劉雪蓮，申培立，牛丹丹，金鵬，田康明，王正祥*

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津， 300457)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津， 300457)

地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase, BLA，EC 3.2.1.1)，是我國淀粉液化酶中最具代表性的高溫α-淀粉酶，可在高溫(105～107℃)下作用于淀粉乳，隨機切割淀粉分子內(nèi)部α-1,4糖苷鍵生成短鏈糊精、麥芽寡糖和少量葡萄糖，廣泛應(yīng)用于淀粉糖、酒精、味精、有機酸、醫(yī)藥、紡織和造紙等行業(yè)，是研究最早、最重要的工業(yè)酶制劑之一，占淀粉酶系市場份額的30%左右[1-3]。

在BLA的研究與開發(fā)進程中，我國學(xué)者前期重點研究了BLA的編碼基因特征、表達方式、酶學(xué)性質(zhì)的分子進化、高效表達與發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)的優(yōu)化等[4-6]，有力地推動了我國高溫α-淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的進步，特別是BLA的工業(yè)發(fā)酵水平得到顯著提升[7]。但是，淀粉液化生產(chǎn)實踐要求BLA能夠具有更好的耐熱性和在酸性條件下更高的活性，如淀粉噴射液化溫度能夠達到110℃以上，液化能夠在pH 5.0或更低的pH值下進行。圍繞這一生產(chǎn)實踐要求，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的有益研究。其中代表性的研究成果包括：(1)運用定點突變或易錯PCR技術(shù)，獲得BLA的耐酸、耐熱或比酶活提高的突變體[8]；(2)通過微生物分離與篩選，獲得耐酸、耐熱或比酶活提高的天然BLA分子[9]；(2)通過DNA體外隨機重排技術(shù)(DNA shuffling)或結(jié)構(gòu)域替換，優(yōu)化α-淀粉酶的應(yīng)用酶學(xué)屬性[10]。

本實驗室前期通過DNA體外隨機重排技術(shù)獲得以BLA為基礎(chǔ)的高溫α-淀粉酶突變體庫，在此基礎(chǔ)上，本研究從突變體庫中遴選出一耐熱和耐酸性能顯著改善的BLA突變體，并就其酶學(xué)性質(zhì)進行較全面的分析。研究結(jié)果將有助于后續(xù)高溫α-淀粉酶高產(chǎn)新菌種的構(gòu)建與工業(yè)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

表達BLA突變體的重組大腸桿菌，采用EscherichiacoliJM109為宿主細(xì)胞、pHY-WZX為表達質(zhì)粒[11]進行構(gòu)建，由本實驗室前期構(gòu)建與保藏。地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)CBBD302用于突變酶的制備，為本實驗室前期構(gòu)建與保藏[7]。

1.2 酶與試劑

高溫α-淀粉酶(40 000 U/mL)，由地衣芽胞桿菌生產(chǎn)，山東隆科特酶制劑公司；限制性內(nèi)切酶、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、BSA等，寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒，Omega Bio-tec；胰蛋白胨、酵母浸粉，英國OXOID公司；硫酸卡那霉素購自，生工生物工程有限公司，可溶性淀粉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

淀粉培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 5，可溶性淀粉10，加入2%的瓊脂為固體培養(yǎng)基。必要時，培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度50 μg/mL硫酸卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：乳糖20，棉子粉20，CaCl20.3，(NH4)2SO43，K2HPO420，KH2PO410；pH 7.2。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、酶切、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選等，均采用實驗室常規(guī)方法[12]，使用試劑盒時按照試劑盒說明書進行。地衣芽胞桿菌遺傳轉(zhuǎn)化與篩選，按照文獻[11]描述的方法進行。

