鄒咪，郭全友，湯嘉慧，謝晨，熊澤語，包海蓉,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(東海水產研究所，上海，200090)3(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海，201306)4(農業(yè)部水產品加工貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)隸屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬[1],富含不飽和脂肪酸，根據(jù)現(xiàn)代人們對食品高蛋白、低脂的需求，是適合人類攝取的動物性營養(yǎng)食品[2]，是重要的海洋經濟魚類之一，有中國海洋四大經濟魚類之稱[3]。正是由于其肉質鮮美、營養(yǎng)高導致了人們對大黃魚的過度捕撈，其野生資源迅速減少，幾近枯竭。到了20世紀80年代末，隨著育苗技術的突破，養(yǎng)殖大黃魚的成活率大大提高，人工養(yǎng)殖技術越來越成熟，出現(xiàn)了筏式網箱養(yǎng)殖和池池養(yǎng)殖等傳統(tǒng)模式，并出現(xiàn)了圍網養(yǎng)殖和深水網箱等新型養(yǎng)殖模式，主要分布于福建、廣東和浙江等地，大黃魚成為我國六大海產養(yǎng)殖品種之一[4-5]。大黃魚多通框網箱是筏式網箱的一種優(yōu)化，即將多個小網箱連起來形成的大網箱，但依然存在養(yǎng)殖密度大、水體交換不充分及大黃魚的肉質不緊致、魚肉含有較多的脂肪，導致魚肉的口感差等一些品質問題。隨著養(yǎng)殖技術的進一步的發(fā)展，出現(xiàn)了新型的養(yǎng)殖模式—深海圍網，這種養(yǎng)殖模式可使養(yǎng)殖空間變大，利于圍網內海水與外界海水充分交換，養(yǎng)殖的大黃魚其品質更加接近野生大黃魚[6]。

魚肉肌原纖維蛋白很大程度決定了其組織學品質，同時其形態(tài)特征也是肉質的組織學基礎，因此魚體肌肉的品質通常由魚肌原纖維特征來評定[7]。復雜流體的微觀結構反映在流體的流變性質中。在許多流變測量中，動態(tài)測試或小幅度振蕩剪切(SAOS)測試已被最廣泛使用，因為它對微結構敏感，易于使用，并具有良好的數(shù)學背景。大黃魚養(yǎng)殖方式和外界環(huán)境差異，其肌原纖維蛋白的組成也會有所不同，這就使得大黃魚的質地和流變學特性上形成一定的差異。為了研發(fā)符合消費者需求的產品，在微觀上應該清楚大黃魚蛋白的差異，為后期的處理和加工優(yōu)化提供支撐。本研究選用新鮮大黃魚提取其肌原纖維蛋白，通過測試其蛋白的溫度掃描、應變掃描、頻率掃描、表觀黏度和大振幅振蕩剪切的流變學方法探討不同的養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白質流變學特性的差異，通過流變學特性的分析方法，從微觀角度給予品質差異的解釋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通框養(yǎng)殖和圍網養(yǎng)殖的大黃魚分別購于福建寧德和浙江臺州養(yǎng)殖場，新鮮大黃魚捕撈后裝在鋪滿碎冰的泡沫箱中通過物流車快速送達實驗室，取其脊背肉，除去魚鱗、魚皮及魚骨；NaCl、KCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、順丁烯二酸(Maleicacid)、曲拉通(Triton-100)等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SG2pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LRH-100 CL型低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；D-130 電動勻漿機，維根技術(北京)有限公司；GL-20B高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；FPG12800微射流高壓均質機，英國SFP有效公司；UV1100型紫外分光光度計，廣州罡然機電設備有限公司；MCR301流變儀，奧地利安東帕儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照KATOH等[8]的方法。準確稱量5 g魚肉，加入40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16mol/L KCl，20% TritonX-100，pH7.5)，均質速率為12 000 r/min，每次10 s，停頓5 s，共均質2 min，均質后離心， 5 000 r/min，離心10 min。離心后，除去上清液，繼續(xù)添加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內含0.16mol/L KCl，pH 7.5)，均質，離心，完成后再重復操作一次。除去上清液后，加入20 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，均質，離心。棄去上清液，加入40 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，均質離心，用2層紗布過濾，離心后得到沉淀，即為純凈的肌原纖維蛋白樣品，碎冰冷藏。

1.3.2 肌原纖維蛋白溶液樣品的制備

將肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl溶液稀釋，通過微射流高壓均質機進行均質，得到均勻黏稠，無絮狀物體的溶液，用Biuret法[9]測定溶液的蛋白濃度，將2種養(yǎng)殖模式下的魚肉樣品濃度用0.6 mol/L KCl溶液調整至5 mg/mL。

