周陽(yáng)子，邊名鴻，劉文藝，蔣佳靜，許文靜

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢， 643000)

醬香型白酒生產(chǎn)歷史悠久，是我國(guó)的著名白酒，香氣幽雅、細(xì)膩、酒體醇厚豐滿、回味悠長(zhǎng)[1]。高溫制曲是醬香型白酒特殊工藝之一，制曲溫度最高達(dá)65 ℃，高溫環(huán)境下形成了特殊的微生物區(qū)系，產(chǎn)生多種熱穩(wěn)定性好的酶類(lèi)，這些酶不僅有利于原料的利用，對(duì)醬香型白酒的風(fēng)格和質(zhì)量也起著決定性作用[2]。

淀粉酶是一類(lèi)能夠催化α-D-吡喃葡糖基之間 1-4 糖苷鍵水解的酶類(lèi)，使淀粉絕大部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖從而提高淀粉利用率，是衡量大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)[3-5]。醬香型白酒產(chǎn)酒率低，其主要原因是高溫大曲中微生物所產(chǎn)生的淀粉酶活力不高、糖化發(fā)酵不徹底所致[6]。因此，高溫大曲中淀粉酶活力高的土著菌株的篩選及應(yīng)用具有較大的研究?jī)r(jià)值。目前對(duì)于高溫大曲中淀粉酶產(chǎn)生菌的研究主要集中于細(xì)菌、霉菌，對(duì)產(chǎn)淀粉酶酵母研究較少，然而大曲中酵母對(duì)于淀粉分解也有一定的貢獻(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)之前的高溫大曲中存在大量的酵母，這些酵母不僅有產(chǎn)酒產(chǎn)香的能力，有的還具有較強(qiáng)的淀粉分解能力[7]。在白酒固態(tài)發(fā)酵中后期，隨著氧氣耗盡，霉菌迅速死亡，這類(lèi)產(chǎn)淀粉酶的酵母對(duì)于中后期的雙邊發(fā)酵就凸顯其優(yōu)勢(shì)。

本研究對(duì)醬香高溫大曲中的1株產(chǎn)淀粉酶酵母進(jìn)行了分離鑒定，并研究該菌株在不同溫度、pH值、酒精條件下的生長(zhǎng)情況，對(duì)比分析了該菌利用不同原料的發(fā)酵產(chǎn)物，以期對(duì)該菌在白酒釀造中的應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

曲樣,取自赤水河畔的名優(yōu)酒廠。大米、小麥、麩皮,均為市售。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂20，pH自然。

篩選培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏10、蛋白胨20、可溶性淀粉20、瓊脂20，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母膏2、蛋白胨8、可溶性淀粉12、 MgSO4·H2O 0.5、K2HPO41、pH 7.0。

液態(tài)培養(yǎng)基：分別加入200 g小麥、大米、麩皮粉碎后加水800 mL，調(diào)節(jié)pH 5.5～6.0，加入2 000個(gè)單位的酶，煮沸10 min，過(guò)程中注意適當(dāng)補(bǔ)水。待冷卻后，加入堿性蛋白酶100 000個(gè)單位，55 ℃水浴保溫30 min，結(jié)束后取上清液，使用前加葡萄糖至終質(zhì)量濃度為10 g/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種篩選

稱取曲樣10 g，加入生理鹽水90 mL，搖床振蕩30 min制備成菌懸液。逐次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，分別取0.2 mL分別均勻涂布于篩選分離培養(yǎng)基中， 28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d。觀察菌落周?chē)霈F(xiàn)的透明圈大小，挑選透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌落進(jìn)行純化，觀察菌落形態(tài)和顯微形態(tài)。

1.3.2 菌株的鑒定

通過(guò)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)鑒定[8-9]。采用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取該酵母基因組DNA，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′)參照WHITE[12]的方法擴(kuò)增 ITS 區(qū)基因。將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將最終測(cè)序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并對(duì)近似序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。

1.3.3 菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

將純化好的酵母菌株制成菌懸液(菌液OD600=0.266)，按接種量4%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每隔2 h取樣，離心收集上清液測(cè)定酶活力，同時(shí)收集菌體、測(cè)定菌體干重，繪制生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)淀粉酶曲線。