1.5 酶液制備、純化與鑒定

挑取3～4個單菌落于50 mL液體培養(yǎng)基中，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)15～16 h至對數(shù)生長期，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)5 d，離心收集上清即為粗酶液。將粗酶液經(jīng)用飽和度為30%～50%(4 ℃)(NH4)2SO4分級沉淀，再經(jīng)凝膠層析柱Superdex-G75純化，通過酶活測定和SDS-PAGE方法分析純化情況，其中SDS-PAGE使用12%分離膠和5%濃縮膠。蛋白濃度測定采用Bradford法進行[13]。

1.6 酶活測定

高溫α-淀粉酶的酶活測定，按照GB/T 24401—2009方法進行。酶活單位(U)定義為：1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，于70 ℃、pH 6的條件下，1 min液化1 mg可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以U/g(或U/mL)表示[14]。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.7.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

在pH 6.0下，分別測定酶樣在50、60、70、80、90和100℃下的酶活，以最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活，確定最適反應(yīng)溫度。將酶樣分別在75、80、85和90 ℃下熱處理60 min，每隔10 min取樣，按上述酶活測定方法測定殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶樣酶活為100%，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.7.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

在最適反應(yīng)溫度下，用pH 4.0～8.0的緩沖液適當(dāng)稀釋酶液，測定對應(yīng)pH條件下的酶活，以最高酶活為100%，計算其他pH條件下的相對酶活，確定最適反應(yīng)pH。將酶樣加入不同pH(pH 4～8)緩沖液中室溫(25℃)放置1 h，然后按上述酶活測定方法測定殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶樣酶活為100%，確定其pH穩(wěn)定性。

1.7.3 金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對酶活的影響

配制不同金屬離子溶液(Na+、K+、Li+、Ni+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Al3+、Sr2+)和化學(xué)試劑(EDTA、SDS)，將酶液與金屬離子溶液和化學(xué)試劑等體積混合，使酶液中各金屬離子濃度為1、5 mmol/L；4 ℃放置過夜(16 h)后，按上述酶活測定方法測定樣本酶活，以添加等體積緩沖液的酶樣酶活為100%，確定不同金屬離子及化學(xué)試劑對酶活的影響。

1.8 酶動力學(xué)參數(shù)測定

分別以6、8、12、14、16、20 g/L的淀粉溶液為底物，按照GB/T 24401—2009方法，在最適反應(yīng)條件下測定酶活，采用雙倒數(shù)法作圖(Lineweaver-Burk法)并進行酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫α-淀粉酶V-2的制備與純化

對BLA為基礎(chǔ)的高溫α-淀粉酶突變庫進行篩選，獲得在高溫酸性條件下酶活較高的突變體V-2；進一步純化對應(yīng)菌株中的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌，獲得轉(zhuǎn)化子H-311(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。經(jīng)搖瓶發(fā)酵120 h，離心收集上清酶液，再經(jīng)(NH4)2SO4分級鹽析和凝膠過濾色譜進行純化，結(jié)果如圖1所示。純化后的突變體V-2的比酶活為1 630 U/mg，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)為單條蛋白條帶，分子質(zhì)量約為56 ku，達到后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析要求的純度。就比酶活而言，突變體V-2較BLA提高約0.6倍[7]。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；1-對照；2-粗酶液；3-純化后的V-2

2.2 高溫α-淀粉酶V-2的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適作用溫度

在pH 6.0的條件下，測定50～100℃高溫α-淀粉酶V-2的酶活，得到溫度對酶活力影響曲線，如圖2所示。突變體V-2的最適作用溫度為80℃，較BLA提高了10℃；當(dāng)反應(yīng)溫度由80℃上升到90℃時，BLA酶活力大幅降低，而在同樣條件下突變體V-2仍表現(xiàn)出近71%的最高酶活；在煮沸(100 ℃)條件下，突變體V-2仍具有30%以上的酶活力，而BLA僅存17%的酶活力?？梢姡噍^于BLA，突變體V-2可以在更高的溫度范圍內(nèi)有效水解淀粉分子。