1.4 肌原纖維蛋白溶液的流變特性測定

1.4.1 溫度掃描

本測試探頭型號為DG26.7，將準備好的兩種肌原纖維蛋白溶液(濃度5 mg/mL)樣品，吸取5 mL加入到圓筒間隙中。固定應變?yōu)?%，角頻率1 rad/s，按1 ℃/min的升溫速率從20℃ 升溫到80 ℃，獲得試樣的彈性模量(G′)。

1.4.2 應變掃描

探頭選用DG26.7，應變掃描在20℃下測試，角頻率為1 rad/s，應變0.01%～100%，測其彈性模量。

1.4.3 頻率掃描

探頭選用DG26.7。在溫度20 ℃，固定應變1%，頻率范圍0.1～10 Hz進行測試，獲得試樣的彈性模量。

1.4.4 表觀黏度測試

探頭選用DG26.7，在溫度為20 ℃，剪切速率從0.1 s-1升到100 s-1,獲其黏度值。

1.4.5 大振幅振蕩剪切測定

探頭型號為DG26.7，溫度20 ℃，角頻率0.1 rad/s，應變1%～1 000%，獲其彈性模量，對其曲線上取點分析，做出Lissajous曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0，SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 溫度掃描測試

肌原纖維蛋白在流變學的溫度掃描測試過程中，隨著溫度的提高可較好顯示出形成凝膠的物理變化[10]。按照一般規(guī)律來說，肌原纖維蛋白的G′(彈性模量)在整個加熱過程中可以分成3個階段：低于34℃為凝膠的準備階段(gel setting)；溫度為30～40 ℃，會出現(xiàn)凝膠的弱化階段(gel weakening)；溫度在40～80℃為凝膠的強化階段(gel strengthening)[11]，XIONG等研究雞胸肉肌球蛋白的流變學特性上得到相似的結論[12]。在中間過程中，凝膠的G′值降低可能是由于升溫將肌球蛋白尾部的螺旋結構解開，使得蛋白的流動性增強,對蛋白的網絡結構產生一定的破壞[13]。隨著溫度的進一步升高，凝膠逐漸增強主要是因為蛋白在凝聚過程中相互交錯的數(shù)量越來越多。因此蛋白在加熱凝聚過程中變性的程度越高, 最后形成的凝膠就有越大的強度。

A-表示溫度20～60℃；B-表示溫度20～80℃

如圖1所示，常規(guī)的曲線趨勢并未在通框養(yǎng)殖和圍網養(yǎng)殖的大黃魚樣品曲線圖中顯現(xiàn)，2種養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白G′沒有下降，只是增大的速率減緩。而其中深海圍網養(yǎng)殖的大黃魚樣品G′上升速率較大，并且G′比通框養(yǎng)殖的樣品G′偏高，到了后期的凝膠強化階段，該樣品的G′比通框養(yǎng)殖的大黃魚肌原纖維蛋白G′顯著增加。由此可見，深海圍網養(yǎng)殖的大黃魚其肌原纖維蛋白組織結構更緊密，其凝膠強度更強。

2.2 動態(tài)應變掃描測試

動態(tài)應變實驗能較好地顯現(xiàn)肌原纖維蛋白結構上的變化。動態(tài)應變施加的應力保持足夠小，產生的應變與應力呈線性比例，因此，對未知樣品的任何動態(tài)測試必須以應力幅度掃描開始，確定了在線性黏彈區(qū)(英文全稱LVER)內安全地保持特定樣品測試的幅度后，可以使用頻率掃描進行進一步的測試，以測量樣品的黏彈性行為[14]。如圖2所示，通框養(yǎng)殖大黃魚樣品G′值開始時幾乎無變動，隨著應變的繼續(xù)增大，呈現(xiàn)下降的趨勢。深海圍網養(yǎng)殖的大黃魚樣品其G′值開始時沒有顯著增大，之后也呈現(xiàn)下降的趨勢。可能是由于隨著應變的加大，蛋白的緊密網狀結構遭到了破壞及重排，導致了G′的下降。而當應變大于2%，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品G′值高于通框養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品。

圖2 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白動態(tài)應變掃描測試

2.3 頻率掃描測試

如圖3所示，2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的G′與頻率的關系。由圖3可見，2種樣品的G′隨著頻率的升高而增大。研究顯示G′在頻率掃描過程中表現(xiàn)為恒定不變的為典型凝膠，反之，隨著頻率的變化而變化則是典型的溶膠[15]。2種養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品試樣沒有表現(xiàn)出純凝膠的頻率特性，說明顯現(xiàn)出了溶膠的特性。頻率在0.1～3 Hz，深海圍網的大黃魚樣品其G′較通框模式下的樣品G′數(shù)值偏高，而在3～10 Hz，兩者的G′如表1可見總體上沒有顯著差異，數(shù)值接近。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白頻率掃描測試

