bad是Bcl-2家族成員之一，同時(shí)也是Akt下游凋亡相關(guān)通路中的關(guān)鍵分子。生理情況下，Bad以p-Bad形式與14-3-3蛋白結(jié)合，并游離于細(xì)胞漿中。當(dāng)Akt接受上游信號(hào)刺激，活化為具有生物活性的Akt(p-Akt)時(shí)，能促進(jìn)Bad磷酸化(p-Bad)，并抑制線粒體依賴性凋亡的發(fā)生。相反，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至p-Bad，會(huì)刺激p-Bad去磷酸化釋放出Bad，誘導(dǎo)線粒體依賴性凋亡。Yang等[29]研究顯示，IGF-1上調(diào)缺氧的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Bad磷酸化水平。在本研究中，通過添加IGF-1，可顯著改善HD暴露細(xì)胞的Bad磷酸化水平。這表明，Akt/Bad信號(hào)通路可能參與IGF-1對(duì)HD暴露BMSCs的抗凋亡調(diào)控。

總之，我們的研究結(jié)果顯示，IGF-1可抑制HD暴露BMSCs的凋亡，降低caspase-3活性，并上調(diào)Akt和Bad的磷酸化水平。提示IGF-1可通過Akt/Bad通路拮抗HD暴露BMSCs的凋亡。我們的發(fā)現(xiàn)，為篩選BMSCs移植保護(hù)劑提供了一定的理論依據(jù)。今后有必要通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明IGF-1在體內(nèi)對(duì)移植BMSCs的抗凋亡保護(hù)作用；并通過對(duì)主要通路蛋白進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明IGF-1激活I(lǐng)GF-1受體并介導(dǎo)Akt/Bad通路拮抗BMSCs凋亡的調(diào)控作用。