1.3.4 耐受特性分析

以O(shè)D600為指標(biāo)，在原有細(xì)菌液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察溫度(31、34、37、40、43、46、49 ℃)，pH值(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5)，酒精體積分?jǐn)?shù)(10%、12%、14%、16%、18%、20%)，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%、12%、14%、16%、18%、20%)、葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)5個(gè)因素對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)情況的影響，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.3.5 分析方法

淀粉酶的測(cè)定方法：比色法[13]；總酸測(cè)定方法[14]：酸堿滴定法；總酯測(cè)定方法[15]：指示劑法；揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱取樣品2 g，裝入5 mL頂空樣品瓶中，加入質(zhì)量濃度為200 mg/L 的乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)50 μL。SPME 條件：溫度設(shè)為70 ℃，平衡時(shí)間為15 min，萃取時(shí)間為50 min。GC-MS 進(jìn)樣口解吸4 min，GC-MS 分析條件參考吉彩婷[16]的方法。將檢測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，確定揮發(fā)性風(fēng)味成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶酵母篩選

將樣品稀釋涂布于淀粉培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，篩選出1株酵母有較大的透明圈，命名為酵母JM，其菌落直徑與透明圈直徑及其比值見(jiàn)表1，透明圈、菌落、顯微形態(tài)圖見(jiàn)圖1。淀粉水解圈較大，菌落為乳白色，圓形，表面干燥，不易挑起。放大10倍的菌落圖可以觀察到菌落表面為絨毛狀。

圖1 透明圈、顯微形態(tài)及菌落(右一為放大10倍菌落形態(tài))

表1 菌落直徑與透明圈直徑及其比值

2.2 菌種鑒定

采用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果如圖2所示。菌株JM與2株扣囊復(fù)膜酵母聚在一起，且相似度為100%。結(jié)合顯微形態(tài)，初步將該菌株歸屬于扣囊復(fù)膜酵母屬。

圖2 產(chǎn)淀粉酶酵母JM的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

2.3 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)淀粉酶曲線

酵母JM生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況如圖3所示，該菌株在12 h之前生長(zhǎng)較快，12 h后菌體濃度趨于穩(wěn)定。該菌株在4 h前，菌體處于遲滯期，酶活較低，10 h后進(jìn)入快速產(chǎn)酶期，12 h左右酶活最高達(dá)1 452 U/mL。由圖3可以看出產(chǎn)酶和菌體生長(zhǎng)偶聯(lián)。

圖3 酵母JM的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線

2.4 耐受性研究

2.4.1 溫度耐受性

發(fā)酵溫度升高有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，但是高溫可導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞、酶失活，代謝活動(dòng)減弱[17]。因此確定菌株對(duì)溫度的耐受能力很有必要。由圖4可知，該菌在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好，比一般酵母最適生長(zhǎng)溫度高，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃后，菌株生長(zhǎng)受到一定抑制，說(shuō)明其耐溫性良好。在糖化及發(fā)酵過(guò)程中升溫幅度較大，耐溫性好的微生物更有利于酒類(lèi)釀造。

圖4 不同溫度對(duì)酵母JM生長(zhǎng)的影響

2.4.2 pH值耐受性

pH能改變微生物細(xì)胞中的電解質(zhì)，從而對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝造成一定影響[18]。由于發(fā)酵環(huán)境為酸性環(huán)境，發(fā)酵產(chǎn)酸快，pH較低，因此對(duì)釀酒微生物耐酸性要求較高。由圖5可知，pH 4.0是酵母JM最適生長(zhǎng)pH值，隨著pH值下降，菌體生長(zhǎng)逐漸受到抑制， 在pH 2.0的強(qiáng)酸性環(huán)境中仍能生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸能力。

圖5 不同pH值對(duì)酵母JM生長(zhǎng)的影響

2.4.3 高糖耐受性

糖不僅是發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的主要基質(zhì)，也是酵母賴以生存的能源物質(zhì)。但是高濃度的糖對(duì)酵母生長(zhǎng)有抑制作用，高滲透壓會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失。由圖6可知，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%時(shí)菌體干重最大，當(dāng)含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，菌株仍繼續(xù)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的耐高糖特性。

圖6 不同糖度對(duì)酵母JM生長(zhǎng)的影響

2.4.4 滲透壓耐受性

由圖7中可知，酵母JM對(duì)于滲透壓表現(xiàn)出較高的耐受性，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%中生長(zhǎng)菌絲干重最大，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)依然正常生長(zhǎng)。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%時(shí)酵母JM生長(zhǎng)受到抑制，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)酵母JM仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。