表1 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白在頻率4、6、8、10Hz時的G′比較

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.4 表觀黏度測試

樣品在20 ℃條件下黏度值隨剪切速率的變化如圖4所示。隨著剪切速率的增加，2種養(yǎng)殖模式下大黃魚樣品的黏度值都是降低的，并且當剪切速率大于20 s-1時，曲線近似為直線。這一事實揭示了樣品溶液為非牛頓假塑性流體。剪切速率增強，溶液變稀是由于蛋白大分子鏈局部取向，此外觸變效應及分子鏈出現(xiàn)斷裂也會引起假塑性現(xiàn)象[16]。2種養(yǎng)殖模式下大黃魚樣品顯現(xiàn)出了相同的現(xiàn)象，而圍網養(yǎng)殖的大黃魚樣品黏度值比通框模式下的大黃魚樣品黏度值偏高，表明其肌原纖維蛋白黏度更大，蛋白網絡結構更致密。

圖4 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白黏度測試

2.5 大振幅振蕩剪切

研究大黃魚肌原纖維蛋白的流變特性還可以使用大幅振蕩剪切(LAOS)。為了更充分地表達非線性黏彈區(qū)的流變學信息，通過應力對應變分析獲得Lissajous曲線描述非線性黏彈性并進行定量分析。當應變位于線性黏彈區(qū)間內，振蕩剪切應變數(shù)值較小時，聚合物常表現(xiàn)出線性黏彈特性，隨著應變振幅的增加，在臨界應變振幅下其應變數(shù)值保持不變，一旦振蕩剪切應變超出線性黏彈區(qū)域后，聚合物表現(xiàn)出非線性流變行為，呈現(xiàn)出多重諧波。低于臨界應變振幅的區(qū)域被定義為線性區(qū)域，高于臨界應變振幅以上的區(qū)域被定義為非線性區(qū)域[17]。在復雜流體的微觀結構研究中，非線性流變學能夠提供豐富的附加信息，LAOS可用于定量描述這種復雜流體。EWOLDT等[18]提出了一個新的框架來描述大幅度振蕩剪切試驗中的復雜非線性反應。在此框架中，區(qū)域剪應力與應變在Lissajous曲線中的圍成的區(qū)域表示耗散的能量，而在剪應力與應變率的關系曲線中則與儲能有關，可以通過Lissajous曲線所示的圖形來描述樣品在線性和非線性黏彈區(qū)域內的流變學信息，并且進行定量分析。若曲線呈現(xiàn)橢圓形則表明在線性黏彈區(qū)，若偏離橢圓的形狀則是在非線性黏彈區(qū)[19]。在此實驗中，曲線所圍的面積則表示在該應力點剪切一周所消耗的能量[20]。劉琴等[7]在研究NaCl濃度對金槍魚肌原纖維蛋白影響時做出的Lissajous曲線符合這一規(guī)律。而在實際生產中，LAOS所對應的是操作流程中對產品所施加的大幅度的擠壓碰撞，借此來研究對產品造成的影響。

圖5是2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白試樣在大幅振蕩剪切下的流變圖及其Lissajous圖。在應變從0%增加到1 000%過程中，2種樣品皆表現(xiàn)出先保持不變后下降的趨勢，在應變小于25%時，深海圍網養(yǎng)殖下的大黃魚樣品G′高于通框養(yǎng)殖下的大黃魚樣品，從Lissajous圖中同樣能看出在應變?yōu)?%時，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品的Lissajous曲線呈現(xiàn)橢圓形，說明在線性黏彈區(qū)，并且曲線所包圍的面積更大，所消耗的能量更多，說明具備更緊密的網絡結構。而應變達到300 %時，曲線均偏離了橢圓形，說明蛋白體系表現(xiàn)為非線性黏彈性。以上分析得出深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白其網絡結構更加緊密，在大應變下不易被破壞。

A-大振幅震蕩剪切圖；B-Lissajous曲線(4%應變)；C-Lissajous曲線(300%應變)

3 結論

本研究主要通過動態(tài)剪切的方法，探討了2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的流變學特性的差異。結果表明，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚由于養(yǎng)殖空間大，水體交換充足等優(yōu)勢，其肌原纖維蛋白網絡結構更致密，從溫度掃描中可明顯看出，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白樣品試樣G′值高于通框養(yǎng)殖模式下的大黃魚試樣，尤其在凝膠增強階段尤為明顯。在動態(tài)應變掃描、頻率掃描和黏度測試中，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白的G′仍然比通框養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的G′。在LAOS測試中，深海圍網養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白試樣完成正弦應變一周期所消耗的能量更大，其網絡結構更緊密。