圖2 溫度對突變體V-2酶活力的影響

2.2.2 最適作用pH

在最適溫度下測定在pH 4.0～8.0高溫α-淀粉酶V-2酶活，獲得了不同pH對酶活力的影響曲線(圖3)?？芍?，突變體V-2的最適作用pH為pH 5.5，較BLA的最適作用pH降低了0.5～1.0個pH值；突變體V-2在pH 6.5及以上的酶活則明顯低于BLA?？梢?，突變體V-2更適合在酸性條件下發(fā)揮淀粉液化作用。

圖3 pH對突變體V-2酶活力的影響

2.2.3 熱穩(wěn)定性

將酶液在不同溫度(75、80、85和90℃)下保溫60 min，定時取樣分析剩余酶活，獲得圖4所示的酶熱穩(wěn)定性曲線。突變體V-2在75和80℃條件下穩(wěn)定性良好，在85或90℃孵育1 h后仍分別保留80%和31%的酶活力；其熱穩(wěn)定性顯著優(yōu)于BLA(BLA在75、80和85℃下保溫1 h后，酶活分別保留89%、74%和26%；在90℃條件下處理30 min，酶活力幾近喪失)?？梢钥闯?，突變體V-2的熱穩(wěn)定性較BLA顯著提升。

圖4 突變體V-2的熱穩(wěn)定性

2.2.4 pH穩(wěn)定性

將酶液在不同pH緩沖液中室溫放置1 h后測其剩余酶活，結(jié)果如圖5所示。突變體V-2在所測試的pH緩沖液(pH 4.0～8.0)中，皆具有良好的穩(wěn)定性；在pH 4.0下的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于BLA(BLA在pH 4.0條件下放置1 h，酶活僅剩31%)。

圖5 突變體V-2的pH穩(wěn)定性

2.2.5 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響

將酶液與不同金屬離子或化學(xué)試劑等體積混合，使酶液中金屬離子濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，研究其對酶活的影響，結(jié)果如表1所示。與BLA不同，所測試的15種常見金屬離子和2種化學(xué)試劑對突變體V-2的酶活力皆無明顯促進作用。Cu2+、Fe2+、Fe3+和Al3+對突變體V-2有明顯的抑制作用，但在相同濃度下，其抑制作用低于對BLA的抑制作用。此外，EDTA顯著抑制BLA酶活，突變體V-2對EDTA的敏感性明顯低于BLA。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響

2.3 高溫α-淀粉酶V-2動力學(xué)特征

以不同質(zhì)量濃度(6～20 g/L)的可溶性淀粉為底物，在酶最適溫度和最適pH下測定突變體V-2酶活，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，酶活的倒數(shù)1/[V]為縱坐標(biāo)，求得突變體酶動力學(xué)相關(guān)特征參數(shù)(表2)。突變體V-2的Km值和Vmax值分別為34 mg/mL和151.5 mg/(mL·min)，與BLA差別不顯著，但其催化水解淀粉的效率顯著提升，較BLA提高了約33倍(表2)。

表2 突變體V-2的酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論

高溫α-淀粉酶是淀粉加工與轉(zhuǎn)化中不可或缺的核心淀粉酶制劑，其高效工業(yè)應(yīng)用價值除了通過高效表達獲得低成本制造的酶制劑外，進一步提升應(yīng)用屬性是決定其工業(yè)應(yīng)用價值的關(guān)鍵。本文從前期建立的以地衣芽胞桿菌α-淀粉酶為基礎(chǔ)的突變體庫中鑒定出的高溫α-淀粉酶突變體V-2，其最適作用溫度較BLA提高了10℃，最適作用pH降低了0.5～1.0個pH值，并且此突變體可以在更高的溫度和更低的pH下表現(xiàn)出更好的酶活力。這一研究結(jié)果可為后續(xù)此突變體的高效表達奠定堅實的理論基礎(chǔ)和材料支撐。