圖7 不同鹽濃度對(duì)酵母JM生長(zhǎng)的影響

2.4.5 酒精耐受性

酒精是大曲中酵母菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)物，霉菌和酵母在高濃度酒精環(huán)境中都受到一定的抑制，酒精對(duì)細(xì)胞的抑制作用很復(fù)雜，主要表現(xiàn)在抑制酵母的增殖速度、存活性和發(fā)酵力3個(gè)方面[19-22]。因此在白酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌酒精的耐受能力對(duì)出酒率有較大影響。由圖8可知，酵母JM的生長(zhǎng)隨著酒精含量(體積分?jǐn)?shù))的增加而減弱，在含量(體積分?jǐn)?shù))酒精為20%時(shí)仍然能夠生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了良好的酒精耐受性。

圖8 不同酒精濃度對(duì)酵母JM生長(zhǎng)的影響

2.5 液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)

2.5.1 不同原料液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物理化指標(biāo)分析

利用該酵母分別在大米、麩皮、小麥3種不同培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，如圖9所示，小麥培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的酒精、總酸、總酯含量分別為9.3%(體積分?jǐn)?shù))、3.4 g/L、2.2 g/L，均高于麩皮培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基。

圖9 不同原料液態(tài)發(fā)酵發(fā)酵理化分析

2.5.2 不同原料液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分分析

由表2所示，酵母JM在小麥、麩皮、大米發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)生的香味成分差別較大，分別鑒定出38、15、29種揮發(fā)性成分。檢出種類(lèi)最多的是酯類(lèi)化合物，這類(lèi)化合物是飲料酒中重要的呈香呈味物質(zhì)。大米發(fā)酵液中相對(duì)含量最高的是帶有愉快果香的乙酸丁酯；小麥發(fā)酵液中辛酸乙酯、乙酸丁酯相對(duì)含量都較高，這類(lèi)物質(zhì)呈舒適的水果果香；麩皮培養(yǎng)基中含量最高的是具有椰子樣香氣的十一酸乙酯，感官嗅聞也呈類(lèi)似結(jié)果。酵母JM在3種培養(yǎng)基中均檢出較高含量具有清甜的玫瑰樣花香的苯乙醇，在大米培養(yǎng)基中相對(duì)含量最高。在小麥培養(yǎng)基中除乙醇和苯乙醇外其他醇類(lèi)物質(zhì)含量均為少量。大米培養(yǎng)基除乙醇外，還含6種醇類(lèi)其中含量較高的是3-丁炔-1-醇、環(huán)丁醇、異戊醇、苯乙醇。除此之外，在麩皮培養(yǎng)基中檢出較高含量具有玫瑰、柑橘等香氣的壬醛，小麥培養(yǎng)基中也檢測(cè)出含量較少的醛酮類(lèi)物質(zhì)，分別是壬醛、椰子醛、甲基壬基甲酮，濃度低時(shí)呈類(lèi)似柑橘、杏仁的香味[23-25]。

表2 不同原料液態(tài)發(fā)酵的風(fēng)味物質(zhì) 單位：%(相對(duì)含量)

續(xù)表2

分類(lèi)物質(zhì)名稱物揮發(fā)性風(fēng)味成分小麥麩皮大米壬醛0.0417.63醛酮類(lèi)椰子醛0.07甲基壬基甲酮0.031,2,3,4-四氫萘0.071,3-二甲氧基苯1.1715-冠醚-50.0818-冠醚-60.05其他物質(zhì)2,4-二叔丁基苯酚0.120.114-乙基愈創(chuàng)木酚0.151.80苯酚0.68蝶呤-6-羧酸3.32氯苯0.561.20茚滿0.080.06

3 結(jié)論

采用淀粉平板透明光圈法從高溫大曲中篩選得到1株產(chǎn)淀粉酶菌株JM，結(jié)合顯微形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定為扣囊復(fù)膜酵母。通過(guò)產(chǎn)淀粉酶能力、耐受性、液體發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酵母JM具有較好的產(chǎn)淀粉酶能力及產(chǎn)香能力，且對(duì)于溫度、pH、酒精度的耐受性好，初步說(shuō)明該菌株在酒類(lèi)釀造方面具有很好的應(yīng)用潛質(zhì)，后續(xù)研究可圍繞該菌株的綜合性能及與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵等方面展開(kāi)。